专利名称：自删除质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法。具体而言，本发明涉及在一定条件下培养含有选择标记基因的质粒的方法，所述条件允许根据选择标记基因的表达进行选择和选择标记基因的随后去除。本发明还涉及通过本方法制备的质粒在制备用于治疗和疫苗目的的重组蛋白、制备治疗性DNA和DNA疫苗、以及使用活细菌载体向患者递送重组蛋白和DNA中的用途。通过引用将本文涉及的所有文件并入本文。
背景技术：
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质粒是自我复制的DNA分子，其天然存在于细菌、古生菌和一些单细胞真核生物，例如酵母。近年来，质粒在生物技术产业中必不可少，可用于表达重组蛋白基因以及作为DNA治疗剂和疫苗。对于这些应用，通常修饰编码感兴趣基因的质粒，并使其在细菌宿主细胞中复制，例如大肠杆菌(Escherichia coli)。质粒通常编码抗生素抗性基因,从而能够实现抗生素选择，抗生素选择是用于鉴定转化后含有质粒的细胞，其中向生长培养基中加入的选择性抗生素能够杀死丢失质粒的细胞。然而，使用抗生素进行质粒选择和维持有多种弊端。第一，抗生素抗性基因在宿主细胞中的组成型表达对细胞产生代谢负担，这会降低细胞活力并增加质粒丢失的频率。第二，抗生素是生产过程中的额外的污染，发酵过程中的抗生素降解会降低选择压力。第三，对于DNA治疗剂和疫苗，使用抗生素抗性基因会具有在环境中转入病原体的危险，导致产生抗生素抗性病原株。当使用活细菌株作为向患者递送基因的载体时，存在急性危险。因此，需要开发出不使用抗生素抗性基因的质粒选择机制。已经发展出的备选技术需要表达的选择标记基因，例如能补充宿主染色体中缺失的拷贝的必需基因的功能拷贝。胸苷酸合酶基因thyA (McNeil et al.2000, Appl.Environ.Microbiol., 66:1216-1219)或参与二氛基庚二酸合成的 asd 基因(Degryse 1991, Mol.Gen.Genet.227:49-51)已经被用作细胞中质粒的选择基因，该细胞中的染色体基因是无功能的。该方法和抗生素选择均有相同的重要缺点:选择标记基因的存在和表达对细胞产生明显的代谢负担，并易于使质粒选择性丢失(Bentley et al.1990, Biotechnol.Bioeng.35:668-681)。已经开发出了两种更新的技术，其不需要选择标记基因的表达，因此降低细胞的代谢负担。ORT(操纵基因-阻遏蛋白滴定)利用修饰的细菌细胞，其中必需的染色体基因被置于诱导型启动子的控制下。阻遏蛋白与邻近启动子的操纵基因序列结合，阻止必需基因的表达，从而在不存在诱导剂的情况下会导致细胞死亡。当用含有操纵基因序列的多拷贝质粒转化ORT细菌细胞时，通过质粒滴定阻遏蛋白，并使必需基因表达，从而允许细胞生长并因此允许质粒选择和维持(Cranenburgh et al.2001.Nucleic Acids Res.29:e26)。另一个无选择标记基因的系统(oriSELECT)利用了 pMBl复制起点，在分子遗传学研究和开发中使用的大多数质粒中均存在pMBl复制起点。pMBl ori天然产生用来调节其拷贝数的反义RNA，修饰oriSELECT细胞，使得该RNA与对应的有义序列的mRNA相互作用，有义序列被设计在与调节必需基因的的阻遏基因或毒素基因的基因融合体中，使得细胞存活需要质粒的存在(Cranenburgh 2005，W006/003412)。这些无选择标记基因的表达系统的缺点在于，需要对微生物细胞的染色体进行遗传修饰。这些修饰在许多物种中存在技术难度，甚至在易于接受遗传操作的物种中，这些修饰耗时并且需要的工作量大。因此，仍需要开发出不含有选择标记基因且不需要对宿主细胞进行遗传修饰的质粒选择系统。发明描述本申请的发明人开发出了制备无选择标记基因的质粒的系统。在开发本系统时，本申请的发明人惊奇地发现，在无质粒维持系统的情况下，无选择标记基因的质粒能够在宿主细胞中维持。这个发现是意想不到的，因为在缺少质粒维持系统的情况下，本领域技术人员会预测质粒从宿主细胞中丢失。这个令人惊讶的发现可能是由于在去除选择标记基因之后，细胞内发生的代谢负担大幅降低。因此，第一方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括如下步骤:a)在第一宿主细胞环境中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，第一宿主细胞环境不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后在第二宿主细胞环境中培养质粒，第二宿主细胞环境能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。宿主细胞环境 术语“宿主细胞环境”包括宿主细胞本身和宿主细胞环境的条件。因此，如果质粒被从第一宿主细胞转移到第二宿主细胞或者如果宿主细胞的条件改变，则宿主细胞环境改变。在后一情况中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境是暂时分开的。通常，通过改变细胞培养的条件来改变宿主细胞中的条件。可以改变的条件包括但不限于渗透浓度、温度、是否存在诱导剂、细胞生长期和能够改变DNA的二级结构或超螺旋的化合物的存在。因此，第二方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在第一宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，第一宿主细胞不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后在第二宿主细胞中培养质粒，第二宿主细胞能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。