专利名称：重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(PorcineIteproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirus, PRRSV)感染所导致的病毒性急性传染病。该病可以感染任何年龄的猪，临床上以繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高发病率和高死亡率、持续性感染和免疫抑制为主要特征，对世界养猪业产生了极大的危害。2005年的一份报告表明，该病每年给美国养猪业造成的损失就有5.6亿美元，给全球养猪业造成的损失将更大。目前，PRRSV已经形成全球性大流行，成为影响养猪业的主要疾病因素之一，给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV为单股、正链、不分节段且有囊膜的RNA病毒。病毒粒子呈球形，直径为45-80nm，有25-35nm的立方体核心。基因组全长约15kb，5’末端为具有甲基化的帽子结构，3’末端为多聚腺甘酸(polyA)尾,包含10个开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF)。大部分ORF基因结构末端都和相邻的ORF有部分重叠,只在编码非结构蛋白(non-structuralprotein, NSP)的ORFlb和编码第一个结构蛋白的0RF2a之间存在I个碱基的间隔。病毒的复制受到转录调控序列(transcription-regulatorysequences, TRS)的控制，在5’非翻译区存在一段前 导转录调控序列(leader TRS)，在每个ORF前面都有各自的体转录调控序列(body TRS)(如调控0RF6转录的TRS命名为TRS6，位于0RF5 3’端、0RF6之前)，通过体转录调控序列与前导转录调控序列的结合完成各个亚基因组mRNA的转录。对不同地域的分离株序列分析表明，PRRSV有2种基因型，即欧洲型(代表株为Lelystad病毒，LV)和美洲型(代表株为ATCC VR-2332株)，二者核苷酸的同源性约为60%，血清学特性不同。美洲型毒株之间的差异性较大，而欧洲型毒株之间则相对保守。美洲型和欧洲型毒株虽然在基因组核苷酸序列和血清学上差异很大，但其二者具有相同的复制机制，均可引起相似的临床症状。2006年5月我国自南方地区开始爆发了高致病性(highly pathogenic，HP)“蓝耳病”，主要特征为高热、食欲下降、蓝耳、腹泻、高发病率和高死亡率，其波及全国25个省份，经济损失巨大。与传统毒株感染后只有妊娠母猪和仔猪发病不同，高致病性PRRSV感染后各种年龄、不同性别的猪群均可发病，发病猪体温升高至41°C以上，精神沉郁，采食量下降或食欲废绝；耳后耳缘发绀，呈现“蓝耳”，乳头、外阴、腹部、尾部等肢体末端多处皮肤有紫色斑块；呼吸困难，部分猪出现严重的腹式呼吸，有的表现喘气或不规则呼吸；部分患猪鼻分泌物增多，咳嗽、打喷嚏、眼部分泌物增多，出现结膜炎症状；个别病猪濒死前不能站立，全身抽搐。此次爆发时猪群发病率为50-100%，死亡率为20-100%。中国动物疾病控制中心的权威统计表明，截止到2006年9月，此次疫情影响了约212万头猪，造成至少40万头猪死亡，平均死亡率为19.68%。所有病死猪剖检后均可见肺肿胀、变硬，部分猪肺伴有出血；所有猪均出现不同程度的肺炎，大多数都是混合感染肺炎，间质明显增宽，间质内有大量淋巴细胞浸润。已经证实其主要病原为NSP2基因部分缺失为特征的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)。研究表明，这些分离株在NSP2上均存在30个氨基酸的不连续缺失。但后来的研究表明，这30个氨基酸的不连续缺失与高致病性PRRSV的毒力增强并没有直接关系。高致病性PRRSV毒力增强的具体机制还有待进一步研究。到目前为止仍没有有效治疗高致病性“蓝耳病”的药物，因此开发出一种有效的疫苗对该病进行预防显得尤其重要。目前商品化的PRRS疫苗主要包括:由经典毒株制备的弱毒疫苗、由高致病毒株制备的灭活苗以及由高致病毒株经过连续传代制备的弱毒苗。然而由于经典毒株与高致病毒株序列的差异性导致经典毒株制备的弱毒疫苗对高致病毒株的保护性不够全面；灭活疫苗往往不能诱导很好的细胞免疫反应，由于PRRSV的逃逸作用又使得体液免疫反应的效果一般；由高致病毒株经过连续传代制备的弱毒苗又存在毒力返强的风险，且无法与野生型毒株进行很好的区分，使得疫病爆发后不能确定到底是由于野生型毒株导致的还是由于弱毒疫苗株发生了毒力返强。因此，构建出一种既能很好的保护猪免于高致病性PRRSV的危害又能很好的与野生型毒株进行区分的弱毒疫苗将具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用。本发明所提供的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒为重组高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株。本发明所提供的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，是将野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA进行替换或缺失得到的重组病毒；所述替换为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的结构蛋白0RF2a、结构蛋白0RF2b、结构蛋白0RF3、结构蛋白0RF4、结构蛋白0RF5a和结 构蛋白0RF5这六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分替换为标记蛋白的编码RNA ;所述缺失为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的所述六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分进行缺失。