专利名称：鱼病多联抗独特型单克隆抗体疫苗制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域近年随着我国海水养殖渔业的迅猛发展，鱼病特别是细菌性引起的鱼病每年均造成养殖海鱼大量死亡，已严重影响了海水养殖鱼业的发展。对鱼病的预防，国内外迄今还停留在较经典的灭活疫苗阶段。国际上已有8项鱼类弧菌灭活疫苗及其制备方法获得日本、美国专利。我国中科院南海海洋研究所1995年也成功制备了海鱼创伤弧菌灭活疫苗。此外未见其它海鱼病菌成功制备的报道。在医学上，疫苗的成功应用已有200多年的历史，随着医学科学技术的发展，疫苗的形成也不断更新，有减毒及灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗及新近发展起来的核酸疫苗。抗独特型抗体有和病原体的抗原决定簇相类似的结构，它是一种模拟抗原，能诱导自体或异体产生抵抗病原体的抗体，使机体得到部分或全部的保护作用。这一点已被大量的试验所证实。抗独特型抗体疫苗还有以下独特的优点1．它能模拟抗原，但不含有毒抗原的成分，无毒无害，使用安全可靠；2．抗独特型抗体不存在种系差别，使用时无须考虑种系问题。经国际互联网终端查新检索，迄今国内外均未见抗独特型抗体疫苗应用于养殖鱼的报道。
本发明的目的是利用生物技术，生产多种鱼病菌抗独特型单克隆抗体，筛选出β型抗独特型单克隆抗体，并且模拟病菌诱导机体产生抗病菌的抗体，使机体得到部分或全部保护作用。以上抗独特型单克隆抗体可制成鱼病抗独特型抗体疫苗，对养殖鱼起到很好的免疫保护作用，不污染环境，不会通过食物链对人类造成损害。
本发明的技术方案鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德弧菌菌株(均由青岛海洋大学提供)，进行扩增培养，再将培养后的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c小鼠，取免疫后小鼠脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合，将细胞融合的细胞悬液进行培养，用酶联免疫反应法(ELISA法)检测阳性克隆，将确定为阳性的孔以有限稀释法，进行克隆化，再将阳性克隆的杂交瘤细胞株扩增培养，腹腔注射接种到Ba／b／c小鼠制备出腹水型单抗，将以上腹水型单抗以ELISA法进行效价，亚类及交叉试验，挑选效价较高的单克隆抗体，对海鱼进行保护试验，挑选对海鱼有较高保护率的单抗进行纯化，以每只小鼠10～100μg的量，腹腔注射免疫小鼠。然后进行细胞融合，筛选出能稳定分泌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将细胞株扩增培养，调整为1×106／ml，以每只小鼠0．5ml量，腹腔注射接种到Ba／b／c小鼠，制备腹水型抗独特型单克隆抗体，采用ELISA法，对以上单抗进行亚类、效价及β型抗独特型单克隆抗体鉴定。结果显示，鳗弧菌抗独特型单抗中有4株单抗1D1、1E10、1H5、1H12，创伤弧菌抗独特型单抗中有2株单抗1C9、4A5，溶藻弧菌抗独特型单抗中有2株单抗2F4、1B2，迟缓爱德华菌抗独特型单抗中有2株单抗1E5、1E11，均能特异性地与抗原(病菌)竞争与ab1(腹水型单克隆抗体)结合。用这些单抗免疫小鼠，可从小鼠血液中检测到抗病菌的抗体，说明以上单抗为β型抗独特型单克隆抗体。用以上单抗与不完全弗氏佐剂(1∶1～1∶2)混和，腹腔注射免疫海鱼，对照组用生理盐水取代单抗。免疫一个月后，用致死量病菌腹腔注射感染海鱼，观察疫苗对海鱼的保护作用。结果显示，鳗弧菌抗独特型单抗中有三株单抗1E10、1D1、1H12对海鱼的保护率分别为88．7％、82．5％和81．2％；迟缓爱德华菌抗独特型单抗中有2株单抗1E11和1E5对海鱼的保护率分别为60％和20．8％；溶藻弧菌抗独特型单抗中有2株单抗1B2和2F4对海鱼的保护率分别为90％和50％。挑选出保护率较高的抗独特型单抗以一定比例配制成鱼病多联抗独特型单抗疫苗制剂。
具体实施例方式(一)材料1．菌种鳗弧菌、外伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌的标准菌株由青岛海洋大学生命学院提供。以上菌种用作免疫原产生单克隆抗体。
溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、霍利斯弧菌、拟态弧菌、少女弧菌、麦氏弧菌的标准菌株购自北京生物制品公司。肠毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、志贺氏菌属的福氏志贺氏菌、绝氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、宋氏志贺氏菌，购自中国药品生物制品鉴定所。以上菌种用作单克隆抗体交叉试验。
2．细胞胞SP2／0小鼠骨髓瘤细胞株，由第四军医大学细胞工程研究中心惠赠。
(二)实验方法1．免疫原细菌的制备及灭活鳗弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、迟缓爱德华氏菌以平板划线培养于细菌培养基上，37℃培养箱中过夜，无菌生理盐水洗脱菌苔，3000rpm离心20分钟，弃上清，加入1％的甲醛固定过夜。3000rpm离心20分钟，弃上清，加无菌生理盐水，比浊记数后，4℃冰箱保存，以备用作免疫原菌液。
2．Ba／b／c小鼠的免疫8周龄的Ba／b／c雌性小鼠10只，将以上灭活的细菌菌液(1×108个／ml)以0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第7、14、28天分别追加免疫，第31天取脾细胞进行细胞融合。
3．细胞融合(1)免疫脾细胞的制备①取免疫小鼠脾脏，放入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于200目的不锈钢铜网上。用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内不完全培养液轻轻冲洗钢网，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。
②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀，1000rpm离心5分钟，弃去上清。
③用不完全培养液将沉淀细胞再离心洗涤一次(重复步骤②)，将细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞记数板记数。
(2)SP2／0骨髓瘤细胞悬液的制备①将4瓶扩增培养的骨髓瘤细胞收集到50ml离心管内。
②1000rpm离心5分钟，弃去上清。
③再加入30ml不完全培养液，重复步骤②再离心洗涤一次，然后将细胞垂悬至10ml，混匀，记数。
(3)细胞融合①分别吸取含1×108个脾细胞和悬液和含2-3×107个骨髓瘤细胞的悬液，加入一支50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分混匀。
②1000rpm离心7分钟，弃去上清。
③加50％的融合剂PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。
⑤800rpm离心7分钟，弃去上清。
⑥加入20ml HAT培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其垂悬并混匀。
⑦将细胞悬液加入辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培养。
4．抗体检测--间接ELISA法(1)用已知抗原灭活菌液包被。
(2)加有克隆长生的孔中的培养上清100μl。
(3)加酶标单抗鼠IgG抗体100μl。
(4)加底物液100μl，室温避光显色10～20分钟。
(5)判定结果在酶联免疫检测仪492nm波长下测定OD值，空白对照调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔2．1倍，即为阳性克隆。
5．克隆化--有限稀释法将96孔板中待做克隆化的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后记数，然后采取有限稀释法进行逐级稀释，加到96孔板进行培养。观察克隆生长，记录单克隆孔，并及时进行阳性检测。将阳性单克隆的细胞转到24孔板培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞瓶中扩大培养。
6．杂交瘤细胞的冻存将成对数生长的杂交瘤细胞收集入离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清，加入1ml冻存液混匀，然后加到冻存管，在-70℃代温冰箱过夜后移入液氮罐长期保存。
