一种提高灵芝菌发酵物中β-葡聚糖产量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高灵芝菌发酵物中β-葡聚糖产量的方法，采用中国普通微生物菌种保藏管理委员会保藏的灵芝菌种(Ganoderma lucidum)，菌株保藏号为CCGMC 5.0616，接种灵芝种子液后，在温度为27-30℃、转速为150-200r/min的回转式摇瓶柜中深层发酵2-5天，补加地鳖虫油50-80mg/L后，在温度为26-28℃、转速为150-200r/min条件下继续发酵6-9天结束，本发明方法的β-葡聚糖产量高达193.6mg/L。
【专利说明】一种提高灵芝菌发酵物中β-葡聚糖产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于真菌发酵【技术领域】，具体涉及一种提高灵芝β-葡聚糖产量的发酵工艺。
【背景技术】
[0002]灵芝(Ganodemalucidum(W.Curtis.:Fr.)P.Karst.)是最为名贵的森林大型真菌之一，在古代被称为“仙草”。现代药理学研究表明，灵芝具有很高的保健和药用价值。《中华人民共和国药典》早已正式收载灵芝为药品；卫生部也批准灵芝为食品新资源；《美国草药药典与治疗概要》也正式收载了灵芝。灵芝的研究已得到亚洲诸多国家，以及加拿大、美国和一些欧洲国家的重视。
[0003]灵芝的有效化学成分一直是人们关注的焦点。现已证实灵芝多糖和三萜是灵芝的关键药效成分。近十余年来，国内外学者对灵芝多糖的结构和药理作用进行了大量研究，揭示主链具有β - (I — 3) -D、β - (I — 6) -D、β - (I — 4) -D结构的灵芝β -多糖，特别是灵芝β -葡聚糖具有显著的生物活性，如具有调节免疫、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗衰老等功能，是灵芝发挥药效的重要物质基础之一。目前市场上仅有灵芝粗多糖(多糖提取物)或为灵芝总多糖相关产品，而灵芝β_葡聚糖及相关产品在国内外市场上很少，具有广阔的市场开发前景。
[0004]现阶段，获取灵芝相关产品有三种途径，一是从野生灵芝中获取，二是人工栽培灵芝子实体，三是通过现代生物发酵技术获得灵芝菌体和培养液(两者合称发酵菌物)。由于野生灵芝稀少，而传统的人工栽培方法周期长，产量低，β_葡聚糖含量低，β_葡聚糖生产成本极高，无法满足市场需要。而液体深层发酵技术生产灵芝具有生产周期短、产品质量和产量容易调控等特点，目前已成为获取灵芝及其活性物质的最有效方法。近年来，灵芝的液体发酵技术取得了很大进展，但都集中在灵芝总多糖的发酵技术研究方面，而灵芝葡聚糖发酵技术的研究十分薄弱，灵芝葡聚糖的产量很低。近二十年来，真菌葡聚糖作为高效的生物反应调节因子(BRM)，具有重要的研究价值和广阔的开发前景。因此，如何进一步提高灵芝中β -葡聚糖的产量，同时降低生产成本、提高经济效益，已成为加快灵芝产品产业化进程亟待解决的问题。
[0005]已有通过发酵法生产灵芝中总多糖和灵芝酸(灵芝三萜)的技术，但缺乏液体发酵法生产灵芝β -葡聚糖的技术，如:
[0006]文献:陈功明.灵芝多糖的液体发酵、提取纯化及其硫酸化改性研究.硕士学位论文，浙江大学，2010.报道了通过液体发酵技术生产灵芝多糖，以及对产品进行提取和纯化的方法，同时试验了对多糖进行硫酸化改性的技术。但没有针对β_葡聚糖进行液体发酵和提取纯化研究。
[0007]文献:王慧杰，李宇伟，连瑞丽，王志强，马爱民.灵芝多糖液体发酵条件优化(食用菌学报，2007)报道了从一系列灵芝菌种中筛选出多糖产量高、生长快的灵芝菌株，研究了不同氮源、碳源及金属离子对灵芝产多糖的影响，以及多糖液体发酵条件的优化技术，仍属于灵芝总多糖的发酵技术，未涉及灵芝β -葡聚糖的发酵技术。