在本发明中，所述结构蛋白0RF2a的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第11983-12753位；所述结构蛋白0RF2b的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第11988-12209位；所述结构蛋白0RF3的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第12606-13370位；所述结构蛋白0RF4的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第13151-13687位；所述结构蛋白0RF5a的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第13688-13828位；所述结构蛋白0RF5的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第13698-14300位。所述标记蛋白可为绿色荧光蛋白，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列3所示。在本发明中，所述绿色荧光蛋白的编码RNA反转录的cDNA序列为将序列表中序列2 的第 11990-12709 位。在本发明的一个实施例中，所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I。具体的，本发明所提供的所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组RNA反转录的cDNA序列如下:将序列表中序列2的第12716-15057位替换为序列2的第12716-12755位或序列2的第15018-15057位，同时保持序列2的其他核苷酸不变。其中，序列I共由15320位核苷酸组成，第14245-14284位为猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株基因组自身携带的TRS6序列；序列2共由16093位核苷酸组成，第11983-12755位的序列为与序列I相比多出的序列，序列2的第12716-12755位和第15018-15057位序列相同，为用于发生同源重组的TRS6序列。本发明所提供的制备所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，具体可包括如下步骤:(I)将序列表中序列2所示的DNA片段克隆至真核表达载体中，得到重组载体；(2)用步骤(I)的重组载体转染哺乳动物细胞；在所述哺乳动物细胞中，所述重组载体中序列2所示的DNA片段，通过序列2上第12716-1755位和第15018-15057位所示的两个TRS6序列发生同源重组，致使序列2的第12716-15057位替换为序列2的第12716-12755位(或第15018-15057位)所示的一个TSR6序列，从而获得所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。在上述方法中，所述真核表达载体可为pcDNA3.1(+);所述哺乳动物细胞可为293FT细胞或293T细胞。所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在如下(a)_ (C)中的应用也属于本发明的保护范围:(a)制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗；(b)制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物；(C)制备诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征的产品。任何通过插入TRS6序列从而获得发生了同源重组的弱毒疫苗及其制备方法均属于本发明的保护范围内。本发明的再一个目的是提供如下(al)或(a2)的生物材料:(al)含有所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的离体动物细胞或重组菌；(a2)含有所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组RNA或cDNA的载体。本发明所提供的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒对于高致病性猪繁殖与呼吸综合征有很好的预防作用，与传统传代致弱方法得到的疫苗相比具有更高的安全性，外源标记基因GFP的表达还便于对该弱毒疫苗进行监控。
图1为插入额外转录单元的重组质粒pcDNA3.1M- A HV-GFP的构建的示意图。图2为转染重组质粒pcDNA3.1M- A HV-GFP至293FT细胞后直接观察外源基因GFP的表达，左图为荧光照片，右图为同一视野下的白光照片。图3为同源重组的验证 结果。其中，A为三种病毒的PCR检测琼脂糖凝胶电泳图；B为通过real-time PCR检测各代弱毒疫苗rHV_GFP中发生了同源重组的基因组所占的比例的结果；C为弱毒疫苗rHV-GFP同源重组区域的模式图。
