专利名称：动物融合重组型干扰素的制作方法
技术领域：
本发明关于一种动物融合重组型干扰素，特别是关于一种具有抗动物病毒活性的融合重组型干扰素。
背景技术：
干扰素最早是在1957年由英国学者Alick Isaacs和Jean Lindenmann在进行流感病毒试验中所发现，当细胞遭受病毒感染后，会立即制造一种细胞激素，诱发邻近细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒的复制。该细胞激素随后被命名为干扰素(Interferon，IFN)。干扰素的抗病毒作用，主要是由第一型干扰素(IFNci/￠)所负责。干扰素除了具有抗病毒作用外，还具有抗肿瘤、促进细胞分化和免疫调节等功用。目前市面上的干扰素制剂，多为针对人类所开发设计，例如:用来治疗人类B型与C型肝炎等病毒性疾病以及卡波西氏瘤(Kaposi’ s sarcoma, KS)、黑色素肿瘤(malignantmelanoma)等肿瘤疾病上的干扰素。至于经济动物方面，以干扰素治疗病毒性疾病的情形并不普遍。若无有效的疫苗来预防某一动物病毒，当畜群受该病毒感染时，只能使用支持性疗法处理，但效果往往不彰，而造成畜牧业重大损失；因此，动物干扰素的开发，对动物保健产业而言，可说是刻不容缓且极为重要的事。
发明内容
本发明于第一部份中提供一种动物融合重组型干扰素。由于干扰素属于小分子蛋白质，在体内半衰期短(约2-8小时)且不稳定，因此本发明所提供的动物融合重组型干扰素是将动物干扰素蛋白与半衰期较长的动物免疫球蛋白IgG-Fc片段融合，而形成较稳定的动物融合重组型干扰素。于一较佳实施例中，该动物干扰素蛋白以及该动物免疫球蛋白IgG-Fc片段是以由甘氨酸(Glycine, G)及丝氨酸(Serine, S)组成的连接子(linker)所连接起来的。于一实施例中，该干扰素蛋白为猪干扰素a，该猪干扰素a系与如SEQ IDNos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45 及 47 所示之氨基酸序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该猪干扰素 a 选自于由如 SEQ ID Nos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所示之氨基酸序列所组成之群组中至少一者。于一实施例中，该动物免疫球蛋白IgG-Fc片段为猪免疫球蛋白IgG-Fc片段，该猪免疫球蛋白IgG-Fc片段与如SEQ ID Nos:4、49、51、53及55所示之氨基酸序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该猪免疫球蛋白IgG-Fc片段选自 于由如SEQ ID Nos:4、49、51、53及55所示之氨基酸序列所组成之群组中至少一者。于一实施例中，该连接子系与如SEQ ID No:6所示之氨基酸序列具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该连接子具有如SEQ IDNo:6所示之氨基酸序列。于一实施例中，该动物融合重组型干扰素系与如SEQ ID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221 及 223 所示之氨基酸序列其中之一具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该动物融合重组型干扰素系选自于由如SEQID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221 及 223 所示之氨基酸序列所组成之群组。本发明于第二部分中提供一种编码上述动物融合重组型干扰素的多核苷酸。本发明所提供之动物融合重组型干扰素是藉由基因转殖技术而得。首先将编码动物干扰素蛋白的DNA序列，以及编码动物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列选殖到表现载体系统中，形成含有编码动物融合重组型干扰素之DNA序列的质体，再将该质体转殖到表现系统中，经诱导蛋白质表现后而得到动物融合重组型干扰素。于一较佳实 施例中，除了将编码动物干扰素蛋白的DNA序列以及编码动物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列选殖到表现载体系统中，并将编码由甘氨酸及丝氨酸组成的连接子(linker)的DNA序列选殖到该表现载体系统中，以连接该编码动物干扰素蛋白的DNA序列以及编码动物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列。于一实施例中，该编码动物干扰素蛋白的DNA序列系与如SEQ ID Nos:l、16、18、
20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44及46所示之DNA序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该编码动物干扰素蛋白的 DNA 序列系选自于由如 SEQ ID Nos:l、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42>44及46所示之DNA序列所组成之群组中至少一者。于一实施例中，该编码动物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列与如SEQ IDNos:3、48、50、52及54所示之DNA序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,99%序列同源性。