一种测定龙葵中总生物碱含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药质量控制领域，设及一种龙葵中总生物碱的含量测定方法。
【背景技术】
[0002] 龙葵为茄科植物龙葵Solanumnigrum的干燥地上部分，性寒，味苦，微甘，有小毒， 归肺、胃二经，有清热解毒、消肿散结、消炎利尿的功效。龙葵的药理活性成分主要为生物碱 类，包括龙葵碱、澳洲茄边碱、澳洲茄碱、澳洲茄明碱、茄微碱等。少数文献报道了龙葵药材 及制剂的含量测定方法，均W澳洲茄碱、澳洲茄边碱为对照品，采用高效液相色谱法或与质 谱联用进行测定。该方法对单体化合物的含量测定灵敏准确，但用于总生物碱含量测定时 操作技术要求高，较为繁琐，仪器维持和使用费用较高，试剂成本耗费较大，同时HPLC测定 含量时流动相的选择、加入的憐酸溶液等对峰形、保留时间等仍有一定影响。不同地区不同 部位的龙葵药材中澳洲茄碱、澳洲茄边碱含量差异较大，现代药理研究显示龙葵多种酱体 生物碱在体内外均具有较好的抗肿瘤活性，因此W龙葵总生物碱的含量作为药材检测指标 更合理。本实验通过酸性染料比色法W紫外分光光度计测定龙葵中总生物碱含量的方法， 操作简便，成本低廉，精密度好、回收率高，重现性好，可作为龙葵药材质量评价的指标，W 克服现有技术的不足。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种龙葵总生物碱含量检测方 法，操作简便，成本低廉，精密度好、回收率高，重现性好，可作为龙葵药材质量评价的指标。
[0004] 1、一种测定龙葵中总生物碱含量的方法，其特征在于包括W下步骤： 阳0化](1)对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的龙葵碱对照品5.OOmg，用氯仿溶 解，超声20min，转移至50血容量瓶，加氯仿稀释至刻度，摇匀即得0.Img/mL的对照品储备 液；
[0006] (2)标准曲线的制作：精密吸取对照品储备液于5ml量瓶中用氯仿稀释配成梯度 的标准溶液，精密吸取2ml标准溶液置于分液漏斗中，加入酸性缓冲溶液及漠甲酪绿染料 溶液进行显色，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上清液按照紫外分光光度法，于 243nm处测定吸光度；W氯仿W相同试剂及步骤处理做空白对照；W龙葵碱含量为横坐标， W其吸光度值为纵坐标，得龙葵总生物碱含量测定标准曲线；
[0007] (3)供试品溶液的制备：精密称取已过14目筛的龙葵药材粉末2.Og，置于锥形瓶， 加入体积比为1 : 4的2mol/L盐酸和90%乙醇混合溶剂30血，于40°C下超声提取35min， 提取液减压回收乙醇至无醇味的浸膏，浸膏用10%盐酸溶解，超声20min助溶，抽滤去除沉 淀，用10%盐酸定容至10血，用10%化0H调节抑至10-11，加氯仿萃取3次，收集氯仿液， 定容至25ml，即得供试品溶液；
[000引 （4)样品溶液的含量测定：精密吸取供试品溶液2.OmL，按照步骤似中所述，加入 酸性缓冲溶液及漠甲酪绿染料溶液进行显色，再加入氯仿萃取，分取氯仿层脱水处理，取上 清液按照紫外分光光度法，于243nm处测定吸光度，代入标准曲线，计算得到龙葵总生物碱 的含量。
[0009] 进一步地，步骤（2)和（4)中酸性缓冲溶液为抑=3. 6的醋酸-醋酸钢缓冲溶液， 加入量为3. 5ml。
[0010] 步骤似和（4)中漠甲酪绿染料溶液，加入量为2ml。