第三方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在一定渗透浓度下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，在所述渗透浓度下不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后改变宿主细胞的渗透浓度，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。第四方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在一定温度下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，在所述温度下不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后改变宿主细胞的温度，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。第五方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在缺少诱导剂的条件下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，在缺少诱导剂的条件下不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后向宿主细胞添加诱导剂，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。第六方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在能改变质粒的DNA 二级结构或超螺旋的化合物的存在下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，所述化合物的存在使细胞不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及
b)随后改变细胞内化合物的水平，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。第七方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤:a)在缺少能够作用于位点特异性重组酶靶位点的位点特异性重组酶的条件下，在第一宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，从而细胞不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及b)随后在能够作用于位点特异性重组酶靶位点的位点特异性重组酶的存在下，在第二宿主细胞中培养质粒，从而去除选择标记基因。在一个实施方案中，通过上述改变中的一种或多种可以改变宿主细胞环境。位点特异性重组酶在一个实施方案中，本发明的方法利用内源性位点特异性重组酶，从而在第二宿主细胞环境中实现选择标记基因的去除。这样是有利的，因为不需要对宿主细胞进行遗传修饰，从而使方法更简单并且更高效。所用术语“内源性”表示位点特异性重组酶来源于与第二宿主细胞环境相同的细胞类型。通常，位点特异性重组酶来源于第二宿主细胞环境，即，第二宿主细胞环境不必接受遗传操作，即含有能够表达位点特异性重组酶的基因。对于本领域技术人员显而易见的是，作用于本发明方法中的质粒的内源性位点特异性重组酶的性质取决于质粒内存在的位点特异性重组酶靶位点的性质。利用内源性位点特异性重组酶能提供优于现有技术的优势，因为不需要引入反式外源重组酶。这简化了方法，使方法更快捷、更便宜并且更高效，因为不需要修饰宿主细胞环境来表达重组酶。在其它实施方案中，内源性位点特异性重组酶可以包括XerC、XerD,CodV、RipX、Cre、Int、Xis、P22、Flp 和 Rl 中的一个或多个。在一个实施方案中，内源性位点特异性重组酶可选自Cre、Flp、R、XerC、XerD、RipX和 CodV。在另一个实施方案中，内源性位点特异性重组酶可以是转座酶。优选地，位点特异性重组酶是XerC和XerD。更优选地，XerC和XerD位点特异性重组酶是内源性的。在原核细胞中，Xer重组系统对于确保复制后正确的染色体分离以及将由RecA产生的染色体二聚体恢复为单体从而允许复制的染色体分离是必需的。Xer重组酶是酪氨酸重组酶家族的成员，在革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)中，以XerC和XerD为代表(Blakely et al.Cell 1993，75:351-361),在枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)和其它革兰氏阳性细菌中，以CodV和RipX为代表(Sciochetti et al.1999，J.Bacteriol.181:6053-6062)。Xer重组酶作用于染色体上被称为dif的28个碱基对的革巴序列(Leslie andSherratt 1995, EMBO J.14:1561-1570; Sciochetti et al.2001, J.Bacteriol.183:1058-1068)。在大肠杆菌中，蛋白FtsK对于Xer重组是必需的(Recchiaetal.1999, EMBO J.18:5724-5734)，并且FtsK同源物在细菌中是广泛保守的，但在古生菌中没有发现(Recchia and Sherratt 1999，Mol.Microbiol.34:1146-1148)。内源性Xer重组系统已被用于Xer-cise技术，用于在线性DNA分子整合进宿主细胞染色体之后，从染色体中去除抗生素抗性基因(Bloor andCranenburgh 10 2006, Appl.Environ.Microbiol.72:2520-2525)。