用于防治白蚁的内生菌混合生物发酵产物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种防治白蚁的生物发酵产物的制备方法。
【背景技术】
[0002] 白蚁是极具破坏性的害虫，世界范围内均有分布，被列为世界性的五大害虫之一。 白蚁的危害无孔不入、无处不在，造成巨大的经济损失，且其繁殖速度快、活动隐蔽。生物防 治法是利用病原微生物或者内生菌生物发酵代谢产物来防治白蚁的一种方法，该法具有高 效、无污染、成本低等特性，现已成为白蚁防治的主要方法。植物内生菌生物发酵代谢产物 可以促进植物生长、提高植物抗逆性、抗虫害，为获得天然产物及开发新药提供了一个巨大 的生物资源库。
[0003] 我国多年来一直用氯丹、灭蚁灵等有机氯农药来防治白蚁，由于有机氯农药对环 境的污染和对人类健康的危害，一些国家已经相继禁用，而我国尚未有良好的替代品。因 此，迫切需要有高效、低毒、对环境影响小且相对比较经济的杀虫剂来改善我国目前白蚁防 治现状。
【发明内容】
[0004] 本发明是要解决现有防治白蚁的化学药剂对环境和人类危害大，防治效果较差的 问题，提供用于防治白蚁的内生菌混合生物发酵产物的制备方法。
[0005] 本发明用于防治白蚁的内生菌混合生物发酵产物的制备方法，按以下步骤进行：
[0006] -、菌株的活化：挑取解藻朊类芽孢杆菌HDZK-BYB36转接到牛肉膏蛋白胨固体斜 面培养基中，于37°C恒温培养24h;挑取枯草芽孢杆菌HUB-I-47转接到牛肉膏蛋白胨固体 斜面培养基中，于37 °C恒温培养24h;
[0007] 二、挑取步骤一活化后的解藻朊类芽孢杆菌HDZK-BYB36转接到含有50mL牛肉膏 蛋白胨液体培养基的250mL培养瓶中，于170~180r/min、37°C回转式摇床中培养18~ 24h，得解藻朊类芽孢杆菌种子液；挑取步骤一活化后的枯草芽孢杆菌HUB-I-47转接到含 有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL培养瓶中，于170~180r/min、37°C回转式摇床 中培养18~24h，得枯草芽孢杆菌种子液；
[0008] 三、将步骤二制得的解藻朊类芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液等体积混合 后，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行混合发酵培养24~36h;
[0009] 四、发酵结束后，于5000r/min离心10~15min，使菌体和发酵液分开，得到发酵 液；
[0010] 五、从步骤四获得的发酵液中分离出能够高效毒杀白蚁的发酵代谢产物。
[0011] 本发明的有益效果：
[0012] 本发明采用微生物发酵法生产抗白蚁药剂，以此种生物药剂代替现有的以化学药 剂为主的抗白蚁药剂，既达到了防治白蚁的目的，又避免了环境污染。本发明内生菌混合生 物发酵代谢产物防治白蚁的方法中树木内生菌代谢产物对白蚁肠道菌有较好的抑制作用， 发酵代谢产物浓度为lOmg/mL和20mg/mL时，2~3d后，其白蚁死亡率（p< 0. 05)为100 %。 本发明制备的发酵代谢产物对白蚁也有显著的杀灭作用。本发明具有高效、无污染、成本低 等特性。
【具体实施方式】
[0013] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0014] 一：本实施方式用于防治白蚁的内生菌混合生物发酵产物的制备方 法，按以下步骤进行：
[0015] -、菌株的活化：挑取解藻朊类芽孢杆菌HDZK-BYB36转接到牛肉膏蛋白胨固体斜 面培养基中，于37°C恒温培养24h;挑取枯草芽孢杆菌HUB-I-47转接到牛肉膏蛋白胨固体 斜面培养基中，于37 °C恒温培养24h;
[0016] 二、挑取步骤一活化后的解藻朊类芽孢杆菌HDZK-BYB36转接到含有50mL牛肉膏 蛋白胨液体培养基的250mL培养瓶中，于170~180r/min、37°C回转式摇床中培养18~ 24h，得解藻朊类芽孢杆菌种子液；挑取步骤一活化后的枯草芽孢杆菌HUB-I-47转接到含 有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL培养瓶中，于170~180r/min、37°C回转式摇床 中培养18~24h，得枯草芽孢杆菌种子液；
[0017] 三、将步骤二制得的解藻朊类芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液等体积混合 后，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行混合发酵培养24~36h;
