专利名称：靶向血管紧张素原的rna干扰片段、其表达载体、混合克隆细胞株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及RNA干扰及应用领域，更具体地说是涉及靶向血管紧张素原的RNA干扰片段、其表达载体及其应用。
背景技术：
肾素一血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System, RAS)是生理功能复杂的内分泌系统，已确定与人类心脑血管疾病、糖尿病、肝脏、肾脏疾病等有密切的关系，其源头即为血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)。近年的研究发现机体脂肪组织中存在RAS的所有成分，提示RAS与脂肪细胞的分化和增殖有密切关系，而脂肪细胞的异常分化与增殖又是导致肥胖的直接原因。RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)是近年来迅速发展起来的一项高效基因研究技术，在哺乳动物细胞中利用该技术成功阻断基因的表达，可实现细胞水平的基因敲除。通过干扰脂肪细胞中AGT基因的表达以抑制RAS发挥作用，达到抑制前脂肪细胞分化的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于:提供一种靶向血管紧张素原的RNA干扰序列，能干扰降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成。 本发明要解决的另一技术问题在于:提供一种针对血管紧张素原的RNAi片段构建的表达载体，能降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成。本发明要解决的又一技术问题在于:提供一种混合克隆细胞株，降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成。本发明要解决的再一技术问题在于:提供靶向血管紧张素原的RNA干扰片段在抑制肥胖形成中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:提供一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段，其序列为SEQ ID N0.1。进一步地，所述血管紧张素原是针对鼠前脂肪细胞内的血管紧张素原。所述鼠血管紧张素原AGT基因的cDNA序列NM007428，其序列表为SEQ ID N0.2。本发明还提供一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体，该表达载体含有所述的RNA干扰片段。该表达载体具有图1a所示的结构。所述的祀向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体,插入载体的siR结构为表I所示siR-AGT对应的结构。
本发明进一步提供一种混合克隆细胞株，能降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成，是由所述靶向血管紧张素原的RNA干扰片段构建表达载体质粒并转染前脂肪细胞株而建立的。所述的混合克隆细胞株具体由下述步骤制得的:
步骤1:RNAi干扰片段SiR的设计；
步骤2:以设计好的RNAi干扰片段siR插入载体psiRNAT-U6.1/NeoRNAi而构建及合成表达载体质粒PsiR ；
步骤3:以表达载体质粒PsiR转染鼠前脂肪细胞3T3-L1，并建立混合克隆株。进一步地，所述步骤2具体为:RNAi干扰片段siR插入载体psiRNAT_U6.1/NeoRNAi构建并合成表I的siR-AGT寡聚核苷酸单链后，再经退火成双链RNAi片段，PsiRNAT-U6.1/Neo载体经BamH I和Hind III双酶切成线性载体，最后经T4连接酶与双链RNAi片段连接构建成PsiR表达载体质粒，表达载体结构为图la。本发明还提供靶向血管紧张素原的RNA干扰片段用于抑制肥胖的应用。本发明的有益效果如下:
由于本发明设计的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段siR经过克隆入载体，转入前脂肪细胞中，血管紧张素原在转录后表达水平明显下调，同时前脂肪细胞向成熟细胞的分化也明显受到抑制，因此本发明所涉及的干扰序列可以用于抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，具有降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成的用途。