7．腹水型单克隆抗体制备将培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10分钟，收集上清作亚型试验，加无血清培养液到沉淀的细胞中，调整细胞数为1×106个／ml。每只Ba／b／c小鼠注射0．5ml，接种杂交瘤细胞后7～14天，拉颈脱臼处死小鼠，吸取腹水，离心，收集上清，分装后-20℃冻存备用。
8．单克隆抗体的鉴定抗鳗弧菌单抗筛选到8株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株，分别命名为2H2、3B2、3D2、3A3、3C4、4A6、4E3和4E12。经亚类鉴定其中2H2、3D2、3B2和4E12为IgG3；4E3为IgG2a；3A3、3C4、4A6为IgG1。经效价测定，这些单抗效价为1×10-5～1×10-7。
抗创伤弧菌单抗筛选到12株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株，命名为1B12、3E9、3F11、3E3、2G8、3D5、1E11、3H4、2F1、1A1、2F6和1G1。经亚类鉴定，其中2F6为IgG3、1B12、3E3、3H4、1A1为IgG2a；2G8、3D5、2F1为IgG1。经效价测定，以上单抗的效价为1×10-5～1×10-7。
抗溶藻弧菌单抗筛选到8株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞中，命名为2E3、2E4、2G2、2G8、2D11、3A10、3B12和4C7。经亚类鉴定，其中2E3为IgG3，2G2、2D11、3A10为IgG2a；2E4、3B12为IgG2b；2G8、4C7为IgG1。经效价鉴定，以上单抗的效价为1×10-6～1×10-7。
抗迟缓爱德华菌单抗筛选到10株单抗杂交瘤细胞株，分别命名为1B4、4D3、4D5、3F7、5A11、5H5、6B1l、6E1、6E6和6H3。经亚类鉴定，其中1B4、3F7、5A11、5H5、6B11为IgG1，6El为IgG2b；4D3、4D5、6E6、6H3为IgG3。经效价测定，以上单抗的效价为1×10-6～1×10-7。
(三)抗独特型单抗(ab2)的制备1．动物免疫将以上单抗进行纯化，然后以腹腔注射免疫小鼠，第一次免疫500μl／只小鼠(100μg／抗体蛋白／只)。
在第一次免疫后的第2、4、6周及细胞融合前3天，分别以同样方法各追加免疫一次。
2．细胞融合(1)免疫脾细胞的制备①取免疫小鼠脾脏，放入盛有5ml不完全的培养液的平皿中，置于200目的不锈钢铜网上。用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内不完全培养液轻轻冲洗钢网，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。
②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀，1000rpm离心5分钟，弃去上清。
③用不完全培养液将沉淀细胞再离心洗涤一次(重复步骤②)，将细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞记数板记数。
(2)SP2／0骨髓瘤细胞悬液的制备①将4瓶扩增培养的骨髓瘤细胞收集到50ml离心管内。
②1000rpm离心5分钟，弃去上清。
③再加入30ml不完全培养液，重复步骤②再离心洗涤一次，然后将细胞垂悬至10ml，混匀，记数。
(3)细胞融合①分别吸取含1×108个脾细胞和悬液和含2-3×107个骨髓瘤细胞的悬液，加入一支50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分混匀。
②1000rpm离心7分钟，弃去上清。
③加50％的融合剂PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。
⑤800rpm离心7分钟，弃去上清。
⑥加入20ml HAT培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其垂悬并混匀。
⑦将细胞悬液加入辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培养。