[0011] 步骤（2)和（4)中氯仿萃取及脱水处理要求为，用10ml氯仿分=次萃取，分别是 4血、3血、3血，密塞剧烈振摇5min后，静置30min，取氯仿层用干燥定量滤纸过滤，加入干燥 具塞并已加入0. 25g无水硫酸钢的=角烧瓶中静置30min后，分取上清液。
[0012] 本发明W龙葵碱制备对照品溶液，将龙葵药材制备成供试品溶液，在酸性缓冲溶 液中利用漠甲酪绿染料与生物碱结合成有色络合物并W氯仿萃取，采用紫外分光光度计在 一定波长处测定该有色溶液的吸收度，用W计算生物碱的含量。
[0013] 为使本领域技术人员更好的理解本发明，本申请人进行了一系列实验研究，W证 明本发明的效果：
[0014] 1 试药
[0015] 龙葵饮片，购自浙江嘉信医药有限公司，经鉴别符合2010年版中国药典（一部）。 龙葵碱对照品，购自陕西慈缘生物技术有限公司，批号20131223。漠甲酪绿、氯仿、乙醇、醋 酸、醋酸钢、无水硫酸钢等，购自嘉兴市甫宏化工有限公司，均为分析纯。
[0016] 2仪器
[0017]UV2201型紫外可见分光光度计（日本岛津），BS224S型电子分析天平（北京赛多 利斯），BGZ246型数显电热恒溫干燥箱（上海博讯），L册8A型连续投料粉碎机（新昌彰诚机 械），RE5299型旋转蒸发仪（上海亚荣）、HH4型数显电热恒溫水浴锅（常州国华）、GM0. 5B 型隔膜式真空累（天津津腾）、LX920S1型电动吸引器（上海斯曼峰）、KQ300DE型数显溫控 超声清洗仪（昆山舒美）。 阳〇1引 3溶液的配制
[0019] 3. 1缓冲溶液先配制0.2mol/L的醋酸溶液和醋酸钢溶液。A液：量取醋酸 11. 55111以加蒸馈水稀释至lOOOmU冷藏保存。B液：称取16. 4g醋酸钢或27. 22g含水醋酸 钢，加蒸馈水溶解，稀释定容至lOOOmU冷藏保存。再依下表分别配制不同抑值的缓冲液： A液X血+B液y血，加水稀释至100血，最后经抑计校正。
[0021] 3. 2染料溶液0.05%漠甲酪绿溶液：精密称取0.Ig，溶于0.05mol/L氨氧化钢溶 液2. 8血，用水稀释至200血，摇匀即得。
[0022] 3. 3对照品溶液精密称取干燥至恒重的龙葵碱对照品5.OOmg，用氯仿溶解，超声 20min，转移至50血容量瓶，加氯仿稀释至刻度，摇匀即得0.Img/mL的对照品储备溶液。
[0023] 3.4供试品溶液龙葵饮片60°C干燥，粉碎过14目筛。精密称取龙葵药材粉末 2.Og，置于锥形瓶，加入2mol/L盐酸：90 %乙醇（体积比1 : 4)的混合溶剂30血，于 40°C下超声提取35min，提取液减压回收乙醇至无醇味的浸膏，浸膏用10%盐酸溶解，超声 20min助溶，抽滤去除沉淀，用10%盐酸定容至10血，用10%化0H调节抑至10-11，加氯仿 萃取3次，收集氯仿液，定容至25ml，即得供试品溶液。
[0024] 4测定波长的选择
[0025] 精密吸取龙葵碱对照品溶液与龙葵供试品溶液各分别置于分液漏斗中，分别 精密加入抑3. 6的醋酸-醋酸钢缓冲溶液3. 5mU及漠甲酪绿染料再加入氯仿lOmL 分3次萃取（4, 3, 3mL)，密塞剧烈振摇5min后，静置30min，分取氯仿层，用干燥定量滤纸过 滤，加入干燥具塞=角烧瓶中（已加入0. 25g无水硫酸钢）静置30min后，取上清液在紫外 分光光度计于200-700nm范围内分别扫描。另精密吸取氯仿置于分液漏斗同上操作， 所得氯仿液为空白对照液。结果表明，龙葵碱对照品溶液和龙葵供试品溶液均在243nm处 有最大吸收峰，而空白对照液在该处无吸收峰，故选择243nm为测定波长。 阳0%] 5酸性染料比色法的建立
