专利名称：：含有单克隆抗独特型抗ca-125抗体和铝的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肠胃外给药的用作疫苗的药物组合物。
背景技术：
：己知，为了增强预防或治疗疫苗的免疫原性，佐剂(例如铝化合物)被广泛使用在肠胃外给药的溶液或悬浮剂型药物制剂的制备中(Fiejka等，RoczPanstwZaklHig1993，73-80)。这些配方的目标是引起最大化以及长效免疫效果。然而，根据欧洲药典，现在已注册和市售的疫苗中铝佐剂的上限为1.25mg/剂。同样，美国食品药品管理局(FDA)的法典21CFR610.15中声明生物产品每个制剂中铝的推荐量不超过(1)通过化验测定则为0.85毫克；或者(2)通过添加到铝化合物的量计算确定则为1.14毫克；(3)通过假设数据显示所用铝量安全且对于产生预期效果为必须的化验测定则为1.25毫克。吸附在铝佐剂上的抗体的免疫原性显示出依赖于其吸附度(Capelle等,Vaccine2005,1686-1694)，但是还不清楚可以达到最大免疫原性响应并保持药物安全性的最佳比例。例如，世界卫生组织(WHO)推荐用于破伤风类毒素和白喉类毒素的铝佐剂的类毒素吸附水平超过80%(Gupta等，Vaccine1995，1263-1276;WHOTechnicalReportSeriesNo.595,1996,p.6)。与之相对照，数据显示氢氧化铝吸附破伤风组合物超过80%没有增加健康成人的免疫响应(Paoletti等，InfectImmun2001，6696-6701)。使得含有单克隆抗体的疫苗达到最大免疫原性(没有不可接受的毒副作用的风险)的铝化合物最适宜含量仍然是一个开放的技术问题。另一个被广泛关注的技术问题是疫苗稳定性。通过在升高的温度下的耐贮性分级，白喉和破伤风类毒素以及乙肝疫苗显示出最高热稳定性，冻干麻疹、黄热病和卡介菌(BCG)疫苗处于中间水平，口服急性脊髓灰质炎疫苗处于最月危弱的4立置(Galazka等,Thermostabilityofvaccines,WorldHealthOrganisation,1998)。用于麻疹、黄热病和肺结核(BCG)的重组疫苗是不稳定的疫苗；在免疫季节它们应该在重组后尽快使用并保存在冰浴中。尽管破伤风和白喉(例如吸附在铝盐上)作为单价疫苗或联合疫苗的组成部分，在35-37'C可以数星期保持稳定，但每次暴露于室温下都会导致疫苗的一些降解(Galazka等，videsupra,pag48)。因此为保持稳定这些疫苗被规定在低温下贮存(RoteListe，EditionCantorVerlag,2005)。这类含有单克隆抗体的疫苗的未解技术问题是其室温下低稳定性。由于复合蛋白有效成分的特性，这些药品必须在低温下贮存(2-8。C)而这需要恒定的冷却链。这导致高销售成本，危及药物安全性，可能更重要的是限制非常重要的药物(例如抗癌疫苗)的全球性使用。因此发展疫苗制剂使其可以在室温或更高温度下(25'C-37'C)保持品质恒定会提高这些药物的整体安全性和有效性。这不仅对患者十分有益而且会导致处理这些疫苗的整体便捷性。另一方面，在人类肿瘤治疗的免疫治疗的重要性，特别是使用单克隆抗独特型抗体疫苗治疗肿瘤，是周知的。这些疫苗应激活宿主免疫系统刺激体液和细胞活动以对抗肿瘤。这种制剂的发展和清晰化对于ACA125/MEN2234(描述在EP700305中)特别重要，其作为一种非常有前景的抗独特型单克隆抗体，被用作卵巢癌疫苗。下列CA索引名被分配给MEN2234:免疫球蛋白Gl、抗-(鼠骨钙素125(OC125))(鼠单克隆ACA-125克隆3D5g-链)、二硫化鼠单克隆ACA-125克隆3D5k-链、二聚物。相应的美国化学文摘(CAS)登记号为792921-10-9。被建议的国际非专利药物名称(INN)是阿巴伏单抗(Abagovomab)。MEN2234的氨基酸序列在下面示出。MEN2234是鼠科单克隆抗体用于鼠单克隆抗体OC125，其被认为是肿瘤相关抗原(TAA)CA125。MEN2234有效模拟CA125TAA三维结构从而诱导宿主产生抗-抗独特型抗体(Ab3)，其标靶表达CA125抗原的肿瘤细胞。MEN2234也可以引起宿主细胞免疫响应特别是直接对抗CA125肿瘤细胞的响应。