3．抗独特型抗体检测--双抗夹心ELISA法(1)用纯化后的兔抗病菌抗体包被酶标板(2)加有克隆生长的孔中的培养上清100μl(3)加酶标单抗鼠IgG抗体100μl(4)加底物液100μl，室温避光显色10～20分钟(5)判定结果在酶联免疫检测仪492nm波长下测定OD值，空白对照调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔2．1倍，即为阳性克隆。
4．克隆化将96孔板中待做克隆化的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后记数，然后采取有限稀释法进行逐级稀释，加到96孔板进行培养。观察克隆生长，记录单克隆孔，并及时进行阳性检测。将阳性单克隆的细胞转到24孔板培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞瓶中扩大培养。
5．杂交瘤细胞的冻存将成对数生长的杂交瘤细胞收集入离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清，加入1ml冻存液混匀，然后加到冻存管，是-70℃代温冰箱过夜的移入液氮罐长期保存。
6．腹水型抗独特型单克隆抗体的制备将培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10分钟，收集上清作直型试验，加无血清培养液到沉淀的细胞中，调整细胞数为1×106个／ml。每只Balb／c小鼠注射0．5ml，接种杂交瘤细胞后7～14天，拉颈脱臼处死小鼠，吸取腹水，离心，收集上清，分装后-20℃冻存备用。
7．亚型及效价鉴定(1)鳗弧菌抗独特型单克隆抗体共筛选到7株阳性克隆，分别命名为1E10、1H12、2H12、1H5、1D1、2B12、2F12。经亚型鉴定1E10属于IgG3，2H12和1H12属于IgG2a，1H5、1D1、2B12、2F12均为IgG2b。经效价测定，以上抗独特单抗的效价范围为1×10-4～1×10-6。
(2)迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体共筛选到6株阳性克隆，分别命名为2C8、1E5、2F1、2B3、1E11、1B11。经亚类鉴定2C8、2F1和1B11为IgG2b；1E11、2B3、1E5为IgG3。经效价测定，以上抗独特型抗体的效价可达1×10-5～1×10-6。
(3)创伤弧菌抗独特型单抗共筛选到5株阳性克隆，分别命名为1C9、4A5、3A12、1C11、3B7。经亚类鉴定1C9、3A12为IgG2b，4A5为IgG2a、1C11、3B7为IgG3。经效价测定，以上抗体的效价为1×10-4～1×10-5。
(4)溶藻弧菌抗独特型单抗共筛选到5株阳性克隆，分别命名为1H2、2F4、1D10、1H5、1B2。经亚类鉴定，1H2为IgG2a，2F4为IgG2b，1D10和1B2为IgG3，1H5为IgG1。经效价测定，以上单抗的效价为1×10-4～1×10-5。
8．β型抗独特型抗体的鉴定(1)经竞争抑制测定显示，鳗弧菌抗独特型单克隆抗体1D1、1E10和1H12能有效抑制抗原与Ab1结合，抑制率达70％以上，而且抑制率随Ab2浓度的下降而降低，说明以上三株单抗与抗原识别相同的Ab1表位，能有效地与抗原竞争Ab1结合位点，说明它们是β型鳗弧菌抗独特型单克隆抗体。
(2)迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体1E5和1E11能较强地抑制抗原与Ab1的结合，抑制率达60％以上，而且抑制率随其浓度的降低而降低。说明该2株单抗与抗原识别相同的Ab1表位，有效地与抗原竞争Ab1的结合位点。说明它们是β型迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体。
9．以抗独特型单克隆抗体(ab2)为免疫原诱导产生抗病菌的抗体(ab3)(1)以腹水型ab2为免疫原免疫Ba／b／c小鼠，每次免疫量及追加免疫次数同ab2的制备。第四次免疫5天后，摘除小鼠眼球放血，收集抗血清(Ab3)。
(2)ab3的检测-间接ELISA法，1)用已知抗原灭活菌液包被。
2)加有克隆长生的孔中的培养上清100μ1。
3)加酶标单抗鼠IgG抗体100μl。
4)加底物液100μl，室温避光显色10～20分钟。
