专利名称：青海弧菌q67b及其分离筛选和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及青海弧菌Q67B及其分离筛选和应用，属微生物学的发光细菌分离筛选和应用的技术领域。青海弧菌Q67B是淡水发光菌。从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集淡水发光菌，经分离、纯化、筛选后，得到一种新的淡水发光菌种菌株，16SrDNA序列分析表明，该菌属弧菌属，定名为“青海弧菌Q67B”。2010年I月28日将其送交武汉市中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO :M2010104。
背景技术：
发光菌是一大类能自身发出荧光的细菌，在条件合适时，其发光恒定。若发光菌接触到有毒有害物质时，其发光就会受抑制，抑制程度与所接触的毒物的毒性大小和毒物的浓度有关。因此发光菌可用于检测样品的生物学毒性。上世纪八十年代，发光菌就己被用于环境污染的检测。我国也于1995年发布了将发光菌用于水环境污染的毒性检测的国家标准。但不管国际还是国内，均使用来源于海洋的海洋发光菌，该发光菌适应海洋的高盐度(相当于NaCl的质量百分浓度为3%)和高渗透压的环境条件，否则无法生长，更不会发光。当用于陆地淡水样品时，必须在淡水样品中添加NaCl，直至淡水样品中NaCl的最终质量百分浓度为3%，否则淡水样品中的海洋发光菌很快就丧失发光能力，甚至细菌的细胞因低渗透压而吸水破裂，无法继续进行检测。上世纪九十年代，随着发光菌应用于环境污染的毒性检测日益增多，许多研究者发现，对有些种类的淡水样品，其检测结果往往与其它生物检测结果不太吻合，尤其是那些含有重金属盐的样品。究其原因，乃对淡水样品添加NaCl所致。所以有研究者改用葡萄糖取代NaCl来调节渗透压，使之与质量百分浓度为3%的NaCl溶液等渗，但效果并不理想，检测结果的重复性较差。这是因为海洋发光菌必需要有一定浓度的Na离子存在时才能保持良好而稳定的发光性能，缺乏Na离子的环境对海洋发光菌的发光是不利的，必然影响到海洋发光菌发光的稳定性，最终导致检测结果的严重偏差。如果使用不需要Na离子并适应较低的渗透压就能正常发光的淡水发光菌作为检测用发光细菌，对淡水样品就不必添加NaCl， 避免了应用海洋发光菌作为检测用发光细菌的不足。
发明内容
本发明的一个目的是公开一种青海弧菌Q67B，其特征在于，(I)形态特征该菌的菌体呈杆状微弯，大小介于O. 5 O. 7微米X1. 5 2微米，革兰氏染色阴性，用利夫生鞭毛染色，观察到单极生鞭毛似蝌蚪状，细胞内累积聚β_羟基丁酸；(2)生理生化特征该菌适于生长的温度范围和pH范围分别为4°C 40°C和PH5 pHIO，对弧菌抑制剂2，4- 二氨基-6，7- 二异丙基喋啶敏感，具有耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在介于质量百分浓度0% 8%之间的NaCl溶液中生长和发光；(3)基因特征16SrDNA序列AGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGG
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详细说明本发明的技术方案。一种分离筛选青海弧菌Q67B的方法，其特征在于，具体操作步骤第一步获取淡水发光菌 (I)取新鲜的青海省青海湖所产的青海鳇鱼，截成小段，室温下放置10小时 24小时，在暗室内检视，在发绿色荧光的亮点处，用灭菌的接种针括取，划线于培养皿内，(2)将第一步(I)所述的培养皿置于暗室中，20°C培养10小时 18小时，从中挑取发光良好的单菌落，(3)对第一步(2)所述的单菌落进行划线分离培养三 五次，取得单细胞纯培养物，转接于斜面试管，培养生长后得斜面菌种，即淡水发光菌，保存于4°C冰箱备用，(4)所述的培养皿和斜面试管内需用固体培养基，该固体培养基的配方为，MgSO4
2.47g, MgCO3 O. 79g, MgBr2 O. 09g, MgCl2O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0. 122g, NaCl 8. 29g,Mg(HCO3)2 0. 