一株芽孢杆菌及其菌剂的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种芽孢杆菌及其菌剂的制备方法，所述菌株为芽孢杆菌FZUL-33(BacillusSp.)，已于2014年8月15日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号：CGMCCNo.9523，将该菌株活化、发酵得到发酵培养液，与添加剂混合后通过喷雾干燥工艺制备菌剂，应用于土壤残留农药的降解。本发明的优势在于利用芽孢杆菌耐高温、耐干燥的特点，使其在经过喷雾干燥菌剂制备过程后，菌株仍有较高的存活率，通过平板计数法检测所得菌剂存活率达到70%以上，活菌数大于1010CFU/g。
CGMCC No9523
20140815
【专利说明】一株芽孢杆菌及其菌剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物培养领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其菌剂的制备方法，包括 微生物培养和菌剂制备及其降解有机磷农药的应用。
【背景技术】
[0002] 当代农业的迅速发展，不可避免的导致农药残留问题的出现。其中，有机磷农药应 用最为广泛。而往往有机磷农药发挥杀虫作用的只有一小部分，很大一部分则残留下来。残 留下的有机磷农药会改变土壤的理化性质，影响土壤质量，并且随着雨水冲刷，造成地下水 污染。有机磷农药对人畜可产生慢性中毒，导致神经系统损伤。对于农药的致癌、致畸、致 突变问题更是令广大群众担忧。
[0003] 目前，利用微生物降解残留农药的方法因其操作可行性和成本低等特点，已获得 广泛的肯定。对具有降解有机磷农药的微生物的筛选通常是由长期遭受农药污染的土壤和 水体中分离得到。例如，天京科技大学的王硕、郭睿莉等人（2009)从山东农药厂采集的活 性污泥中分离得到一株能够降解有机磷农药的产碱杆菌。本发明特点在于所分离到的芽孢 杆菌能快速有效降解残留的有机磷农药。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种一株芽孢杆菌及其菌剂的制备方法，解决农药残留问 题。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 本发明利用的微生物鉴定为芽孢杆菌分.）FZUL_33。该菌株已保存于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：中国北京，保藏日期为2014年 8月15日，保藏号为：CGMCC No. 9523。该菌株通过喷雾干燥制得的菌剂具有降解有机磷农 药的特性。
[0006] 本发明所用菌株是从福建某长期有机磷农药用地的土壤中分离得到，该菌株为革 兰氏阳性细菌，菌落表面粗糙，乳白色，边缘波状有褶皱，菌体无荚膜，周生鞭毛，能运动。该 芽孢杆菌可在PH为7. 2的LB培养基中良好生长。将该菌株活化、发酵得到发酵培养液，与 添加剂混合后通过喷雾干燥工艺制备菌剂，应用于土壤残留农药的降解。
[0007] 具体步骤如下： 1、菌种复苏：芽孢杆菌FZUL-33 分.FZUL-33)种子菌接种到LB固体培养基 上，32°C，培养48h，备用。
[0008] 2、菌种活化：将LB固体培养基菌种接种到LB液体培养基中，32-35 °C培养 18-24h，得到液体发酵种子培养液。
[0009] 3、菌种发酵：将液体发酵种子培养液按3%的接种量接种入发酵罐，32-35 °C培养 36-48h，得到芽孢杆菌发酵液。
[0010] 4、在发酵液中按5%-10%的质量比通过无菌操作添加碳酸钙、碳酸氢钠作为喷雾 干燥保护剂，振荡使悬浮均匀，制得菌体悬浮液，备用。
[0011] 5、将所得菌体悬浮液进行喷雾干燥得到干燥菌剂，进料浓度为20-30%，进料量 10-20ml/min，进风温度 110-150°C，出风温度 60-90°C。
[0012] 所述菌株LB固体培养基成分为胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化钠1%，其余为 水，pH为7. 2,温度32-35°C。LB液体培养基成分为胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化钠 1%，其余为水，pH为7. 2。