内源性Xer重组系统还具有解离质粒二聚体的功能。为了促进重组，质粒二聚体包含位点特异性重组酶识别位点，该位点与dif功能相同。这些位点是cer和psi。在大肠杆菌质粒 ColEl 中发现了 cer (Summers andSherratt 1984, Cell 36:1097-1103),在沙门氏菌(Salmonella)质粒 pSClOl 中发现了 psi (Cornet et al.1994, J.Bacteriol.176:3188-3195)。当形成质粒二聚体时,Xer重组系统发挥作用，通过在cer和psi位点进行DNA重组，使二聚体转化为两个单体。然而，与染色体dif位点不同，如果还存在约ISObp的附属序列,XerC和XerD只作用于质粒祀位点(Hayes and Sherratt, 1997)。cer的附属序列是蛋白PepA(氨基肽酶A)和ArgR(精氨酸生物合成途径阻遏蛋白)的结合位点,psi的附属序列是蛋白 PepA和 ArcA 的结合位点(Collo`ms et al.1998, Mol Microbiol.28:521-530)。需要这样设置来确保质粒上的Xer重组是定向的，即，只对二聚化作用天然形成的同向重复二聚体解离位点起作用。由于解离质粒二聚体需要附属序列，所以以前描述的Xer-cise系统不能直接用于质粒。在一个实施方案中，位点特异性重组酶可以是诱导型或组成型表达的。在一些实施方案中，位点特异性重组酶优选是诱导型的。具体而言，当本发明的方法利用在相同的宿主细胞内存在的第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境时，位点特异性重组酶优选是诱导型的。在这个实施方案中，通过改变渗透浓度、温度、是否存在诱导剂、细胞生长期和能够改变DNA 二级结构或超螺旋的化合物的存在中的一个或多个条件，可以诱导重组酶的表达。重组酶介绍如上所述，本发明优选的实施方案不需要对维持质粒的第二宿主细胞环境进行遗传修饰。然而，当位点特异性重组酶(例如Xer重组酶系统)在第二宿主细胞环境中不是天然存在时，可以通过向宿主细胞环境中引入编码合适的位点特异性重组酶或转座酶的基因来实施本发明的方法。当第二宿主细胞环境中存在位点特异性重组酶，但需要在第二宿主细胞环境中非天然存在的其它位点特异性重组酶时，也可以运用该方法。在这个实施方案中，可以向第二宿主细胞环境中引入编码所述其它位点特异性重组酶的基因。可以将编码位点特异性重组酶的基因引入染色体外元件或整合入宿主细胞染色体。适于引入宿主细胞环境的重组酶实例包括但不限于来自噬菌体Pl的Cre(Dale andOw 1991, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:10558-10562)、来自 λ 噬菌体的 Int 和 Xis (Zubkoet al.2000, NatureBiotechnol.18:442-445)和来自酵母的 P22 (Wulff et al.1993, Mol.Microbiol.9:261-271) > Flp (Datsenko and Wanner 2000,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:6640-6645)和R(Sugita et al.2000, Plant J.22:461-469)。还可以使用反式表达的转座酶来去除侧翼具有内部解离位点的选择标记基因(Sanchis et al.1997, Appl.Environ.Microbiol.63:779-784)，因此可以以与重组酶相同的方式将转座酶弓I入宿主细胞环境。质粒上的选择标记基因的侧翼为被引入宿主细胞环境的重组酶系统的位点特异性重组酶靶位点。如上文所述，当使用内源性位点特异性重组酶系统时，本发明的方法也能发挥作用。位点特异性重组酶祀位点本发明方法中使用的存在于质粒内的选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶革巴位点。位点特异性重组酶祀位点是位点特异性重组酶所针对的染色体或质粒DNA序列的一部分。当位点特异性重组酶靶位点按前后顺序存在时，一个或多个位点特异性重组酶能够作用于所述位点，从而去除位于所述位点之间的DNA部分。在本发明的范围内，术语位点特异性重组酶祀位点还包括转座酶祀位点。如上述讨论，Xer重组酶系统对于原核细胞是内源性的，并利用酪氨酸重组酶XerC和XerD来解离染色体和质粒二聚体。在一个实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以能够结合XerC和/或XerD。在一个实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以是任何XerC和/或XerD结合位点。可以从宿主细胞染色体和质粒中鉴定出示例性的位点。通过组合来自质粒和染色体的天然存在的质粒二聚体解离位点，可以形成位点特异性重组酶祀位点。这样的杂合位点的实例是dif-psi杂合位点，也被称为pif位点(Cornet et al.1994，J.Bacteriol.176:3188-3195),在下面的表 I 中给出了 pif 位点的序列。Pif位点与psi只有一个核苷酸不同，但其能够促进质粒和染色体上的Xer重组。通过制备杂合序列和使用诸如Barre et al.2000描述的简单的重组测试(GenesDev.14:2976-2988)来测定这些杂合序列作为质粒二聚体解离位点的能力，可以开发出能用于本发明方法中的其它杂合位点。染色体或质粒的局部超螺旋被认为是Xer重组中重要的因素，因此可能存在以下情况，渗透浓度条件或周围的DNA序列能够通过通常仅在染色体上发挥功能的位点(如dif)而促进质粒上的Xer重组。因此，在一个实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以是dif位点。在其它实施方案中，位点特异性 重组位点可以类似于下面表I中列出的任何位点或SEQ ID N0:17、20或23中的任意一个。