大约80%晚期卵巢癌患者有CA125表达升高。尽管在卵巢癌中CA125过表达，人体组织自身不能产生有效免疫响应以对抗这些癌细胞。使用含MEN2234的疫苗治疗可以唤起宿主的免疫系统并破坏扩散的卵巢癌细胞。EP700305描述单克隆抗独特型抗-CA125抗体，但没有描述适于病理治疗的特定药物制剂。在文献《杂交瘤》(Hybridoma1995，14(2),164-174)中抗体ACA-125被表征，但没有开发制剂。在文献《临床癌症研究》(ClinicalCancerResearch,2004,10,1580-1587)中，患者接种了ACA125疫苗；没有指出配方中铝含量，但是本领域技术人员基于现有技术可以很容易设想出铝佐剂的相对低含量(低于1.25mg/剂)。在文献《杂交瘤》(Hybridoma，2005，133-140)中描述一种输送系统以便于连续内源性释放ACA125hFc(—种ACA125嵌合形式)以改善其作为卵巢癌疫苗的免疫原性，但其是基于生物封装技术制备于体外。其它文献总结了包含MEN2234的卵巢癌临床前期和临床研究，但没有具体的数据涉及配方或没有提到佐剂浓度(例如没有提到铝化合物)ClinicalCancerResearch,2004,1580-1587;ClinicalCancerResearch,2003,3234-3240;ClinicalCancerResearch,2001,1154-1162;ClinicalCancerResearch,2001,1112-1115。具体实施方案本发明要求一种用于肠胃外给药(优选为皮下或肌肉内)的含有吸附在铝化合物上并悬浮在水性缓冲系统中的单克隆抗独特型抗体MEN2234的药物制剂，其中铝化合物选自氢氧化铝(alum)或磷酸铝。使用高含量(其的含量高于通常认定的和被推荐的)铝化合物作为佐剂使得疫苗具有意想不到的临床和药学优势，例如L确保对于体液和细胞响应的极高特异性免疫原性II.确保长效诱导并维持免疫响应III.确保给药安全；IV.简化制备以及最终药品释放程序；V.增加制备过程中的一致性VI.改善药品在相应温度范围内的稳定性。基于本发明的药物组合物含有抗独特型抗体MEN2234，其含量为0.1mg/ml-4mg/ml，优选为0.2mg/ml-2.5mg/ml，更优选大约为2mg/ml(1.9-2.1mg/ml)。抗体MEN2234是吸附在铝化合物上(优选浓度为大约3.5mg/ml的铝)并悬浮在缓冲的等渗压生理盐水中。本组合物除了吸附在铝化合物上的抗体以及缓冲盐以外没有其它成分，使得溶液简单且没有其它使用例如稳定剂、抗氧化剂、其它佐剂等试剂所衍生的安全性问题。优选的缓冲液是通过磷酸盐或柠檬酸盐得到的。最终优选含有lml产品的组合物被肠胃外给药，优选通过皮下或肌肉注射。本发明一个主要特征是相对高浓度的铝化合物(选自磷酸铝和氢氧化铝)被用来确保MEN2234被近乎完全吸附在吸附剂上，氢氧化铝是最优选的(参见表1)。组合物中优选A1+++浓度为2.4-5.2mg/ml，更优选为大约3.5mg/ml(即3.1-3.8mg/ml)。相应的氢氧化铝含量为0.7-1.5%W/W，优选大约为1%W/W(0.9-1.1%)表1:MEN2234吸附(未吸附蛋白)与铝浓度依赖性(氢氧化铝)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>1%氢氧化铝对应着八1+++大约3.5mg/ml，因而高于目前已注册使用和市售的疫苗以及有关当局推荐的含量。该制剂可以基于本领域己知标准程序制备。一个常用的程序可以如下。最终产品的制备可以通过在限定的条件下混合抗体溶液和佐剂(铝化合物凝胶)而得。药品满足基于欧洲药典专论"肠胃外药物制备"的无菌要求。因而，基于常规要求，制造工艺严格在无菌条件下进行。在制造过程中所有成分均为无菌级或0.22微米过滤器过滤的溶液。基于本发明的制剂的优点/.殇疾^^沐i,潘應喊应游欲/^錄弄丝免资嚴丝我们已经证明每月一次的(每四星期皮下给药)本发明组合物治疗可以诱导特异性体液响应(直接对抗MEN2234的特异性抗体)依赖于铝化合物的浓度。