图4为对野生型毒株HV (WT)、病毒rHV (CK)以及弱毒疫苗rHV_GFP (实验组)体外性状的比较结果。其中，A为三种病毒在肺泡巨噬细胞上的生长曲线(病毒滴度测定结果)，B为分别感染三种病毒36小时后肺泡巨噬细胞的死亡率统计结果。A和B中，*表示差异显著(p〈0.05)。图5为等量接种三种病毒至四周龄小猪后，三种病毒的体内性状比较结果。其中，A为小猪的存活情况，B为小猪直肠温度的变化情况，C为小猪血清中的病毒滴度测定结果。图6为接种三种病毒后的小猪脏器的病理检测结果。图7为弱毒疫苗rHV-GFP对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株HV和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株JX感染的保护力测定结果。其中，A、D是小猪的存活情况，B、E是直肠温度的变化情况，C、F是小猪血清中的病毒滴度测定结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pcDNA3.1(+)质粒:Invitrogen 公司产品。293FT 细胞:Invitrogen 公司产品。猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolar macrophages, PAMs):记载在 “LianghaiWang, Hexiao Zhang, Xiong Suo, et al.1ncrese of CD163 but not sialoadhesin oncultured peripheral blood monocytes is coordinated with enhanced susceptibilityto porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection.VeterinaryImmunology and Immunopathology, 141 (2011):209-220”一文中，公众可从中国农业大学获得。另外，Rural Technologies公司也有销售,其网址详见如下:http://ruraltechinc.com/diagnostic-reagents/porcine-pulmonary-alveolar-macrophages-pams/高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JX株(HP-PRRSV strain JX):记载在“Lianghai Wang, Jun Hou, Hexiao Zhang, et al.Complete Genome Sequence of a NovelHighly Pathogenic Poricne Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Variant.J.Virol, 2012, 86 (23):13121.” 一文中，公众可从中国农业大学获得。实施例1、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HV毒株的分离与鉴定一、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HV毒株的分离2007年6月，从我国北京爆发高致病性“蓝耳病”的猪场取回病猪的脏器作为病料，用液氮研磨成粉末，加入适量RPMI1640培养液重悬后冻融三次，离心取上清液，然后用0.22 ii m的滤器过滤得到病料上清。接种该上清至猪肺泡巨曬细胞(porcine alveolarmacrophages, PAMs)，在37°C培养，当60%_80%的细胞出现病变时收毒并继续传代，获得病
毒上清。二、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HV毒株的鉴定1、蛋白水平鉴定将步骤一所得的病毒上清感染猪肺泡巨曬细胞(porcine alveolarmacrophages, PAMs)后，用针对PRRSV N蛋白的特异性抗体(Rural Technologies公司产品)进行间接免疫荧光染色，发现接种病毒上清后的细胞呈阳性，证明步骤一所得病毒上清中的病原确实是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，将其命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株。2、基因水平鉴定进一步，根据猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株序列的保守区域(GenBank:EF641008.UEF112445.1以及U87392.3)设计若干对测序引物，将HV毒株基因组RNA反转录为cDNA后，进行全基因组测序，拼接得到的序列如序列表中序列I所示。测序结果发现HV毒株具有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的特有标志:NSP2区域中90个碱基的不连续缺失(序列I中第1339-4836位为NSP2基因序列，与GenBank:U87392.3所示的NSP2基因序列相比，缺失GenBank:U87392.3的第2779-2781位和2938-3024位)。另外，对序列I按照PRRSV不同蛋白解析如下:第190-7611位核苷酸为非结构蛋白ORFla的编码序列，第7599-11981位核苷酸为非结构蛋白ORFlb的编码序列，第11983-12753位核苷酸为结构蛋白0RF2a的编码序列，第11988-12209位核苷酸为结构蛋白0RF2b的编码序列，第12606-13370位核苷酸为结构蛋白0RF3的编码序列，第13151-13687位核苷酸为结构蛋白0RF4的编码序列，第13688-13828位核苷酸为结构蛋白0RF5a的编码序列，第13698-14300位核苷酸为结构蛋白0RF5的编码序列，第14285-14809位核苷酸为结构蛋白0RF6的编码序列，第14799-15170位核苷酸为结构蛋白0RF7的编码序列。再则，序列I的14245-14284位为病毒自身所携带的转录调控序列(TRS6)。3、致病性鉴定将HV毒株按照2 X IO7TCID5tl的用量接种至4周龄小猪(北京市SPF猪育种管理中心)，接种后10天内发现所有猪均发病(出现高烧、咳嗽、呼吸困难、厌食、浑身颤抖等临床症状)并且最终死亡。即HV毒株表现出高发病率与 高死亡率。以上三方面的结果显示PRRSV HV毒株完全符合HP-PRRSV的特点，将其鉴定为HP-PRRSVo实施例2、重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的制备一、携带有HV毒株基因组的重组质粒的构建分析实施例1中测得的HV毒株的基因组全长序列(序列1)，挑选出了 6个用于分段拼接基因组全长序列的酶切位点，分别为Smi1、Xho1、Af II1、Cla1、EcoRV和NotI。