[0013] 步骤（5)中喷雾干燥条件为：进风温度为IKTC _150°C，出风温度为60°C -90°C， 进样速度为5-10ml/min。
[0014] 步骤（4)中碳酸钙含量为5wt. %-12wt. %，碳酸氢钠含量为5wt. %-lOwt. %。
[0015] 所述的方法制备得到的菌剂。该菌剂在24-48h内降解农药用地中75%以上的乙 酰甲胺磷。该菌剂降解有机磷农药的适宜PH为7-9。
[0016] 所述的菌剂在有机磷农药降解中的应用。
[0017] 我们通过含有机磷农药农的培养基筛选出了能够耐受有机磷农药的芽孢杆菌，发 现该芽孢杆菌具有降解有机磷农药的特性。并且本发明的优势在于利用芽孢杆菌耐高温、 耐干燥的特点，使其在经过喷雾干燥菌剂制备过程后，菌株仍有较高的存活率，通过平板计 数法检测所得菌剂存活率达到70%以上，活菌数大于10 1(lCFU/g。本发明有机磷农药残留量 采用气象色谱法测定。
【具体实施方式】
[0018] 实例1 :芽孢杆菌菌剂制备 1. 1菌种的活化 取甘油冷冻保藏的芽孢杆菌种子菌，在LB平板上划线，挑单菌落接种于LB液体培养基 中，在好氧、常压、32°C条件下置于120转/分钟摇床中振荡培养24h，再按3%接种量扩大培 养 24h。
[0019] 1. 2芽孢杆菌菌剂制备及有机磷农药降解的作用。
[0020] 将扩大培养的菌液按5%的接种量接入发酵罐中，32°C培养48小时得到发酵液，往 发酵液中加入质量比为10%碳酸钙和质量比为10%的碳酸氢钠，振荡摇匀5min得到芽孢杆 菌菌体悬浮液。通过喷雾干燥得到固体颗粒菌剂。喷雾干燥条件为如表1所示。
[0021] 表1喷雾干燥条件
【权利要求】
1. 一株芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株为芽孢杆菌5^.)FZUL-33,已于 2014年8月15日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号： CGMCC No.9523。
2. -种如权利要求1所述的一株芽孢杆菌的菌剂制备方法，其特征在于：所述方法包 括以下步骤： (1) 菌种复苏：将所述芽孢杆菌FZUL-33 分.）种子菌接种到LB固体培养 基上，32°C，培养48h，备用； (2) 菌种活化：将LB固体培养基菌种接种到LB液体培养基中，32-35°C培养18-24h，得 到液体发酵种子培养液； (3) 菌种发酵：将液体发酵种子培养液按3%的接种量接种入发酵罐，32-35°C培养 36-48h，得到芽孢杆菌发酵液； (4) 在发酵液中按5%-10%的质量比通过无菌操作添加碳酸钙、碳酸氢钠作为喷雾干燥 保护剂，振荡使悬浮均匀，制得菌体悬浮液，备用； (5) 将所得菌体悬浮液进行喷雾干燥工艺得到干燥菌剂，进料浓度为20-30wt. %，进料 量 10_20ml/min。
3. 根据权利要求2所述的一株芽孢杆菌的菌剂制备方法，其特征在于：所述菌株LB 固体培养基成分为胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化钠1%，琼脂1. 5%，其余为水，pH为 7. 2; LB液体培养基成分为胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化钠1%，其余为水，pH为7. 2。
4. 根据权利要求2所述的一株芽孢杆菌的菌剂制备方法，其特征在于：步骤（5)中 喷雾干燥条件为：进风温度为ll〇°C -150°C，出风温度为60°C -90°C，进样速度为5-10ml/ min〇
5. 根据权利要求2所述的一株芽孢杆菌的菌剂制备方法，其特征在于：步骤（4)中碳 酸钙含量为5wt. %-12wt. %，碳酸氢钠含量为5wt. %-10wt. %。
6. -种如权利要求2所述的方法制备得到的菌剂。
7. 根据权利要求6所述的的方法制备得到的菌剂，其特征在于：该菌剂在24-48h内降 解农药用地中75%以上的乙酰甲胺磷。
8. 根据权利要求6所述的的方法制备得到的菌剂，其特征在于：该菌剂降解有机磷农 药的适宜pH为7-9。
9. 一种如权利要求6所述的菌剂在有机磷农药降解中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104371954SQ201410560193
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】程扬健, 林文挺, 韩冉, 许心雅, 黄振 申请人:福州大学