一种同时测定烟碱中11种次要生物碱杂质含量的方法与流程

本发明属于理化分析技术领域，具体涉及一种同时测定烟碱中11种次要生物碱杂质含量的方法。

背景技术：

烟碱，俗名尼古丁，化学名称是1-甲基(2-吡啶基)吡咯烷，分子式为c10h14n2，分子量为162.23。烟碱具有广泛的生物活性和药用价值，在除草剂、杀虫剂、植物生长调节剂、药物及药物中间体的研发中起到重要的作用，是戒烟产品——烟碱替代疗法（nrp）的主要生理活性成分，并在电子烟等新型烟草制品中有大量的应用。烟碱作为药物及消费品用途时，人们对其品质（如纯度等）具有一定的要求，如美国电子烟烟油生产标准协会建议电子烟所使用烟碱应符合美国药品级（usp级）烟碱的要求，即要求烟碱中单个杂质的含量不超过0.5%，总杂质含量不超过1.0%。现有市售烟碱主要来源于烟草提取，其品质及纯度也参差不齐。因为次要生物碱和烟碱结构有一定的类似性，在烟碱提取过程中往往难以去除，此外，烟碱也会在提取、存储等过程中发生分解而生成次要生物碱，所以，市售烟碱中往往含有一定浓度的次要生物碱杂质，而这些次要生物碱杂质是影响烟碱品质（如纯度等）的主要因素之一。所以，有必要对烟碱中的次要生物碱含量进行分析测定。但是，现有测定次要生物碱的研究还存在两个不足：一是研究生物碱的基质主要是烟草和烟草制品，二是目标次要生物碱的数量比较少，主要是降烟碱、麦斯明、新烟草碱、假木贼碱等，而对其他次要生物碱的研究较少。

技术实现要素：

本发明的目的正是基于上述技术不足，建立了一种同时测定烟碱中11种次要生物碱杂质含量的方法。本方法不需要复杂的前处理过程，可同时测定烟碱中的11种次要生物碱杂质含量，具有操作简便、通量高、灵敏度高、回收率及重复性好等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种同时测定烟碱中11种次要生物碱杂质含量的方法，所述11种次要生物碱分别为：n-甲基假木贼碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、β-二烯烟碱、新烟草碱、2,3’-联吡啶、β-二烯降烟碱、可替宁、哈尔碱、烟台林；使用二氯甲烷作为萃取溶剂进行萃取，以气相色谱-质谱联用法进行测定，内标法定量；具体包括以下步骤：

1）标准工作溶液的制备

制备具有12级浓度梯度的次要生物碱标准工作溶液，其中，降烟碱的定量采用降烟碱-2,4,5,6-d4作为内标，其它次要生物碱的定量采用2,2’-联吡啶-d8作为内标；

2）样品前处理

准确称取20mg烟碱于15ml塑料离心管中，再分别加入50μl内标溶液和10.0ml二氯甲烷，加盖密封后置于涡旋振荡器中，以2000rpm的速度涡旋振荡提取20min后，取萃取液转移到色谱分析瓶中进行gc-ms分析；

3）气相色谱-质谱分析

利用气相色谱仪配备质谱检测器对所制待测样品溶液和标准工作溶液进行分析，得到相关色谱图；

4）标准曲线绘制及结果计算。

本发明更具体的说包括以下内容：

1标准溶液的配制

1.1内标溶液的配制

分别准确称取约100.0mg降烟碱-2,4,5,6-d4和100.0mg2,2’-联吡啶-d8于50ml棕色容量瓶中，以甲醇定容，即得内标储备液。降烟碱-2,4,5,6-d4作为降烟碱内标，而2,2’-联吡啶-d8作为其他10种次要生物碱内标。将内标储备液以甲醇稀释5倍，即得到内标溶液。

1.2一级标准储备液的配制

分别准确称取约20.0mg次要生物碱，置于10ml的棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度。该溶液应在4℃～8℃条件下避光保存。

1.3二级标准储备液的配制

准确移取约0.1ml一级11种次要生物碱标准储备液，置于10ml的棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度。该溶液应在4℃～8℃条件下避光保存。

1.4标准工作溶液的配制

分别准确移取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl的二级11种次要生物碱标准储备液及10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl的一级11种次要生物碱标准储备液于不同的10ml棕色容量瓶中，再分别准确加入50μl内标溶液，用二氯甲烷稀释定容至刻度，即得到12个不同浓度的系列标准溶液。

仪器分析条件

所述方法的仪器分析条件为：

色谱柱：db-35ms毛细管色谱柱，固定相：（35%-苯基）-甲基聚硅氧烷，规格：30m×0.25mm×0.25μm。

进样口温度：250℃；进样量：1μl；载气：氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0ml/min。