50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，琼脂20g，溶于IOOOmL蒸馏水中，ρΗ9· 0，121°C灭菌20分钟，贮于4°C的冰箱备用；第二步温度适应性筛选(I)将第一步(3)所得的斜面菌种，转接于五 十支斜面试管，(2)将第二步(I)所述的斜面试管置于暗室中，20°C培养16小时 18小时，检查发光状况，选出发光良好的菌支，(3)将第二步(2)选出的菌支分别转接于五 十支斜面试管，(4)将第二步(3)所述的试管置于暗室中，20°C培养16小时 18小时，检查发光状况，选出发光良好的菌支，(5)将第二步(4)选出的菌支分别划线转接于十个平皿，平分成两组，为第I组和第II组，分别于4°C和40°C培养16小时 18小时，(6)另取十个平皿，平分成两组，为第III组和第IV组，每组五个平皿，暗室中挑取第I组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第III组的五个平皿，暗室中挑取第II组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第IV组的五个平皿，将第III组和第IV组分别于40°C和4°C培养16小时 18小时，(7)另取十支斜面试管，分别对应上述第III组和第IV组的每个平皿，将各平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于十支对应斜面试管中，20°C培养16小时 18小时，(8)另取五支斜面试管，选取第二步(7)所述的十支斜面试管中发光良好的五个斜面，分别转接到五支斜面试管中，得到五支斜面菌种，保存于4°C冰箱内备用，(9)所述的斜面试管和平皿内需用固体培养基，该固体培养基与上述的第一步需用的固体培养基完全相同，(10)经第二步温度适应性筛选操作后所得的菌种，具有耐低温4°C和耐高温40°C的性能； 第三步pH值适应性筛选(I)取第二步的(8)所得的斜面菌种，分别转接于pH5. O和pHll. O的液体培养基中，各为五瓶，20°C振荡培养16小时 18小时， (2)在经第三步(I)操作后的pH5. O和pHll. O液体培养物中，各选取其中发光良好的培养物，进行交换转接，即将PH5. O液体培养基中选中的菌种转接于pHll. O液体培养基中，而将pHll. O液体培养基中选中的菌种转接于pH5. O液体培养基中，20°C振荡培养16小时 18小时，(3)另取十个平皿，在经第三步(2)操作后的液体培养基中，分别选取pH5. O和pHll. O中发光良好的培养物为菌种，将选中的菌种分别划线于平皿中，来源于pH5. O和pHll. O的各五个平皿，20°C培养16小时 18小时，( 4 )取十个斜面试管，在经第三步(3 )操作后的十个平皿中，各选取发光良好的单菌落，将每一个选中的单菌落各自转接于所述的斜面试管中，共十支，20°C培养16小时 18小时，选取其中发光良好的斜面试管6支，得到经pH值适应性筛选的菌种，贮于4°C的冰禮备用，(5)第三步需用固体培养基，该固体培养基与第一步和第二步需用的固体培养基完全相同，第三步需用液体培养基，该液体培养基的配方为，MgSO4 2. 47g, MgCO3 O. 79g，MgBr2 O. 09g, MgCl2O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0.122g，NaCl 8. 29g, Mg (HCO3) 2 0.50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，溶于IOOOmL蒸馏水中，分别用柠檬酸和氨水调节它们的pH，得到pH值分别为PH5. O和pHll. O的液体培养基，121°C灭菌20分钟，固体培养基和液体培养基贮于4°C的冰箱备用；第四步毒物反应灵敏性筛选采用两种有代表性的毒物=HgCl2和苯酚，分别以倍增梯度浓度系列观察淡水发光菌对上述毒物反应的大小，以相对发光强度和EC50大小为衡量毒物抑制淡水发光菌的指标，利用下式计算相对发光强度
权利要求
1.一种青海弧菌Q67B，其特征在于，(1)形态特征该菌的菌体呈杆状微弯，大小介于O.5 O. 7微米X1. 5 2微米，革兰氏染色阴性，用利夫生鞭毛染色，观察到单极生鞭毛似蝌蚪状，细胞内累积聚β_羟基丁酸；(2)生理生化特征该菌适于生长的温度范围和pH范围分别为4°C 40°C和pH5 PH10，对弧菌抑制剂2，4- 二氨基-6，7- 二异丙基喋啶敏感，具有耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在介于质量百分浓度0% 8%之间的NaCl溶液中生长和发光；(3)基因特征16SrDNA序列
2.根据权利要求1所述的青海弧菌Q67B，其特征在于，该菌最适于生长的温度和pH值分别为25°C的和pH9.0。
3.一种分离筛选权利要求1所述的青海弧菌Q67B的方法，其特征在于，该菌经过四个步骤，筛选得到第一步获取淡水发光菌，从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集到的发光菌，经分离纯化，获得淡水发光菌；第二步温度适应性筛选，在两个不同的温度下对第一步获得的淡水发光菌进行温度适应性筛选；第三步PH值适应性筛选，在两个不同的pH值下对第二步获得的淡水发光菌进行PH值适应性筛选；第四步毒物反应灵敏性筛选，用重金属盐和有机毒物对第三步获得的淡水发光菌先后进行两次毒物反应灵敏性筛选。