事实上这显示为由含1%氢氧化铝(例l)的制剂引发的体液响应的量明显高于含有0.36%氢氧化铝(基于欧洲药典和FDA指导方针的限制)的悬浮液所引发的响应或者缓冲生理盐水中MEN2234溶液引发的响应表2:经过每四周皮下给药的兔血浆中抗MEN2234抗体血浆滴度制剂抗体滴度(ng/ml)MEN2234溶液907±_259MEN2234悬浮液，Al(OH)30.36%3658±1473MEN2234悬浮液，Al(OH)31.0%15627±5007*与其它两个条件相比*PO.O(邦费罗尼(Bonferroni)多元比较法)另外在注射位置进行组织学评估以测量建立特异性细胞免疫响应必须的炎性细胞和抗原提呈细胞的增补。对于这个参数，含1%氢氧化铝(例1)的制剂的响应明显高于低含量Al(OH)3(0.36%)的响应或无Al(OH)3的MEN2234溶液的响应表3:在每周用疫苗处理的兔的注射位置的炎性细胞的半定量测定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>//.殇保/《欺诱导#/#/#免^^^应在兔中我们己经证实经过使用例1组合物的疫苗(每四星期注射)，免疫响应可维持很长一段时间，甚至几星期后还能在血浆中检测到特异性抗体。另一方面，只是在短段时间内可测得使用含低量A1(OH)3(0.36%)的MEN2234悬浮液或无佐剂MEN2234溶液疫苗后得到的抗体。///線疾绘秀安全本发明的MEN2234悬浮液在26星期内以2mg/ml给药(皮下注射)于兔。给药方式是第一个月每周给药，剩余期限内双周给药。局部耐受性和系统安全性被检测。15个治疗以后没有发现毒性反应，依据是体重、临床症状、食物消耗、血液学、临床化学、所有器官组织病理学。在注射位置只观测到药物作用导致的炎症反应和免疫反应。此外本发明可以减少游离鼠抗体的量，减少其中体循环中的吸附和峰值进而减少过敏反应的风险。/F微縱以J影多鄉微辦大约1%氢氧化铝确保完全绑定MEN2234(<1%的未吸附抗体)。这是非常稳健的吸附和制造过程无需如同其它含铝疫苗(例如破伤风，白喉)那样进行体内释放测试(实验动物的免疫响应)。完全吸附确保宿主免疫系统中最佳抗体(Ab2)表现。详细调査MEN2234-氢氧化铝吸附机理显示出在磷酸盐缓冲液中在所有基质上近乎理想的化学计量分布。如前述，由于其自行组装特性，确保本发明的简单和稳健的制备过程。15秒适度混合后抗体近乎完全吸附到氢氧化铝(表4)。表4:MEN2234吸附与混合时间的依赖性(氢氧化铝浓度1%)混合时间分:秒未吸附的蛋白％j01000:100.200:300.201:000.155:000.2015:000.03240:000.10参见表l，佐剂浓度小于0.75%不会实现完全吸附，浓度高于1%(例如2%)也没有任何改善。以高于推荐的吸附剂浓度非常快速完全地将MEN2234吸附到铝化合物上使得明显简化药物组合物的制备。通过混合单克隆抗体和佐剂，只需几秒钟就可以得到最终制剂。混合步骤可依常规使用制药厂无菌工艺所用标准设备进行。所述系统的自行组装特性在制备和稳定本发明制剂以及通常的吸附的单克隆抗体或疫苗方面引出一个全新观点。在几秒钟内MEN2234完全吸附到铝佐剂上也使得可以在皮下或肌肉注射前在向患者使用的地方(例如医院)只需混合所需剂量的药物和铝佐剂即可制备最终悬浮液。因此本发明的一个特别方面表现在其形式上，疫苗的活性物质(抗体MEN2234)和佐剂(铝化合物，优选氢氧化铝)是分开保存并且准备好临注射给患者前混合。优选的进行混合的时间是在向患者给药前10秒到10分钟之间。对于这个特别形式，组合物应该是抗体和佐剂溶液彼此分隔但填注在药学标准容器系统内，例如小瓶、安瓿、预填充注射器或适宜的两舱系统以用于混合和/或重组。单克隆抗体不仅可以是已缓冲的溶液形式，也可以说粉末形式。使用固体药物的可能性使得可将所有改善单克隆抗体或疫苗的技术都可以使用(冻干、喷雾干燥等)。这表现出对于所有吸附型疫苗(特别是那10些含有单克隆抗体(例如MEN2234))在操作上的明显进步以及在稳定性上的改善。吸附型疫苗的主要缺点例如在出货和贮存时的恒久冷链被避免了，并且药物的货架寿命延长了。如所述，含有药学组合物的单克隆抗体的体内免疫原性活性依赖于抗体在所用吸附剂上的吸附度(Capelle等.,Vaccine2005，1686-1694)。