[0027] 5. 1缓冲液抑的考察精密吸取龙葵碱对照品溶液2. 0血共5份于分液漏斗中， 分别加入抑值为3. 6、4. 0、4. 4、4. 8、5. 2的醋酸-醋酸钢缓冲液，其余操作同上，所得测定 液分别于243nm处测定吸光度。结果表明缓冲液抑值为3. 6时，测定液有最大吸光度。精 密吸取供试品溶液2.OmL同法操作，结果与对照品所测一致。
[0028] 5.2缓冲液用量的考察精密吸取龙葵碱对照品溶液2.0血共5份于分液漏斗中， 分别加入抑值3. 6的缓冲液1. 0,1. 5, 2. 0, 2. 5, 3.OmU其余操作同上，所得测定液分别于 243nm处测定吸光度。结果表明缓冲液用量为3. 5mL时吸光度最大。精密吸取供试品溶液 2. OmL同法操作，结果与对照品所测一致。
[0029] 5. 3酸性染料用量的考察精密吸取龙葵碱对照品溶液2.OmL共5份于分液漏 斗中，分别加入抑3. 6的缓冲液3. 5mU分别加入漠甲酪绿染料溶液1. 0,1. 5,2. 0,2. 5， 3. OmU其余操作同上，所得测定液分别于243nm处测定吸光度。结果表明酸性染料用量为 2mL时吸光度最大。精密吸取供试品溶液2.OmL同法操作，结果与对照品所测一致。
[0030] 5. 4显色稳定性的考察精密吸取龙葵对照品溶液2. 0血共10份于分液漏斗中， 按照实施例2第1项方法操作，分别在显色后的10, 20, 30,40, 50,60, 70,80,90,lOOmin时， 测定吸收度。结果表明在显色后30min后吸收度无明显变化。
[0031] 6酸性染料比色法测定龙葵中总生物碱含量的方法学考察
[0032] 6. 1精密度的考察精密吸取龙葵碱对照品溶液2.OmU按4项下方法操作测定， 连续测定6次，结果测得吸收值的RSD= 0. 49%，表明仪器精密度良好。
[0033] 6. 2稳定性的考察精密吸取龙葵碱对照品溶液2.OmU按4项下方法操作测定， 每隔30min测1次吸收值，共测5次，结果显示化内吸收值RSD=0. 8%，说明样品液在化 内稳定性好。
[0034] 6. 3线性关系的考察精密吸取对照品溶液0. 5,1. 0,1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0血于5ml 量瓶中用氯仿稀释配成梯度的标准溶液，分别精密吸取2ml置于分液漏斗中，按4项下方法 操作，测定液在243nm测定吸光度。W龙葵碱含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲 线，计算回归方程为Y= 0. 0129X-0. 0087，r2= 0. 9960,线性范围为5-30yg/mL。见图1。
[0035] 6. 4重复性试验精密称取同批号的龙葵干燥粉末5.Og，按4项下方法平行制备6 份供试品溶液，各精密取2.OmU按照实施例2第1项方法操作测定吸光度，结果显示RSD= 1. 53%。
[0036] 6. 5加样回收率实验精密吸取已测定含量的龙葵碱供试品溶液2.OmL各6份，加 入已知浓度的龙葵碱对照品溶液2.OmU按4项下方法操作测定吸光度，根据回归方程，计 算龙葵碱含量，并按下式计算回收率。结果显示平均回收率为99.7%，RSD= 1.4%。
[0037] 加样回收率（％ )=(测得量一供试品含量）/对照品含量X100%
[0038] 表1回收率试验结果（n=6)
[0041] 本发明的酸性染料比色法测定龙葵中总生物碱含量，是根据在适当介质中，碱性 药物度）可