图1是本发明实施例构建的重组载体质粒psiRNAT-U6.1/Neo的图谱；其中图1(a)为PsiR重组载体结构，代表插入siR干扰片段后的质粒图谱；图1 (b)为PsiRO重组载体结构图，代表插入siRO干扰片段后的质粒图谱。图2是本发明实施例的RNAi表达载体测序结果图，其中图(a)为PsiR测序结果图，图(b)为PsiRO测序结果图；框内标示分别为siR和siRO的序列，I代表碱基G、2代表碱基A、3代表T、4代表C。图3是本发明实施例荧光定量PCR检测结果示意图，其中图(a)为AGT，β -actinreal-time PCR扩增图，图(b)为AGT，β-actin real-time PCR溶解曲线；图中曲线I 4为β -actin，其中曲线I 2为转染PsiR质粒的细胞，曲线3 4为转染PsiRO质粒的细胞；曲线5 8为AGT，其中曲线5 6为转染PsiRO质粒的细胞，曲线7 8为转染PsiR。图4是本发明实施例转染PsiRO细胞在诱导分化后的油红O染色X 100倍图。图5是本发明实施例转染PsiR沉默组细胞在诱导分化后的油红O染色X 100倍图。图6是本发明实施例3T3-L1细胞转染重组质粒后分化过程中脂质含量的变化曲线。图7是本发明实施例转染重组质粒对鼠前脂肪细胞分化过程中GPDH活性的影响示意图，其中*表示差异显著0.01〈*P〈0.05。图8是本发明实施例抑制脂肪细胞AGT表达的电泳结果检测结果图。
具体实施例方式以下具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。本发明靶向血管紧张素原的RNA干扰序列的设计，是从NCBI数据库中查找鼠血管紧张素原AGT基因的cDNA序列NM007428，如序列表SEQ ID N0.2，根据siRNA设计原则，从开放阅读框的起始密码(ATG)开始，寻找二个连续的腺嘌呤序列后的19个碱基序列为备选革巴序列。以Ambion公司提供的在线siRNA设计软件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html) siRNA Target finder 来设计祀序列。为了提高 RNAi 的抑制效率，筛选I条19bp长的靶序列，为避免siRNA非特异性抑制同源性较高的其它基因，利用BLAST软件，对备选祀序列同源性分析(http://www.ncbinlm.nih.gov/blast),确保无非特异性沉默。序列如SEQ ID N0.1，结构式为:
siR:GCACTCATTTGTTCAGAGC
以上述siR的RNAi片段构建表达载体，同时还设计一条不针对任何基因的19bp的序列(siRO)，作为阴性对照，序列为:siRO:GCGCTGAGTA CTTCGAAAT
以设计好的序列以及所选定的载体psiRNAT-U6.1/Neo (载体psiRNAT_U6.1/Neo购自GenScript公司)为基础,分别设计出与之互补的反向序列，正向与反向序列之间用LOOP环(TTGATATCCG)连接，确保单链分别包括BamH I酶切粘性末端互补片段、19个碱基靶序列、LOOP环、19个碱基靶序列的互补序列、终止信号以及Hind III酶切粘性末端的互补片段共六个区域，分别命名为siR-AGT和siRO-AGT，其序列请参照表I。设计并委托上海生工生物工程有限公司合成寡聚核苷酸单链siR-AGT和siRO-AGT，用水溶解到25ymol/L，90°C加热lOmin，室温静置lh，使之退火成双链RNAi。PsiRNAT-U6.1/Neo载体经BamH I和Hind III双酶切成线性载体，再经T4连接酶与双链RNAi片段连接，构建成两种载体，分别命名为PsiR、PsiRO，其质粒图谱见图1，并经测序正确，测序结果见图2。其中，图1的载体质粒psiRNAT-U6.1/Neo图谱，由GenScript公司提供，图1 (a)为PsiR重组载体结构，代表插入siR干扰片段后的质粒图谱，图1(b)为PsiRO重组载体结构图，代表插入siRO干扰片段后的质粒图谱。PsiR中siR基因即为本发明中所设计的靶向AGT序列的干扰序列siR - AGT, siRO基因即为本发明中所设计的非靶向AGT序列的对照序列siRO - AGT0图2是本发明实施例的RNAi表达载体测序结果图，载体质粒与干扰片段重组后，将重组载体寄至上海生工生物工程股份有限公司，使用ABI测序仪进行测序，其中图2 (a)为PsiR测序结果图，图2 (b)为PsiRO测序结果图；框内标示分别为siR和siRO的序列，测序结果证明所设计的靶向AGT序列的干扰序列siR — AGT及对照序列siRO - AGT已插入载体，图2中数字I代表碱基G、2代表碱基A、3代表T、4代表C。以上述构建得到的表达载体PsiR、PsiRO，转染鼠前脂肪细胞株3T3-L1，并建立混合克隆细胞株，包括以下步骤:
1.转染:鼠前脂肪细胞3T3-L1(来源于广州中国科学院广州生物医药与健康研究所)按照2 X IO4个/孔接种于24孔板中，371:，5%(￥八)0)2(此处5%指二氧化碳培养箱所调节的CO2 体积比浓度，v/v)用 10% (m/m)FCS (fetal bovine serum,胎牛血清)+DMEM (Dulbecco改良Eagle培养基，简称DMEM)培养基培养，到细胞汇合至90%，更换无抗生素无血清FCS的DMEM培养基培养过夜。利用Lipofectamine2000试剂，将各组质粒PsiR、PsiRO分别转染入3T3-L1鼠前脂肪细胞株中。2.建立混合克隆细胞株:为了排除未转染干扰质粒细胞的影响，转染48小时后，加入含600 μ g/mL G418进行筛选，10 14天后建立定点转染混合克隆细胞株。经实验证明，本发明设计的干扰质粒PsiR、PsiRO能降低3T3-L1细胞中血管紧张素原AGT的表达，干扰减低鼠血管紧张素原mRNA表达量约46%以上，蛋白水平表达量约43.9%。同时脂肪细胞分化程度降低，这表明针对鼠血管紧张素原的RNAi序列能够抑制脂肪细胞的分化，有可能抑制脂肪的形成。实施例1RNAi片段的设计