次要生物碱柱升温程序：不分流进样；溶剂延迟：12min；升温程序：初始温度80℃，保持1min，以8℃/min的速率至250℃，保持1min，再以40℃/min的速率至280℃，保持5min。运行总时间为29min。

电离方式：电子轰击源（ei）；电离能量：70ev；传输线温度：280℃；离子源温度：250℃；扫描离子范围：80～250amu；质谱扫描方式：选择离子监视方式（sim）扫描，目标物及内标的保留时间、定量及定性选择离子参数如表1所示。

样品前处理

准确称取约20mg烟碱于15ml塑料离心管中，再分别加入50μl内标溶液和10.0ml二氯甲烷，加盖密封后置于涡旋振荡器中，以2000rpm的速度涡旋振荡提取20min后，取萃取液转移到色谱分析瓶中进行gc-ms分析。

加标回收率和精密度

分别按照低、中、高3种水平加入11种烟草次要生物碱标准品，每个添加水平重复测定5次，实验结果见表2。由表可知，11种烟草生物碱的加标回收率在96.80%~103.70%之间，精密度不高于2.24%。

线性范围和检出限

本研究采用内标法进行定量，以各目标化合物的浓度为横坐标，分析物与内标物的峰面积比为纵坐标建立标准曲线。在优化条件下，考虑到烟碱中目标化合物的浓度范围，确定了方法的线性范围，并按照目标物信噪比为3时对应的浓度作为检出限，如表3所示。由表可知，标准曲线的相关系数不低于0.997，方法检出限在0.0056~0.12μg/g。

总之，建立了一种同时测定烟碱中11种次要生物碱杂质的gc-ms高通量检测方法。本方法经过一次样品前处理过程即可同时测定烟碱中的11种生物碱含量，包括n-甲基假木贼碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、β-二烯烟碱、新烟草碱、2,3’-联吡啶、β-二烯降烟碱、可替宁、哈尔碱、烟台林等，方法检出限在0.0056~0.12μg/g，加标回收率在96.80%~103.70%之间，精密度不高于2.24%，具有操作简便、灵敏度高、通量高、回收率及重复性好等优点，能为烟碱产品纯度测定、质量安全控制等领域提供技术支持和科学依据。

附图说明

图1为11种次要生物碱标准工作溶液选择离子流图；

图中：1：n-甲基假木贼碱；2：降烟碱及降烟碱-2,4,5,6-d4；3：麦斯明；4：2,2’-联吡啶-d8；5：假木贼碱；6：β-二烯烟碱；7：新烟草碱；8：2,3’-联吡啶；9：β-二烯降烟碱；10：可替宁；11：哈尔碱；12：烟台林。

图2为11种生物碱及其结构式。

具体实施方式

本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。

实施例1：

1、仪器及试剂

仪器：气相色谱-质谱联用仪（美国agilent7890b-5977a型）；ae163电子天平（感量：0.0001g，瑞士mettler公司）；talboys数显型多管式旋涡混合器。

试剂耗材：降烟碱由alfa购得，其他10种次要生物碱均由trc购得，降烟碱-2,4,5,6-d4（cdnisotopes），2,2’-联吡啶-d8（cdnisotopes），甲醇（duksan，色谱纯），二氯甲烷（duksan，色谱纯）。

2、样品前处理

准确称取约20mg烟碱于15ml塑料离心管中，再分别加入50μl内标溶液和10.0ml二氯甲烷，加盖密封后置于涡旋振荡器中，以2000rpm的速度涡旋振荡提取20min后，取萃取液转移到色谱分析瓶中进行gc-ms分析。

3、仪器分析条件

所述方法的仪器分析条件为：

色谱柱：db-35ms毛细管色谱柱，固定相：（35%-苯基）-甲基聚硅氧烷，规格：30m×0.25mm×0.25μm；

进样口温度：250℃；进样量：1μl；载气：氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0ml/min；

次要生物碱柱升温程序：不分流进样；溶剂延迟：12min；升温程序：初始温度80℃，保持1min，以8℃/min的速率至250℃，保持1min，再以40℃/min的速率至280℃，保持5min，运行总时间为29min；

电离方式：电子轰击源（ei）；电离能量：70ev；传输线温度：280℃；离子源温度：250℃；扫描离子范围：80～250amu；质谱扫描方式：选择离子监视方式（sim）扫描，目标物及内标的保留时间、定量及定性选择离子参数如表1所示。

根据上述测定方法，选择5种烟碱样品，测得11种生物碱含量如下表所示（单位：μg/g）：