4.根据权利要求3所述的分离筛选方法，其特征在于，所述的两个不同的温度是4°C和 40。。。
5.根据权利要求3所述的分离筛选方法，其特征在于，所述的两个不同的pH值是 ρΗ5· O 和 pHll. O。
6.根据权利要求3所述的分离筛选方法，其特征在于，所述的重金属盐和有机毒物分别是HgCl2和苯酚。
7.根据权利要求3、4、5或6所述的分离筛选方法，其特征在于，具体操作步骤第一步获取淡水发光菌(1)取新鲜的青海省青海湖所产的青海鳇鱼，截成小段，室温下放置10小时 24小时， 在暗室内检视，在发绿色荧光的亮点处，用灭菌的接种针括取，划线于培养皿内，(2)将第一步(I)所述的培养皿置于暗室中，20°C培养10小时 18小时，从中挑取发光良好的单菌落，(3)对第一步(2)所述的单菌落进行划线分离培养三 五次，取得单细胞纯培养物，转接于斜面试管，培养生长后得斜面菌种，即淡水发光菌，保存于4°C冰箱备用，(4)所述的培养皿和斜面试管内需用固体培养基，该固体培养基的配方为，MgSO4.2.47g, MgCO3 O. 79g, MgBr2 O. 09g, MgCl2 O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0. 122g, NaCl 8. 29g, Mg(HCO3)2 0. 50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，琼脂20g，溶于IOOOmL蒸馏水中，ρΗ9· 0， 121°C灭菌20分钟，贮于4°C的冰箱备用；第二步温度适应性筛选(1)将第一步(3)所得的斜面菌种，转接于五 十支斜面试管，(2)将第二步(I)所述的斜面试管置于暗室中，20°C培养16小时 18小时，检查发光状况，选出发光良好的菌支，(3)将第二步(2)选出的菌支分别转接于五 十支斜面试管，(4)将第二步(3)所述的试管置于暗室中，20°C培养16小时 18小时，检查发光状况， 选出发光良好的菌支，(5)将第二步(4)选出的菌支分别划线转接于十个平皿，平分成两组，为第I组和第II 组，分别于4°C和40°C培养16小时 18小时，(6)另取十个平皿，平分成两组，为第III组和第IV组，每组五个平皿，暗室中挑取第I组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第III组的五个平皿，暗室中挑取第II组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第IV组的五个平皿，将第III组和第IV组分别于40°C和4°C培养16小时 18小时，(7)另取十支斜面试管，分别对应上述第III组和第IV组的每个平皿，将各平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于十支对应斜面试管中，20°C培养16小时 18小时，(8)另取五支斜面试管，选取第二步(7)所述的十支斜面试管中发光良好的五个斜面， 分别转接到五支斜面试管中，得到五支斜面菌种，保存于4°C冰箱内备用，(9)所述的斜面试管和平皿内需用固体培养基，该固体培养基与上述的第一步需用的固体培养基完全相同，(10)经第二步温度适应性筛选操作后所得的菌种，具有耐低温4°C和耐高温40°C的性第三步pH值适应性筛选(1)取第二步的(8)所得的斜面菌种， 分别转接于pH5.O和pHll. O的液体培养基中，各为五瓶，20°C振荡培养16小时 18小时，(2)在经第三步(I)操作后的pH5.O和pHl1. O液体培养物中，各选取其中发光良好的培养物，进行交换转接，即将pH5. O液体培养基中选中的菌种转接于pHl1. O液体培养基中，而将pHll. O液体培养基中选中的菌种转接于pH5. O液体培养基中，20°C振荡培养16小时 18小时，(3)另取十个平皿，在经第三步(2)操作后的液体培养基中，分别选取pH5.O和pHll. O 中发光良好的培养物为菌种，将选中的菌种分别划线于平皿中，来源于pH5. O和pHll. O的各五个平皿，20°C培养16小时 18小时，(4)取十个斜面试管，在经第三步(3)操作后的十个平皿中，各选取发光良好的单菌落， 将每一个选中的单菌落各自转接于所述的斜面试管中，共十支，20°C培养16小时 18小时，选取其中发光良好的斜面试管6支，得到经pH值适应性筛选的菌种，贮于4°C的冰箱备用，(5)第三步需用固体培养基，该固体培养基与第一步和第二步需用的固体培养基完全相同，第三步需用液体培养基，该液体培养基的配方为，MgSO4 2. 47g, MgCO3 O. 79g, MgBr2O.09g, MgCl2 O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0. 122g, NaCl 8. 29g, Mg (HCO3) 2 0. 