5)判定结果在酶联免疫检测仪492nm波长下测定OD值，空白对照调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔2．1倍，即为阳性克隆。
(3)由鳗弧菌抗独特型单克隆抗体1E10、1H5、1D1和2H12诱导产生的鼠血清中含有抗鳗弧菌的抗血(ab3)，OD值分别是对照组2倍以上，其效价为1∶100～1∶1000。
(4)由迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体1E5和1E11诱导产生的鼠血清中含有抗迟缓爱德华菌抗体。其效价为1∶10～1∶200。
10．抗独特型单克隆抗体疫苗对牙鲆的免疫保护作用(1)方法抗独特型单抗和弗氏不完全佐剂1∶1混和，腹腔注射免疫牙鲆海鱼，每尾注射0．05m1(含单抗10～20μg)，免疫一个月后，用致死量的病菌腹腔注射攻击牙鲆鱼，观察抗独特型单克隆抗体疫苗对牙鲆的保护作用。
保护率的计算公式免疫保护率=(实验组存活率-对照组存活率)／对照组死亡率×100％(2)结果①鳗弧菌抗独特型单抗1D1、1E10、1H12对牙鲆的保护率分别为82．5％、88．7％和81．2％。
②迟缓爱德华菌抗独特型单抗1E11和1E5对牙鲆的保护率分别60．2％和20．8％。
③溶藻弧菌抗独特单抗2F4、1B2对牙鲆的保护率分别为50．2％和90．0％。
④创伤弧菌抗独特型单抗Va1、Va2对牙鲆的保护率分别为31．6％和15．2％。
以上对海鱼保护率达60％以上的抗独特型单克隆抗体，可用作海鱼抗独特型单抗免疫制剂。
11．制备成品将鳗弧菌抗独特型单抗中的1E10，迟缓爱德华抗独特型单抗中的1E11，浣藻弧菌抗独特型单抗中的1B2单抗以1∶2∶1的比例混和，制成鱼病多联抗独特型单抗疫苗制剂。
本发明的优点本发明鱼病多联抗独特型单克隆抗体疫苗制剂对海鱼的保护率达到60％以上，抗独特型单抗疫苗除了对海鱼有很好的免疫保护外，它还具备以下独特的优点即不含有毒的抗原成分，不会对海鱼造成任何损害，另外抗独特型抗体不存在种系差别，使用时无须考虑种系问题，适用范围非常广，对海鱼养殖业的发展十分有益。
权利要求
1．鱼病多联抗独特型单克隆抗体疫苗制剂，其特征是将将鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌进行扩增培养，再将培养后的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c，取免疫后小鼠脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合，将细胞融合的细胞悬液进行培养，用酶联免疫反应法(ELISA法)检测阳性克隆，将确定为阳性的孔以有限稀释法，进行克隆化，再将阳性克隆的杂交瘤细胞株扩增培养，腹腔注射接种到Ba／b／c小鼠制备出腹水型单抗；将以上腹水型单抗以ELISA法进行效价，亚类及交叉试验，挑选效价较高的单克隆抗体，对海鱼进行保护试验，挑选对海鱼有较高保护率的单抗进行纯化，以每只小鼠10～100μg的量，腹腔注射免疫小鼠；然后进行细胞融合，筛选出能稳定分泌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将细胞扩增培养，调整为1×106／ml，以每只小鼠0．5ml量，腹腔注射接种到Ba／b／c小鼠，制备腹水型抗独特型单克隆抗体，采用ELISA法，对以上单抗进行亚类、效价及β型抗独特型单克隆抗体鉴定；用以上单抗与不完全弗氏佐剂(1∶1～1∶2)混和，腹腔注射免疫海鱼，再挑选出对海鱼有较高保护率的抗独特型单抗以一定比例配制成鱼病多联抗独特型单抗疫苗制剂。
全文摘要
鱼病多联抗独特型单克隆抗体疫苗制剂,涉及生物技术领域。本发明将鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌免疫小鼠,进行细胞融合,再克隆化,制备出特异性很强,且效价较高的单抗,进行纯化,再免疫小鼠,制备抗独特型单抗,挑选出保护率较高的抗独特型单抗以一定比例配制成鱼病多联抗独特型单抗疫苗制剂。对养殖鱼起很好的免疫保护作用,不污染环境,不会通过食物链对人类造成损害。
文档编号A61P43/00GK1293066SQ0011392
公开日2001年5月2日 申请日期2000年9月20日 优先权日2000年9月20日
发明者黄威权, 夏永娟, 李元, 李别虎, 金晓航, 张荣庆 申请人:中国人民解放军第四军医大学