专利名称：对虾白斑和桃拉综合症病毒的二温式多重pcr检测方法
技术领域：
本发明属于水生动物病害的检测技术，主要是针对对虾白斑综合症病毒(White spotsyndrome virus，WSSV)和桃拉综合症病毒(taura syndrome virus，TSV)的同时检测。
背景技术：
白斑综合症病毒是对虾白斑综合症的病原，以病死虾体外壳内侧呈现白色斑点而得名，中国在1992年首先在台湾发现对虾白斑综合症，此病在沿海地区迅速曼延，成为中国对虾养殖的最主要威胁。马来西亚、印度尼西亚、泰国、日本、菲律宾、韩国及美国部分地区也相继发现白斑综合症病毒病害。该病毒分子量较大、结构特异，是已知动物病毒中最大的病毒，属于双链DNA病毒，完整的病毒形态呈现线团状，无包涵体，有囊膜，一末端有尾状结构。其宿主范围较广，除了感染对虾外，还可感染蟹类和一些桡足类生物等，危害较为严重。
桃拉综合症病毒是对虾桃拉病的病原，也是主要危害南美白对虾的一种严重传染性病毒病。桃拉综合症病毒除了主要感染南美白对虾之外，还可危害红额角对虾和斑节对虾等对虾品种，1999年，桃拉综合症在我国台湾流行，接着该病进入我国大陆，2001年在我国东南沿海较多的养虾地区暴发。2002，2003年该病的危害进一步加剧，并向内地扩散。桃拉综合症病毒，属于单链RNA病毒，呈现二十面体结构，直径大约30nm，无包含体，无囊膜，被桃拉综合症病毒感染过的南美白对虾将导致60-90％的死亡率，而幸存下来的对虾将会作为桃拉综合症病毒的隐形感染者继续传播，从而导致更大的损失。
白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒不仅能单独感染对虾，而且二者往往能引起对虾的复合感染，更加大了对虾病害防治的难度。目前，对于对虾病毒病尚无有效的治疗方法，病害防治的重点在于早期检测，提前预防，以减少因病害相互感染暴发带来的严重损失。对对虾疾病的检测主要有传统的组织病理学方法、血清免疫学方法以及现代分子生物学方法，其中分子生物学方法中聚合酶链反应(PCR)检测技术的应用较为广泛，二温式PCR和多重PCR均是PCR的一种特殊形式，它们用于对虾病害病原的检测国内已有报道，比如庞耀珊等将二温式PCR用于白斑综合症病毒的检测，夏春等将多重PCR应用于对虾皮下和造血器官坏死杆状病毒的检测，本项发明即二温式多重PCR集中了二温式PCR和多重PCR的优势，能够同时有效地快速检测对虾白斑综合症和桃拉综合症两种病毒，使得检测更加快速简便，省时省力，这在对虾病原的检测中尚无报道。
发明内容
本发明的目的是集中二温式PCR和多重PCR的优势，分别利用白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因保守序列设计两对引物，建立并优化二温式多重PCR反应体系和反应程序，能够同时检测对虾白斑综合症和桃拉综合症两种病毒，简便了试验操作程序，加快了诊断速度，又节约了试验费用，从而对疾病早发现、早处理、尽可能减少因病害暴发带来的经济损失有着重要的意义。利用该PCR能特异扩增出白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因片段，而对其它一些对虾病原呈现阴性，且该PCR最低能检测到白斑综合症病毒核酸模板10pg，桃拉综合症病毒核酸模板100pg，结果表明，该PCR具有较高的特异性和敏感性，既节省了时间，又节约了试验费用，可用于白斑综合症病毒病和桃拉综合症病毒病的同时早期诊断及各养殖时期虾体的健康状况调查研究，对控制对虾疾病的大规模流行有着重要的意义，同时对于对虾的其它病原鉴别诊断有一定的参考价值。
为实现上述目的采取的技术方案。根据已报道的白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因组序列，分别找出它们的保守区域，设计两对特异引物，用于白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因片段扩增。利用简便、有效的核酸提取法从患病对虾组织中提取基因组总DNA，利用TRIzol试剂盒从患病对虾组织中提取RNA，并利用RT-PCR反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。设计该二温式多重PCR的反应体系和扩增程序，将核酸进行扩增，利用凝胶电泳分析扩增结果及特异性，同时利用十倍递近稀释法检测该二温式多重PCR的敏感度。