如果位点特异性重组酶靶位点包含SEQ IDN0:l-9、17、20或23中的任意一个或由SEQ ID NO: 1-9、17、20或23中的任意一个组成，则认为该位点特异性重组酶靶位点与SEQ ID NO: 1-9,17,20或23中的一个类似。如果位点特异性重组酶靶位点与SEQ ID NO: 1-9、17、20或23中任意一个具有50%或更高的序列一致性，则认为该位点特异性重组酶靶位点与SEQ IDN0:1-9、17、20或23中的一个类似。或者，位点特异性重组酶靶位点可以与SEQ ID N0:l-9、17、20或23中的一个具有60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的序列一致性。这可以相当于与SEQ ID NO: 1_9、17、20或23中的任意一个相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸取代。包含SEQID N0:l-9、17、20 或 23 中任意一个的 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30、31、32、33或34个核苷酸的片段的序列也包含在本发明的范围内。以上描述的片段或变体序列可能够结合XerC和/或XerD。对于本领域技术人员显而易见的是，质粒中包括的位点特异性重组酶靶位点的性质取决于本发明方法涉及的第一和第二宿主细胞环境中内源性的位点特异性重组酶。本发明的方法提供的优于现有技术方法的优势在于，不需要反式引入外源重组酶。因此，第二细胞环环境中的内源性位点特异性重组酶必须能作用于位点特异性重组酶靶位点。然而，这并不表示位点特异性重组酶靶位点必须对于过程发生的细胞也是内源性的。例如，有证据表明，来自一个物种的位点特异性重组酶能够作用于来自另一个物种的位点特异性重组酶靶位点(Neilson et al.1999，Mol.Microbiol.31:915-926)。此夕卜，位点特异性重组酶已被证实能解离不同的位点(Cornet et al.1994，J.Bacteriol.176:3188-3195),例如大肠杆菌dif位点和ps1-dif杂合体(pif位点)。真核细胞也包含用于去除两个位点特异性重组酶靶位点之间的DNA的天然的位点特异性重组酶。例如，通过FRT位点之间的DNA重组，酵母2 μ m质粒的Flp重组酶能够反转质粒的区域。 因此，在一个实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以是FRT位点。表1:本发明中使用的位点特异性重组酶的示例性结合位点和它们的结合位点
权利要求
1.备无选择标记基因的质粒的方法，所述方法包括以下步骤: a)在第一宿主细胞环境中培养含有选择标记基因的质粒，所述选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，所述第一宿主细胞环境不能实现所述位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及 b)随后在第二宿主细胞环境中培养所述质粒，所述第二宿主细胞环境能够实现所述位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除所述选择标记基因。
2.按权利要求1所述的方法，还包括以下步骤: c)在细胞培养中维持所述无选择标记基因的质粒。
3.按权利要求1或2所述的方法，还包括以下步骤: d)从所述第二宿主细胞环境分离所述无选择标记基因的质粒。
4.按权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶靶位点与实现位点特异性重组所必需的附属序列在功能上相关联。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境在不同的细胞内。
6.按权利要求5所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境在编码P印A、ArgR和ArcA的基因中的一个或多个中包含失活突变。
7.按权利要求5或6所述的方法，其中所述第二宿主细胞环境包含ArgR或ArcA基因和PepA基因的活性形式。
8.按权利要求5所述的方法，其中所述第二宿主细胞环境包含位点特异性重组酶。
9.按权利要求7所述的方法，其中所述位点特异性重组酶是内源性位点特异性重组酶。
10.按权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境在相同的宿主细胞中形成。
11.按权利要求9所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境是暂时分开的。
12.按权利要求9或10所述的方法，其中所述第二宿主细胞环境包含诱导型位点特异性重组酶。
13.按权利要求9-12中任一项所述的方法，其中通过改变所述细胞的温度，改变所述细胞的渗透浓度，改变所述细胞中诱导剂的水平或改变所述细胞中能改变所述质粒的二级结构或超螺旋的化合物的水平来形成所述第二宿主细胞环境。
14.按权利要求8、9、12或13中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶选自Cre, Flp, R、XerC, XerD, RipX 和 CodV。
15.按权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶靶位点是转座酶靶位点。
16.按权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶靶位点选自Ecdif、cer、ps1、pif > mwr、Bsdif、loxP、FRT 和 RS0
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因是抗生素抗性基因。