于一较佳实施例中，该编码动物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列选自于由如SEQ ID Nos:3、48、50、52及54所示之DNA序列所组成之群组中至少一者。于一实施例中，该编码由甘氨酸及丝氨酸组成的连接子(linker)的DNA序列与如SEQ ID No: 5所示之DNA序列具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该编码由甘氨酸及丝氨酸组成的连接子的DNA序列系具有如SEQ ID No: 5所示之DNA序列。于一实施例中，该编码动物融合重组型干扰素的DNA序列与如SEQ ID Nos:7、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220及222所示之DNA序列具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该编码动物融合重组型干扰素的DNA序列具有如SEQ ID Nos:7、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220 及 222所示之DNA序列。
该表现载体可为原核生物表现载体或真核生物表现载体。该原核生物表现载体包含但不限于PET系列表现载体以及pGEX系列表现载体。该真核生物表现载体包含但不限于pSecTag系列表现载体。该表现系统可为原核生物表现系统(如:细菌)或真核生物表现系统(如:酵母菌、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞等)。于一实施例中，该表现系统为大肠杆菌(Escherichia coli)。于另一实施例中，该表现系统为哺乳动物细胞。可用于本发明动物融合重组型干扰素表现的哺乳动物细胞包含但不限于3T3细胞、中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamster ovary cells, CHO cells)、幼鼠肾细胞(baby hamster kidney cells, BHKcells)、人类子宫颈癌细胞(HeLa cells)，以及人类肝癌细胞0fepG2 cells)等。本发明于第三部分中提供一种以哺乳细胞产制本发明的动物融合重组型干扰素的优化制程。将带有编码本发明的动物融合重组型干扰素的多核苷酸的哺乳细胞先以含有血清的培养基培养，待该细胞生长稳定后，再改为无血清培养基培养，于每隔1-5天更换新的无血清培养基，并收取细胞培养基，以获得本发明的动物融合重组型干扰素。该哺乳动物细胞包含但不限于3T3细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO cells)、幼鼠肾细胞(BHK cells)、人类子宫颈癌细胞(HeLa cells)，以及人类肝癌细胞0fepG2 cells)等。于一实施例中，该哺乳细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO cells)。该血清包含但不限于牛血清以及马血清。于一实施例中，该血清为胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)。该血清在培养基中的含量为0.l_10%(v/v);于一实施例中，该血清含量为5%(v/v)。本发明于第四部分中提供一种动物融合重组型干扰素在制备动物抗病毒药物中的用途。经试验证明，本发明所提供的动物融合重组型干扰素具有抗病毒效果。分别以DNA病毒(如:伪狂犬病病毒，pseudorabies virus, PRV)以及RNA病毒(如:猪繁殖与呼吸道综合症病毒，porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)为体夕卜试验(in vitro)测试对象，测试本发明动物融合重组型干扰素的抗病毒活性。结果显示，本发明动物融合重组型干扰素可以有效抑制DNA病毒以及RNA病毒的宿主细胞内的增殖，且抗病毒效果优于未与动物免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的动物干扰素。因此，本发明所提供的动物融合重组型干扰素可用来抑制动物病毒在动物体内增殖。本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
图1A为带有编码猪融合重组型干扰素基因的质体转染至CHO细胞后，以Zeocin抗生素筛选后以IFA分析的结果；图1B为pSecTag2(B)载体转染至CHO细胞后，以Zeocin抗生素筛选后以IFA分析的结果。图2为 将带有编码猪融合重组型干扰素基因的质体或将pSecTag2 (B)载体转染至CHO细胞后，以Zeocin抗生素筛选后以ELISA分析的结果。图3为以不同抗体侦测带有编码猪融合重组型干扰素基因的CHO细胞所表现的蛋白中是否含有猪融合重组型干扰素的结果；第I道:带有编码猪融合重组型干扰素基因的CHO细胞所表现的蛋白的SDS-PAGE分析图；第2道:以mouse anti IFN a单株抗体分析；第3道:以mouse anti His单株抗体分析；第4道:以goat anti porcine IgG抗体分析。图4为猪融合重组型干扰素(P IFN-Fc组)及未与猪免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素(P IFN组)的抗PRRS病毒及抗PR病毒的活性比较。