技术方案的中心内容1.根据已报道的白斑综合症病毒基因组序列(VanHulten，m.c.，Witteveldt，J.，Peters，S.，kloosterboer，N.，Tarchini，R.，Fiers，M.，Sandbrink，H.，Lankhorst，R.K.，Vlak，J.M.，2001b.The white spot syndrome virus DNA genome sequence.Virology 286，7-22.)和桃拉综合症病毒基因组序列(Mari，J.，Poulos，B.T.，Lightner，D.V.，Bonami，J.R.，2002.ShrimpTaura syndrome virusgenomic characterization and similarity with members of the genus Cricketparalysis-like viruses.J.Gen.Virol.83，915-926)分别设计针对白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的特异引物F1、R1，F2、R2。
2.白斑综合症病毒DNA提取；3.桃拉综合症病毒RNA提取及cDNA的合成；4.二温式多重PCR的扩增；5.琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果；6.二温式多重PCR特异性及敏感性检测。
本发明与现有技术相比所具有的优点和积极效果与白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的常规PCR检测技术相比，该二温式多重PCR打破常规的三温循环和病原单个检测，能在一个体系中同时检测到白斑综合症病毒和桃拉综合症两种病毒，既能缩短检测时间，提高工作效率，又能节约试验费用，实验证明具有较高的特异性和敏感度，可用于白斑综合症病毒病和桃拉综合症病毒病的早期诊断及各养殖时期虾体的健康状况检测，防止病毒的暴发流行，并对于对虾的其它病原鉴别诊断有一定的参考价值。
具体实施例方式
本发明的实施例1.设计分别针对白斑综合症病毒(WSSV)和桃拉综合症病毒(TSV)的两对特异引物F1、R1，F2、R2。
用于扩增白斑综合症病毒特异基因片段大小为451bp，其中上游引物F1为5’GCCCTGGAGAACACGTCC 3’，下游引物R1为5’TGGCGAACGGTGCAAGAGCC3’；用于扩增桃拉综合症病毒特异基因片段大小为231bp，其中上游引物F2为5’AAGTAGACAGCCGCGCTT 3’，下游引物R2为5’TCAATGAGAGCTTGGTCC3’；2.白斑综合症病毒DNA提取取病虾的部分肝胰腺、胃、肠、肌肉，用剪刀剪碎，混匀后取约100mg样品。将样品置于液氮中研磨，加入1.3ml裂解液(成分包括Tris、EDTA、SDS)、7.5ul蛋白酶K，转移到5ml的离心管中，放于65℃水浴中消化3h，冷却后离心去除沉淀，加700ul苯酚，12000r/min离心5分钟，三次，去除蛋白，收集上清于另一离心管中，加600ul酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，12000r/min离心5分钟，取上清，再加500ul氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000r/min离心5分钟，收集上清加100ul 10mol/l醋酸铵及1ml乙醇，于4℃放置30分钟沉淀DNA，用70％乙醇洗涤2次，5000r/min离心5分钟，收集DNA，凉干后加25ulTE溶解，储存于-20℃冰箱。
3.桃拉综合症病毒RNA提取及cDNA的合成利用TRIzoL试剂盒进行对虾总RNA的提取取病虾的部分肝胰腺、胃、肠、肌肉、腮，用剪刀剪碎，取约100mg样品组织。在组织中加入1ml TRIzoL，放入经高压灭菌的研钵中，并不断加入液氮进行研磨匀浆，充分研磨匀浆后在15℃-30℃放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离，将匀浆样品置入1.5ml的离心管，4℃12000g/min离心10分钟，取上清，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟，4℃12000g/min离心15分钟，取位于上层的水相，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10分钟，4℃12000g/min离心10分钟，去上清，保留沉淀，加1ml 75％乙醇洗涤，4℃7500g/min离心5分钟，去上清，室温凉干，加30ul经DEPC处理过的水溶解沉淀，即为所提取的对虾总RNA样品，于-70℃保存样品。