50g，酵母膏 5g，胰胨5g，3g，溶于IOOOmL蒸馏水中，分别用柠檬酸和氨水调节它们的pH，得到pH值分别为PH5. O和pHll. O的液体培养基，121°C灭菌20分钟，固体培养基和液体培养基贮于 4°C的冰箱备用；第四步毒物反应灵敏性筛选采用两种有代表性的毒物=HgCl2和苯酚，分别以倍增梯度浓度系列观察淡水发光菌对上述毒物反应的大小，以相对发光强度和EC50大小为衡量毒物抑制淡水发光菌的指标,利用下式计算相对发光强度样品发光强度相对发光强度(％)=对照发光强度X 100% [I],EC50指相对发光强度为50%时的毒物浓度，测光仪为上海植物生理研究所出品的生物和化学测光计，(1)取第三步(5)得到的6支菌种，分别经二次斜面转接活化后，分别用蒸馏水洗下菌苔，充分混匀后，分别得到6支淡水发光菌液，用发光检测法评估它们对毒物的反应，先评估它们对HgCl2的反应，每次仅用I支淡水发光菌液，操作如下在8个测量杯中各加2ml HgCl2样品，形成浓度梯度系列，每亇浓度设2个平行，空白对照用蒸馏水，也设2个平行，然后逐个加入所述的那支淡水发光菌液的菌液，使测量杯中的淡水发光菌浓度为5X107/ml，作用15分钟，立即测定各测量的发光强度，最后以对照发光值作基准，利用公式[I]计算相对发光强度，并推算出EC50值，其余5支作相同的操作， 用EC50值判断上述的6支淡水发光菌对同一毒物的反应能力，EC50值越小，表示该菌种的菌株的毒物反应越灵敏，筛选得到对HgCl2反应最为灵敏的菌种3株，分别制成斜面，进行下述测试筛选，(2)取第四步(I)得到的3株菌种的斜面，分别经二次斜面转接活化后，分别用蒸馏水洗下菌苔，充分混匀后，分别得到3支淡水发光菌液，用发光检测法评估它们对苯酚的反应，每次仅用I支淡水发光菌液，操作如下在8个测量杯中各加2ml苯酚样品，使形成浓度梯度系列，每亇浓度设2个平行，空白对照用蒸馏水，也设2个平行，然后向各测量杯内逐个加入上述的那支淡水发光菌液，使测量杯中的淡水发光菌浓度为5X107/ml，作用15分钟，立即测定各测量的发光强度，最后以对照发光值作基准，利用公式[I]计算相对发光强度，并推算出EC50值，其余2支作相同的操作，比较上述检测所得的3个EC50值，取EC50值最小的，与最小EC50值对应的菌株就是分离筛选得到的青海弧菌Q67B。
8.一种用权利要求1所述的青海弧菌Q67B检测毒物的生物毒性的方法，其特征在于， 具体操作步骤第一步菌液制备取青海弧菌Q67B的菌种斜面I支，转接于试管斜面上，20°C培养18 小时，再转接一次，20°C培养18小时，发光明亮，用蒸馏水Iml 2ml洗下斜面上的菌苔，转入烧杯，稀释至光密度0D600为O. 03，得到菌液，立即用于以下操作；弟~■步被测样品溶液制备若被测样品为固体，用质量百分浓度介于0% 8%的NaCl溶液配制浓度分别为O.1mg/ L、lmg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L的被测样品溶液，若被测样品为液体，用质量百分浓度介于0% 8%的NaCl溶液稀释成如下浓度梯度的被测样品溶液100% (V/V)、75% (V/V)、 50% (V/V),25% (V/V),10% (V/V)；第三步发光检测取测光仪的专用测量杯12个，将第二步所述的每种浓度的被测毒物溶液注入2个测量杯，注入量为2ml，在余下的2个测量杯，各注入2ml质量百分浓度介于 0% 8%的NaCl溶液，作空白对照，为每个测量杯注入第一步制备的菌液，注入量为50μ 1， 15分钟后，用测光仪测量各测量杯的发光强度，按下式计算各测量杯的相对发光强度样品发光强度相对发光强度(％)= 对照发光强度X 100%;第四步得到被测毒物的EC50值以相对发光强度为纵座标，被测样品浓度为横座标， 将第三步的计算得到的相对发光强度分别记在各自的对应的被测毒物溶液的浓度位点上， 找出的相对发光强度50%时对应的被测毒物溶液的浓度，就是被测毒物的EC50值。
全文摘要
本发明涉及青海弧菌Q67B(CCTCC NOM2010104)及其分离筛选和应用，属微生物学的发光细菌分离筛选和应用的技术领域，该菌是从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集到的发光菌，经分离纯化，再经温度适应性筛选，又经pH值适应性筛选，最后经毒物反应灵敏性筛选，得到的一种淡水发光菌。该菌在清洁水体中发光恒定，接触到毒物，其发光强度会明显衰减，据此可推定毒物的毒性大小及毒物的浓度。在用于地表水如内陆河流湖泊、地下水及排放污水的毒性检测时，可在10℃～37℃下进行，无需调节水样渗透压和pH值，10～15分钟内就可判别水样的毒性大小，快速、方便、灵敏。上述优点是海洋发光菌所不具备的。
文档编号C12R1/63GK103045524SQ20131001967
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者朱文杰 申请人:朱文杰