具体实施例方式实施例一猪干扰素a I基因选殖取三品系杂交猪(LXY-D)的血液分离外围血液单核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell, PBMC),并以异硫氰酸狐(guanidine thiocyanate, GTC)法萃取总RNA (total RNA)。接着将萃取的总RNA进行反转录聚合酶连锁反应(reverse polymerasechain reaction, RT-PCR);先将萃取的RNA以70°C作用3分钟后，将含有20 总RNA、101115叉反应液、81111.251111 (1见1\11113’端互补引子、11111蒸馏水、0.5111 RNasin 以及0.5 ill AMV反转录酶的反应管置于42°C作用30分钟，以进行cDNA合成；再将合成后的cDNA进行聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)以增殖猪干扰素a I基因(P IFNa I)，在反应管中加入 IOii I cDNA、5iill0x PCR 反应液、8 y 11.25mM dNTP、liil5’端正向引子、IP 13’端反向引子、24iU蒸馏水、Iiil Taq聚合酶，混合均匀后放入PCR反应器中(Applied Biosystems GeneAmp PCR system2400),反应条件为先以 95°C 5 分钟将DNA变性，接着以95 °C I分钟、55°C 30秒、72°C 30秒进行30个循环，最后以72 °C 5分钟完成PCR反应。其中，猪干扰素^1基因$ IFNa I)的特异性引子序列如下:正向引子(IFN-Fl):5，-CCCAAGCTTATGGCCCCAACCTCAGCC-3，(SEQ ID NO:9)HindIII
反向引子(IFN-Rl):
权利要求
1.一种动物融合重组型干扰素，包含一动物干扰素以及一动物免疫球蛋白Fe片段。
2.如权利要求1所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物干扰素以及该动物免疫球蛋白Fe片段是由一连接子所连接。
3.如权利要求1或2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物干扰素具有一氨基酸序列，该氨基酸序列选自于由SEQ ID Nos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所组成之群组中至少一者。
4.如权利要求1或2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物干扰素具有一氨基酸序列，该氨基酸序列与选自于由SEQ ID Nos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所组成之群组至少一者的序列具有至少80%序列同源性。
5.如权利要求1或2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物免疫球蛋白Fe片段具有一氨基酸序列，该氨基酸序列选自于由SEQ ID Nos:4、49、51、53、及55所组成之群组中至少一者。
6.如权利要求1或2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物免疫球蛋白Fe片 段具有一氨基酸序列，该氨基酸序列与选自于由SEQ ID Nos:4、49、51、53、及55所组成之群组至少一者的序列具有至少80%序列同源性。
7.如权利要求2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该连接子具有如SEQIDNo: 6所示之序列。
8.如权利要求2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该连接子具有一氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No:6所示之序列具有至少80%序列同源性。
9.如权利要求2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物融合重组型干扰素具有一氨基酸序列，该氨基酸序列选自于由SEQ ID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221 及 223 所组成之群组。
10.如权利要求2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物融合重组型干扰素具有一氨基酸序列，该氨基酸序列与选自于由SEQ ID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221 及 223 所组成之群组之一的序列具有至少80%序列同源性。
11.一种编码如权利要求1所述之动物融合重组型干扰素的多核苷酸。
12.—种制备一动物融合重组型干扰素的方法，包含将带有如权利要求11所述之多核苷酸的哺乳细胞以含有血清的培养基培养至该细胞生长稳定后，更换为无血清培养基继续培养，并于每隔I至5天更换新的无血清培养基以及收获该动物融合重组型干扰素。
13.如权利要求12所述之方法，其中该含有血清的培养基的血清含量为0.1至10体积百分比。
14.一种如权利要求1所述之动 物融合重组型干扰素在制备动物抗病毒药物中的用途。
全文摘要
本发明关于一种动物融合重组型干扰素，包含一动物干扰素以及一动物免疫球蛋白Fc片段。该动物干扰素以及该动物免疫球蛋白Fc片段进一步可由一连接子所连接。本发明并关于一种编码该动物融合重组型干扰素的多核苷酸、一种制备该动物融合重组型干扰素的方法，以及该动物融合重组型干扰素的用途。
文档编号C12P21/02GK103214579SQ20131002007
公开日2013年7月24日 申请日期2013年1月18日 优先权日2012年1月19日
发明者郭村勇, 吴忠晋, 陈汉婷 申请人:施怀哲维克生物科技股份有限公司