HV毒株的基因组全长序列(序列I)中含有酶切位点XhoI(序列I的第3400位，以及第6901位)、AflII (序列I的第6465位)、ClaI (序列I的第8798位)和EcoRV (序列I的第12071位)的识别序列，而不含有酶切位点SmiI和NotI的识别序列。通过基因组上的四个酶切位点将基因组全长分为5个片段，同时将酶切位点SmiI和NotI分别添加到病毒基因组的两端，再将5个片段按照其在病毒基因组中的排列次序插入到真核表达载体中，得到携带有病毒基因组的重组质粒。具体如下:1、用于基因组序列拼接的改造质粒pcDNA3.1M的构建将真核表达载体pcDNA3.1 (+)的多克隆位点区域的酶切位点进行改造，使其与上述6个酶切位点(5!^1、父11014乜11、(:1&1、￡(301^和吣《)—致。具体如下:设计引物对3.1F和3.1R用于质粒的改造，其中引物3.1R的反向互补序列的前18个碱基与 pcDNA3.1(+)质粒上紧接着 TATA box (TATATAA,pcDNA3.1(+)质粒的第 804-810位)的序列(对应于pcDNA3.1 (+)质粒的第811-828位)一致；接下来是酶切位点SmiI的识别序列ATTTAA I AT (AT可以直接作为病毒基因组的前两个碱基)，使得pcDNA3.1 (+)质粒上TATA box和病毒基因组第一个碱基之间的碱基数调整为24 ;再接下来是酶切位点XhoI的识别序列和酶切位点AflII识别序列(CTTAAG)的前4个碱基。引物3.1F包含酶切位点AflII识别序列的后2个碱基、酶切位点Clal、EcoRV和NotI的识别序列，3’端的18个碱基与pcDNA3.1 (+)质粒上的BGH引物结合位点的序列(pcDNA3.1 (+)质粒的第1022-1039位)一致。将引物用T4多核苷酸激酶(Takara公司产品)按照说明书进行磷酸化处理，然后用高保真的Phusion DNA聚合酶(Finnzymes公司产品)以pcDNA3.1 (+)为模板进行PCR扩增，将扩增产物切胶回收后用T4连接酶(NEB公司产品)进行连接并转化DH5 a感受态。挑取单克隆并提取得到的重组质粒。将所得重组质粒进行测序验证，结果表明该重组质粒为将pcDNA3.1(+)的第829-1021位替换成了序列表中序列4所示的多克隆位点连接片段，将该重组质粒命名为pcDNA3.1M，用于拼接病毒基因组全长序列。2、携带有HV毒株基因组的重组质粒pcDNA3.1M-HV的构建根据实施例1中测得的HV毒株的基因组全长序列(序列1)，以及个选定的6个酶切位点(Smil、XhoI, AflII, Clal、EcoRV和NotI)，分别设计扩增所述5个片段的引物对:HPlF和HPlR (用于扩增片段1)，HP2F和HP2R (用于扩增片段2)，HP3F和HP3R (用于扩增片段3)，HP4F和HP4R (用于扩增片段4)和HP5F和HP5R (用于扩增片段5)，见表I。用试剂盒E.Z.N.A.Viral RNA Kit (OMEGA bio-tek公司产品)提取实施例1所得的猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株的基因组RNA，由于RNA长达15kb，故分别用随机引物(Random 6mers)和Oligo dT (15) (Takara公司产品)将RNA反转录成cDNA。由随机引物(Random6mers)合成的cDNA用作片段1_4扩增的模板，由Oligo dT (15)合成的cDNA用作片段5扩增的模板。利用高保真的Phusion DNA聚合酶(Finnzymes公司产品)进行PCR扩增，将5个PCR产物均进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并用rTaq (Takara公司产品)进行末端加A，然后分别与pMDlS-T载体(Takara公司产品)连接得到5个重组质粒。对于每个重组质粒挑选至少3个克隆进行测序，依据连接片段的不同，将测序正确的5个重组质粒依次命名为 pMD18-T-HPl、pMD18-T-HP2、pMD18-T-HP3、pMD18-T-HP4 和 pMD18_T_HP5。分别将5个片段(以上5个重组质粒)通过双酶切连接至步骤I构建的改造质粒pcDNA3.1M，具体为:将片段I (重组质粒PMD18-T-HP1)用SmiI和XhoI双酶切，酶切后与经过同样酶切的改造质粒pcDNA3.1M相连，得到中间质粒I ;将片段2 (重组质粒pMD18-T-HP2)用XhoI和AflII双酶切，酶切后与经过同样酶切的中间质粒I相连，得到中间质粒2 ;将片段3 (重组质粒pMD18-T-HP3)用AflII和ClaI双酶切，酶切后与经过同样酶切的中间质粒2相连，得到中间质粒3 ;将片段4 (重组质粒pMD18-T-HP4)用ClaI和EcoRV双酶切，酶切后与经过同样酶切的中间质粒3相连，得到中间质粒4 ;将片段5 (重组质粒pMD18-T-HP5)用EcoRV和NotI双酶切，酶切后与经过同样酶切的中间质粒4相连，得到重组质粒。将经测序表明在改造质粒pcDNA3.1M的酶切位点SmiI和NotI之间插入了序列表中序列2的第3-10693位所示DNA片段的重组质粒命名为pcDNA3.1M-HV,该重组质粒即为携带有HV毒株基因组全长cDNA克隆的重组质粒。表I PCR引物序列
权利要求
1.一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，是将野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA进行替换或缺失得到的重组病毒；所述替换为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的结构蛋白0RF2a、结构蛋白0RF2b、结构蛋白0RF3、结构蛋白0RF4、结构蛋白0RF5a和结构蛋白0RF5这六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分替换为标记蛋白的编码RNA ;所述缺失为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的所述六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分进行缺失。