利用RT-PCR反转录试剂盒进行cDNA合成在PCR反应管中，加入经冰浴融化的RNA样品3ul、Nuclease-free Water 1ul、桃拉病毒的特异下游引物1ul，置入70℃的水浴中加热保温5分钟，然后立即置于冰水浴中冷却5分钟，并用微量离心机短暂离心，置于冰水浴中，继续加入Nuclease-free Water 8.5ul、5×RT Buffer 4ul、dNTP Mixture 1ul、RNasin RibonucleaseInhibitor 0.5ul、M-MLV RTase H 1ul，将反应管转入25℃保温5分钟，使得模板和引物退火，42℃保温1小时，引导cDNA链的合成，70℃保温15分钟，灭火反转录酶，终止反应，反应液即可作为PCR反应中的cDNA模板。
4.二温式多重PCR扩增建立二温式多重PCR，通过不同反应条件下PCR扩增效果的比较，该二温式多重PCR反应体系设计其中10×Tag酶缓冲液2.45ul，dNTP 0.5ul，Tag酶0.25ul，白斑综合症病毒DNA样品、桃拉综合症病毒反转录产物cDNA样品、白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒上下游引物分别为1ul，然后用双蒸水补足体积到25ul，放入PCR仪进行扩增反应，程序设计如下94℃2min，然后94℃30s，54℃30s，35个循环；随后72℃3min，最后置于4℃保存。
5.琼脂糖凝胶电泳观察结果用TAE电泳缓冲液配置1.2％的琼脂糖凝胶，在TAE电泳槽中进行水平电泳，加10ulPCR扩增产物，并设立DNA Marker作对照，100V/85mA电泳40分钟，并于溴化乙锭中染色10分钟，通过紫外光检测仪观察，并用凝胶成像系统拍摄电泳结果。若在231bp处出现扩增条带说明为桃拉综合症病毒阳性，若在451bp处出现扩增条带说明为白斑综合症病毒阳性，若在231bp及451bp处均出现扩增条带，说明白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒均为阳性，无扩增条带者说明白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒均为阴性。
6.二温式多重PCR敏感性检测用分光光度计测定呈现阳性扩增的白斑综合症和桃拉综合症病原核酸浓度，按照十倍递近稀释法进行稀释，每个稀释浓度分别取白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒核酸稀释液各1ul，利用该二温式多重PCR进行扩增，借助凝胶电泳观察结果，找出肉眼观察可见特异电泳条带时所用核酸的最小临界值。经敏感性试验测定，该二温式多重PCR最低能同时检测到100pg的WSSV和TSV，而能单独检测出10pg的WSSV，此时TSV无扩增条带，而当核酸量稀释到1pg、100fg的时候，WSSV和TSV均无扩增条带，因此该二温式多重PCR对WSSV的敏感度是10pg，对TSV的敏感度是100pg。
权利要求
1.对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的二温式多重PCR快速检测的方法，其特征是包含下列工作内容(1)分别设计针对白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的两对特异引物F1、R1，F2、R2；(2)白斑综合症病毒DNA提取；(3)桃拉综合症病毒RNA提取及cDNA的合成；(4)二温式多重PCR的建立；(5)琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果；(6)二温式多重PCR特异性及敏感性检测。
2.按权利要求1所述的对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的二温式多重PCR快速检测的方法，其特征是包括以下操作步骤(1)特异性引物的设计与筛选分别根据白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因组序列，设计相应的特异引物，其中用于扩增WSSV特异基因片段大小为451bp，上游引物为5’GCCCTGGAGAACACGTCC 3’，下游引物为5’TGGCGAACGGTGCAAGAGCC3’；用于扩增TSV特异基因片段大小为231bp，其中上游引物为5’AAGTAGACAGCCGCGCTT 