18.按权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因能允许产生在所述第一和/或第二宿主细胞环境中缺少，但又是所述第一和/或第二宿主细胞环境必需的代谢物。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和/或所述第二宿主细胞环境是革兰氏阴性细菌细胞。
20.按权利要求19所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境独立地选自埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、农杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)和弧菌属(Vibrio)。
21.按权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和/或所述第二宿主细胞环境是革兰氏阳性细菌细胞。
22.按权利要求21所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境是独立地选自芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、利斯特氏菌属(Listeria)、乳杆菌属 (Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)和分枝杆菌属(Mycobacterium)。
23.按权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和/或所述第二宿主细胞环境是古生菌。
24.按权利要求23所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和/或所述第二宿主细胞环境是酵母细胞。
25.按权利要求24所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境独立地选自汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。
26.按权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和/或所述第二宿主细胞环境是能够复制质粒的非真菌真核生物。
27.按权利要求26所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境独立地选自衣藻属(Chlamydomomas)、网柄菌属(Dictyostelium)和内阿米巴属(Entamoeba)。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述质粒编码一个或多个感兴趣的基因。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法制备的质粒。
30.修饰的宿主细胞，其含有无选择标记基因的质粒。
31.主细胞，其含有无选择标记基因的质粒，所述质粒具有残留的位点特异性重组酶革巴位点。
32.按权利要求31所述的宿主细胞，其含有编码诱导型位点特异性重组酶的基因。
33.按权利要求32所述的宿主细胞，其中所述诱导型位点特异性重组酶存在于所述宿主细胞的染色体上。
34.合物，其包含权利要求30所述的未修饰的宿主细胞或权利要求31-33中任一项所述的宿主细胞、以及药学上可接受的载体。
35.一种患者或治疗患者的方法，包括将权利要求30所述的未修饰的宿主细胞、权利要求31-33中任一项所述的宿主细胞或权利要求34所述的组合物给予所述患者。
36.关于接种患者或治疗患者疾病的权利要求30所述的未修饰的宿主细胞、权利要求31-33中任一项所述的宿主细胞或权利要求34所述的组合物。
37.关于制备用于接种患者或治疗患者疾病的药物的权利要求30所述的未修饰的宿主细胞、权利要求31-33中任一项所述的宿主细胞或权利要求34所述的组合物。
38.主细胞，其包含含有选择标记基因的质粒，所述选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶祀位点，其中所述宿主细胞还在编码附属蛋白PepA、ArgR或ArcA中一个或多个的染色体基因的一个或多个中包含失活突变。
39.剂盒，其包括以下或由以下组成: i)第一宿 主细胞环境，其包含含有选择标记基因的质粒，所述选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，其中所述第一宿主细胞环境不能实现所述位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及 ii)第二宿主细胞环境，其能实现所述位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除所述选择标记基因。
全文摘要
提供了制备无选择标记基因的质粒的方法，包括在不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组的宿主细胞环境中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，随后在能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组的另一宿主细胞环境中培养所述质粒，从而去除所述选择标记基因。还提供了通过所述方法制备的质粒在制备用于治疗和疫苗目的的重组蛋白、制备治疗性DNA和DNA疫苗以及使用活细菌载体向患者递送重组蛋白和DNA中的用途。
文档编号C12N15/64GK103097537SQ201180032633
公开日2013年5月8日 申请日期2011年6月28日 优先权日2010年6月30日
发明者罗基·马尔科·科瑞安恩波格, 马修·威廉·莱肯拜 申请人:科步尔生物制剂有限公司