因此现有技术要在药品释放前确定生物(吸附型)疫苗在动物体内免疫原性活性。MEN2234可再生吸附到铝佐剂上明显简化了释放程序。由于吸附的可靠性，释放测试可以只依靠体外测试来确定组合物的效价。常规的动物体内生物活性确定程序对于本发明是多余的。f:改夢翁蕃过澄^游一發丝使用高于推荐浓度的例如氢氧化铝吸附MEN2234的可再现性明显改善药物制备中的一致性。如表5所示，如果制剂中氢氧化铝浓度为0.7-2%w/v，MEN2234的吸附对于所有制备批次都是完全的(<1%游离抗体)。表5:制备过程中MEN2234吸附(未吸附的抗体)在氢氧化铝上的可变性氢氧化铝浓度[%]未吸附的抗体[批次I%批次II0函1000.2578360.3659110.53060.75<1.0<1.01.0<0.1<0.12.0<0.1<0.1完全且可再生的吸附可避免加工过程中出现可怕的复杂情况，例如形成抗体团。溶液中抗体对于形成聚团是敏感的。溶液中抗体聚团可由液相中过多的剪切力引发，例如在搅拌过程中。这些聚集团不能再溶解并使得疫苗的11生物活性明显降低。然而对于本发明的组合物，由于完全且快速吸附过程，这个现象可以完全避免。W.改夢秀^在裙应蕴度范房/^游德定丝令人惊讶的，与缓冲的MEN2234溶液相比例1组合物更加稳定(甚至在25°C-37°C)。这个简单但非常有效的方法(氢氧化铝浓度增加到推荐剂量的2-3倍)确保近乎完全的绑定同时也稳定。表6中稳定性数据是关于MEN2234溶液和基于例1的制剂。表6:MEN2234溶液以及吸附在氢氧化铝上的稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>因此，本发明确保给药到人体后在机体温度(36-37。C)所需的抗体稳定性和活性。例子本发明非限制性实例如下例1:注射用悬浮液成分mg/mlMEN22342.00Al(OH)3*10.00KC10.20KH2P040.20NaCl8.00Na2HP04x7H202.16注射用水添加到1.00ml*常用于吸附的水合氢氧化铝如前述，组合物的制备基于标准程序，简单混合MEN2234和水合氢氧化铝悬浮液，溶液由相应盐缓冲。例2:注射用悬浮液mg/ml2.007.500.200.20謹2.16添加到1.00ml成分MEN2234Al(OH)3*KC1KH2P04NaClNa2HP04x7H20注射用水*常用于吸附的水合氢氧化铝制备如例1例3:注射用悬浮液成分MEN2234A1P04KH2P04NaClNa2HP04x7H20注射用水制备如例1例4:测定MEN2234(阿巴伏单抗)氨基酸序列序列号1mg/ml2.0010.000.209.001.20添加到1.00ml歪链序列QVQXQQSGAETQKFKGKATXKTTPPSVYPXYTXSSSVTVPPKPKDVXTXTXARPGASVKXTADKSSSTAYAPGSAAQTNSSSTWPSETVTXTPKVTCVVVSCKASGYTFTMQXSSXASEDMVTXGCXVKGCNVMPASSTDXSKDDPEVGNYWMQWVKQRSAVYYCARGEYFPEPVTVTWKVDKKXVPRDFSWFVDDVEVPGQGXDWXGAGNYAWFAYWGNSGSXSSGVHCGCKPCXCTVHTAQTQPREEXYPGDGNTRY60QGTXVTVSAA120TFPAVXQSDX180PEVSSVFXFP240GFNSTFRSVS300EXPXMHQDWXNGKEFKCRVNSAAFPAPXEKTXSKTKGRPKAPQVYTXPPPKEQMAKDKVS360XTCMXTDFFPEDXTVEWQWNGQPAENYKNTQPXMDTDGSYFVYSKXNVQKS丽EAGNTFT400CSVXHEGX丽HHTEKSXSHSPGK序列号2轻链序列DIQMTQSPASLSASVGETVTXTCRASENXYSYXAWHQQKQGKSPQXXVYNAKTXAGGVSS60RFSGSGSGTHFSXKXKSXQPEDFGXYYCQHHYGXFPTFGGGTKXEXKRADAAPTVSXFPP120SSEQXTSGGASVVCFX丽FYPKDXNVKWKXDGSERQNGVXNSWTDQDSKDSTYSMSSTXT180XTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPXVKSFNRNEC阿巴伏单抗所测定的氨基酸序列第一部分是使用基于埃德玛(Edman)降解法定自动测序技术，在蛋白质序列仪中阿巴伏单抗被共价连接到测序膜上(轻链头15个氨基酸)。