3’，下游引物为5’TCAATGAGAGCTTGGTCC3’；(2)白斑综合症病毒DNA的提取取病虾的部分对虾组织，混匀后取约100mg样品，将样品置于液氮中研磨，加入1.3ml裂解液(成分包括Tris、EDTA、SDS)、7.5ul蛋白酶K，放于65℃水浴中消化3h，冷却后离心去除沉淀，加700ul苯酚，12000r/min离心5分钟，重复操作三次，去除蛋白，收集上清，加入600ul酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1，12000r/min离心5分钟，取上清，再加入500ul氯仿∶异戊醇为24∶1，12000r/min离心5分钟，收集上清加100ul 10mol/l醋酸铵及1ml乙醇，于4℃放置30分钟沉淀DNA，用70％乙醇洗涤2次，凉干后用TE溶解；(3)桃拉综合症病毒RNA提取及cDNA的合成；取病虾的部分组织约100mg，置于研钵中加入液氮研磨匀浆，加入1ml TRIzoL在15℃-30℃放置5分钟，收集到离心管，离心取上清，加0.2ml氯仿剧烈振荡15秒，放置3分钟，离心取位于上层的水相，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10分钟，离心取沉淀，加1ml 75％乙醇洗涤，室温凉干，DEPC水溶解沉淀，即为所提取的对虾总RNA样品，于-70℃保存。cDNA合成在PCR反应管中，加入经冰浴融化的RNA样品3ul、Nuclease-free Water 1ul、桃拉综合症病毒的特异下游引物1ul，置入70℃的水浴中5分钟，然后置于冰水浴中冷却，继续加入Nuclease-free Water 8.5ul、5×RT Buffer 4ul、dNTP Mixture 1ul、RNasin RibonucleaseInhibitor 0.5ul、M-MLV RTase H 1ul，将反应管转入25℃5分钟，42℃保温1小时，70℃ 15分钟，终止反应，反应液即为PCR反应中的cDNA模板。(4)二温式多重PCR反应体系设计如下其中10×Tag酶缓冲液2.45ul，dNTP 0.5ul，Tag酶0.25ul，白斑综合症病毒DNA样品、桃拉综合症病毒反转录产物cDNA样品、白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒上下游引物分别为1ul，然后用双蒸水补足体积到25ul，放入PCR仪进行扩增，设计反应程序如下94℃预变性2min，然后94℃变性30s，54℃退火兼延伸30s，35个循环；随后72℃延伸3min，最后置于4℃保存；(5)琼脂糖凝胶电泳观察结果用TAE电泳缓冲液配置1.2％的琼脂糖凝胶，在TAE电泳槽中进行水平电泳，加10ulPCR扩增产物，并设立副溶血弧菌作为扩增反应阴性对照，100V/85mA电泳40分钟，并于溴化乙锭中染色10分钟，通过紫外光检测仪观察，并用凝胶成像系统拍摄电泳结果，若在231bp处出现扩增条带说明为桃拉综合症病毒阳性，若在451bp处出现扩增条带说明为白斑综合症病毒阳性，若在231bp及451bp处均出现扩增条带，说明白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒均为阳性，无扩增条带者说明白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒均为阴性；(6)用分光光度计测定呈现阳性扩增的白斑综合症和桃拉综合症病毒核酸浓度，按十倍递近稀释法进行稀释，分别取白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒核酸稀释液各1ul，利用该二温式多重PCR进行扩增，借助凝胶电泳观察结果，找出肉眼观察可见特异电泳条带时所用核酸的最小临界值，依此得出该二温式多重PCR的敏感性。
全文摘要
本发明提供一种对虾白斑综合症病毒(White spotsyndrome virus，WSSV)和桃拉综合症病毒(taura syndrome virus，TSV)的二温式多重PCR快速检测方法。该检测技术首先根据白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因保守序列设计两对特异引物，建立一种二温式多重PCR技术用于对虾病毒的同时复合检测的方法。该二温式多重PCR技术操作简便，特异性好，灵敏度高，既能缩短病原检测时间，又能节约检测费用，可用于对虾白斑综合症和桃拉综合症的同时早期检测，及各养殖时期虾体的健康状况调查研究，对控制对虾疾病的流行有着重要的意义，同时对于对虾的其它病原鉴别诊断有一定的参考价值。
文档编号C12Q1/68GK1873026SQ20061005030
公开日2006年12月6日 申请日期2006年4月11日 优先权日2006年4月11日
发明者吴刘记, 吴信忠 申请人:浙江大学