2.根据权利要求1所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于:所述结构蛋白0RF2a的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第11983-12753位；所述结构蛋白0RF2b的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第11988-12209位；所述结构蛋白ORF3的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第12606-13370位；所述结构蛋白0RF4的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第13151-13687位；所述结构蛋白ORF5a的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第13688-13828位；所述结构蛋白ORF5的编码RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I的第13698-14300位。
3.根据权利要求1或2所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于:所述标记蛋白为绿色突光蛋白；所述绿色突光蛋白的氣基酸序列如序列表中序列3所7]^。
4.根据权利要求3所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于:所述绿色荧光蛋白的编码反转录的cDNA序列为序列表中序列2的第11990-12709位。
5.根据权利要求1-4中任一所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于:所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HV株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列I。
6.根据权利要求1-5中任一所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于:所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组RNA反转录的cDNA序列如下:将序列表中序列2的第12716-15057位替换为 序列2的第12716-12755位或序列2的第15018-15057位，序列2的其他核苷酸不变。
7.备权利要求6所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括如下步骤: (1)将序列表中序列2所示的DNA片段克隆至真核表达载体中，得到重组载体； (2)用步骤(I)的重组载体转染哺乳动物细胞，从而获得所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述真核表达载体为pcDNA3.1(+)； 所述哺乳动物细胞为293FT细胞或293T细胞。
9.权利要求1-6所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在如下(a)- (c)中的应用: Ca)制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗； (b)制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物； (c)制备诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征的产品。
10.下(al)或(a2)的生物材料: (al)含有权利要求1-6中任一所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的离体动物细胞或重组菌； (a2)含有权利要求1-6中任一所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组RNA或cDNA的载体。
全文摘要
本发明公开了一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其制备方法与应用。本发明所提供的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒是将野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA进行替换或缺失得到的重组病毒；所述替换为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的结构蛋白ORF2a、结构蛋白ORF2b、结构蛋白ORF3、结构蛋白ORF4、结构蛋白ORF5a和结构蛋白ORF5这六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分替换为标记蛋白的编码RNA；所述缺失为将所述野生型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA中的所述六种结构蛋白的编码RNA的全部或部分进行缺失。实验证明，本发明所提供的重组病毒对于高致病性猪繁殖与呼吸综合征有很好的预防作用，对于猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的研制具重要意义。
文档编号C12N15/63GK103087996SQ20131001871
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者封文海, 王良海, 侯隽, 高丽, 郭雪坤, 余志彬, 朱耀华, 刘翼浩, 唐军 申请人:中国农业大学