[0018] 四、发酵结束后，于5000r/min离心10~15min，使菌体和发酵液分开，得到发酵 液；
[0019] 五、从步骤四获得的发酵液中分离出能够高效毒杀白蚁的发酵代谢产物。
[0020] 本实施方式中解藻朊类芽孢杆菌HDZK-BYB36为解藻朊类芽孢杆菌 (Paenibacillusaliginolyticus)HDZK-BYB36,已在中文专利 201310192221. 9 中公开。
[0021] 枯草芽抱杆菌HUB-I-47为枯草芽抱杆菌新亚种（Bacillussubtitissubsp. virginianasubsp.nov)HUB-I_47,已在中文专利 201110261415. 0 中公开。
【具体实施方式】 [0022] 二：本实施方式与一不同的是：步骤三中混合发酵培 养的条件为：时间为24~36h，培养温度为30~32°C，摇床转速为170~180r/min。其它 与一相同。
【具体实施方式】 [0023] 三：本实施方式与一不同的是：步骤三中混合发酵培 养的条件为：时间为24h，培养温度为31°C，摇床转速为175r/min。其它与一 相同。
【具体实施方式】 [0024] 四：本实施方式与一至三之一不同的是：步骤三中牛 肉膏蛋白胨液体培养基的初始pH为7~8。其它与一至三之一相同。
【具体实施方式】 [0025] 五：本实施方式与一至三之一不同的是：步骤三中牛 肉膏蛋白胨液体培养基的初始pH为7. 5。其它与一至三之一相同。
【具体实施方式】 [0026] 六：本实施方式与一至五之一不同的是：步骤三中将 解藻朊类芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液混合接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中 的接种量为4%。其它与一至五之一相同。
【具体实施方式】 [0027] 七：本实施方式与一至六之一不同的是：步骤三中牛 肉膏蛋白胨液体培养基在500mL培养瓶中的装液量为100mL。其它与一至六 之一相同。
[0028] 为验证本发明的有益效果，进行以下试验：
[0029] 实施例1 :
[0030] 本实施例用于防治白蚁的内生菌混合生物发酵产物的制备方法，按以下步骤进 行：
[0031] -、菌株的活化：挑取解藻朊类芽孢杆菌HDZK-BYB36转接到牛肉膏蛋白胨固体斜 面培养基中，于37°C恒温培养24h;挑取枯草芽孢杆菌HUB-I-47转接到牛肉膏蛋白胨固体 斜面培养基中，于37 °C恒温培养24h;
[0032] 二、挑取步骤一活化后的解藻朊类芽孢杆菌HDZK-BYB36转接到含有50mL牛肉膏 蛋白胨液体培养基的250mL培养瓶中，于175r/min、37°C回转式摇床中培养22h，得解藻朊 类芽孢杆菌种子液；挑取步骤一活化后的枯草芽孢杆菌HUB-I-47转接到含有50mL牛肉膏 蛋白胨液体培养基的250mL培养瓶中，于175r/min、37°C回转式摇床中培养22h，得枯草芽 孢杆菌种子液；
[0033] 三、将步骤二制得的解藻朊类芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液等体积混合 后，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行混合发酵培养4d;
[0034] 四、发酵结束后，于5000r/min离心15min，使菌体和发酵液分开，得到发酵液；
[0035] 五、从步骤四获得的发酵液中分离出能够高效毒杀白蚁的发酵代谢产物。
[0036] 1、发酵液浸膏的制备
[0037] (1)将有机溶剂乙酸乙酯和菌体发酵液以等体积（V/V)比例混合装入500mL三角 瓶中，于室温、120r/min萃取24h。萃取结束后，将混合液倒入分液漏斗中，静止15min后出 现明显分层，分成有机相和水相，收集有机相待浓缩。
[0038] (2)将上一步得到的水相与正己烷以等体积（V/V)比例混合装入500mL三角瓶中， 于室温、120r/min萃取24h。萃取结束后，将混合液倒入分液漏斗中，静止15min后出现明 显分层，分成有机相和水相，收集有机相待浓缩。
[0039] (3)萃取后的有机溶剂萃取物在40°C条件下减压蒸馏浓缩，用5-10mL的正己烷将 粗提物洗下并保存到密封的离心管中，称重并记录浸膏质量，4°C冰箱保存。
[0040] 2、微生物混合发酵代谢产物初步分离
[0041] ⑴装柱
[0042] ①称取200-300目的柱层析硅胶Ikg置于IKTC烘箱中活化0. 5-lh。
[0043] ②用石油醚浸泡活化好的硅胶，搅拌使硅胶变成匀浆