由于自动埃德玛测序不能生成任何重链序列数据，建议将重链的N-末端基团改性为焦谷氨酸，得到延展的序列，已知液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)测序技术被用于质谱分析(例如Proc.NatlAcadSciUSA,1986SepS印，83(17)，6233-6237)。简要的，在进行LC/MS/MS分析前不同抗体样本由不同的水解蛋白酶切成片段，产生一系列重叠的序列片段。找到这些片段的重叠情况可以确定抗体的总轻链序列(重链和轻链的完整氨基酸序列显示在SEQ.IDNO.1和SEQ.IDNO.2)。最后检测试验结果的可靠性，所报告的序列也由使用BLAST软件包对蛋白质分析优化的非冗余蛋白质数据进行序列相似性分析而证实(MSDB,2007年3月从欧洲生物信息研究所FTP网站下载)。由于质谱分析中不能区分异亮氨酸和亮氨，图1中这点表现为"X"。1权利要求1.用于肠胃外给药疫苗的药物组合物包括一个单克隆和浓度为2.4-5.2mg/ml铝离子的铝衍生物佐剂，其中单克隆抗体是包括序列号1、2的单克隆抗独特型抗CA-125MEN2234。2.如权利要求1所述的药物组合物，其中铝衍生物的浓度为3.1-3.8mg/ml铝离子。3.如权利要求l-2所述的药物组合物，其中铝化合物选自氢氧化铝和磷酸铝。4.如权利要求3所述的药物组合物，其中铝化合物是氢氧化铝。5.如权利要求l-4所述的药物组合物，其中MEN2234的含量为0.1-4mg/ml。6.如权利要求5所述的药物组合物，其中MEN2234的含量为0.2-2.5mg/ml。7.如权利要求6所述的药物组合物，其中MEN2234的含量为1.9-2.1mg/ml。8.如权利要求1-7所述的药物组合物，其中MEN2234是被吸附到铝化合物上并悬浮在缓冲的等渗压生理盐水中。9.如权利要求1-8所述的药物组合物，其为适于肠胃外给药的悬浮液形式。10.如权利要求9所述的药物组合物，其适于皮下或肌肉给药。11.如权利要求1-10所述的药物组合物，其中MEN2234和铝化合物悬浮液是分开保存且准备好在临向患者给药前混合。12.制备如权利要求11所述组合物的方法，其中MEN2234和铝化合物的混合是在向患者给药前10秒-10分钟前进行的。13.如权利要求12所述方法制得的药物组合物。14.如权利要求l-10所述的药物组合物，选自a)MEN22342.00mg/ml、Al(OH)310.00mg/ml、KC10.20mg/ml、KH2P040.20mg/ml、NaCl8.00mg/ml、NasHPO,7H202.16mg/ml、注射用水添加到1.00mlb)MEN22342.00mg/ml、Al(OH)37.50mg/ml、KC10.20mg/ml、KH2P040.20mg/ml、NaCl8.00mg/ml,Na2HP047H202.16mg/ml、注射用水添加到1.00mlc)MEN22342.00mg/ml、A1P0410.00mg/ml、KH2P040.20mg/ml、NaCl9.00mg/ml、Na2HP04x7H201.20mg/ml、注射用水添加到1.00ml。15.如权利要求1-14所述药物组合物被用作抗癌疫苗以治疗或预防肿瘤。16.如权利要求15所述药物组合物作为抗癌疫苗用于治疗卵巢癌。17.选自氢氧化铝和磷酸铝的铝化合物在制备如权利要求1所述药物组合物中的用途，其中铝化合物的浓度为2.4-5.2mg/ml铝离子。全文摘要本发明涉及肠胃外给药的用作疫苗的药物组合物，其包括单克隆抗体以及铝衍生物佐剂。文档编号A61K39/39GK101478987SQ200780024020公开日2009年7月8日申请日期2007年6月28日优先权日2006年6月29日发明者卡斯登·乔基,斯特法诺·马兹尼,简斯·弗莱明,莱茵哈特·史密茨申请人:马纳里尼国际运转卢森堡股份公司