从NCBI数据库中查找鼠血管紧张素原AGT基因的cDNA序列(NM007428，见序列表SEQID N0.2，根据siRNA设计原则，从开放阅读框的起始密码(ATG)开始，寻找二个连续的腺嘌呤序列后的19个碱基序列为备选靶序列。以Ambion公司提供的在线siRNA设计软件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html) siRNA Target finder 来设计靶序列。为了提高RNAi的抑制效率，筛选I条19bp长的靶序列，命名为siR。为避免siRNA非特异性抑制同源性较高的其它基因，利用BLAST软件，对备选靶序列同源性分析(http://www.ncbinlm.nih.gov/blast),确保无非特异性沉默。此外,还设计一条不针对任何基因的19bp的序列(siRO)，作为阴性对照，两条序列送由上海生工合成，具体序列见下:siR:GCACTCATTTGTTCAGAGCsiRO:GCGCTGAGTACTTCGAAAT。实施例2RNAi表达载体的构建
以设计好的序列以及所选定的载体psiRNAT-U6.1/Neo (购自GenScript公司)为基础，分别设计出与之互补的反向序列，正向与反向序列之间用LOOP环(TTGATATCCG)连接，确保单链分别包括BamH I酶切粘性末端互补片段、19个碱基靶序列、LOOP环、19个碱基靶序列的互补序列、终止信号以及HindIII酶切粘性末端的互补片段共六个区域。如表1:
表1插入psiRNAT-U6.1/Neo线性载体的寡聚核苷酸片段
权利要求
1.一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段，其序列为SEQ ID N0.1。
2.如权利要求1所述的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段，其特征在于:所述血管紧张素原是针对鼠前脂肪细胞内的血管紧张素原。
3.如权利要求2所述的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段，其特征在于:所述鼠血管紧张素原AGT基因的cDNA序列NM007428，其序列表为SEQ ID N0.2。
4.一种祀向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体,其特征在于:该表达载体含有权利要求I 3中任一项所述的RNA干扰片段。
5.如权利要求4所述的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体，其特征在于:该表达载体具有图1a所示的结构。
6.如权利要求5所述的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体，其特征在于:插入载体的siR结构为表I所示siR-AGT对应的结构。
7.一种混合克隆细胞株，能降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成，其特征在于:是由权利要求1 3中任一项所述靶向血管紧张素原的RNA干扰片段构建表达载体质粒并转染前脂肪细胞株而建立的。
8.如权利要求7所述的混合克隆细胞株，其特征在于:具体由下述步骤制得的:步骤I =RNAi干扰片段siR的设计； 步骤2:以设计好的RNAi干扰片段siR插入载体psiRNAT-U6.1/NeoRNAi而构建及合成表达载体质粒PsiR ； 步骤3:以表达载体质粒PsiR转染鼠前脂肪细胞3T3-L1，并建立混合克隆株。
9.如权利要求7所述的混合`克隆细胞株，其特征在于:所述步骤2具体为:RNAi干扰片段siR插入载体psiRNAT-U6.1/NeoRNAi构建并合成表I的siR-AGT寡聚核苷酸单链后，再经退火成双链RNAi片段，PsiRNAT-U6.1/Neo载体经BamH I和Hind III双酶切成线性载体，最后经T4连接酶与双链RNAi片段连接构建成PsiR表达载体质粒，表达载体结构为图1a0
10.如权利要求1 2中任一项所述靶向血管紧张素原的RNA干扰片段用于抑制肥胖的应用。
全文摘要
本发明涉及一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段其序列为如序列表SEQ ID NO.1，还涉及其表达载体以及用于抑制肥胖的应用。由于本发明的干扰序列siR经过克隆入载体，转入前脂肪细胞中，血管紧张素原在转录后表达水平明显下调，同时前脂肪细胞向成熟细胞的分化也明显受到抑制，因此本发明所涉及的干扰序列可以用于抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，具有降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成的用途。
文档编号C12N15/113GK103103192SQ20131001868
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者黄志立, 张丽君, 伍丽华 申请人:深圳职业技术学院