[0008]文献:肖雷，姚菁华，吕兆启，谭才邓，廖延智，吴裕豪，龚燕媚，肖虹，吴晓燕，李平凡.灵芝液体发酵产胞内多糖的培养基优化(现代食品科技，2013)报道了灵芝在液体发酵过程中胞内多糖的培养基优化技术。也没有β_葡聚糖的的发酵技术和相关提高产量的技术。
[0009]中国专利:伟张，汤亚杰，申请号200810007833，提出了一种促进灵芝酸和灵芝多糖生物合成的发酵方法。该方法分别考察了 pH两阶段、溶氧两阶段控制策略或补料策略相互协同在一起后对灵芝酸和灵芝多糖生物合成的影响，提出一种促进灵芝酸和灵芝多糖生物合成的发酵方法。但研究对象仍是灵芝总多糖，未涉及灵芝β_葡聚糖。
[0010]中国专利:山东省农业科学院土壤肥料研究所，申请号2010102306901，提出了一种提高灵芝多糖产量的液体发酵方法。它利用灵芝细胞的液体培养，通过在培养基中添加稀土元素镨、钕或镧，提高灵芝多糖的产量，但仍是针对总多糖的技术，没有具体针对灵芝β-葡聚糖。
[0011]地鳘虫是鳘蠊科昆虫地鳘(Eupolyphaga sinensis Walker)的雌虫干燥体，是我国传统的药用昆虫。我们通过大量的实验发现，灵芝总多糖含量高时，灵芝的β_葡聚糖的量不一定最高。同时通过大量的筛选实验，找到了一种能针对性提高灵芝β_葡聚糖产量的虫类外源添加物质，即地鳖虫油，并对发酵策略及液体培养基进行了优化设计，形成了一种能显著提高灵芝发酵菌物中β_葡聚糖产量、且生产工艺简易的β_葡聚糖生产工艺，即发酵模式为发酵一段时间后补加β_葡聚糖产物促进因子(地鳖虫油)的全新的灵芝β-葡聚糖发酵技术。
【发明内容】
[0012]本发明的目的在于针对现有真菌β -葡聚糖发酵技术存在的种种不足，提供一种能显著提高灵芝菌发酵物中β_葡聚糖产量、且生产工艺简单、发酵时间相对较短的β_葡聚糖生产工艺。
[0013]为实现本发明目的，本发明的技术方案是:
[0014]—种提高灵芝菌发酵物中β -葡聚糖产量的方法:在灵芝(Ganoderma Iucidum)菌种液体发酵过程中添加地鳖虫油。
[0015]地鳖虫油的制备方法为，:虫体风干后，粉碎成细粉，用乙醚回流提取，抽滤获得乙醚提取液，用氮气反复吹干乙醚溶剂后，获得地鳖虫液态油。
[0016]地鳖虫油的更加具体的制备方法为:虫体自然风干后，粉碎成40-80目的细粉，用料液比为1:30-1:50g/mL的无水乙醚溶液在温度为20-33°C下回流提取2_3小时，抽滤获得乙醚提取液，用氮气反复吹干乙醚溶剂后，获得地鳖虫液态油。
[0017]上述方法中添加地鳖虫油的量为50_80mg/L。而且是将灵芝种子液接种到液体发酵培养基中深层发酵后，再添加地鳖虫油继续发酵。
[0018]具体是将灵芝种子液接种到液体发酵培养基中深层发酵2-5天后添加地鳖虫油，在温度为26-28°C、转速为150-190r/min继续发酵6_9天结束。
[0019]将灵芝菌种接种到蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，KH2PO4和MgSO4为矿物元素的种子培养基中，培养基组成为:蔗糖36-45g/L，蛋白胨6-9g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;然后在温度为27-30°C、转速为160-200r/min的摇瓶中发酵6_9天(装液量为容器体积的50-70% )，获得灵芝的种子液。
[0020]添加地鳖虫油之前先将灵芝种子液制备成菌体浓度为1.5-2.0g/L(以菌体干重计)的接种液，按体积比10-15%的比例接种到液体发酵培养基中深层发酵2-5天(装液量为容器体积的50-70% )。具体是将灵芝种子液制备成的接种液接种到蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，KH2PO4和MgSO4为矿物元素的液体发酵培养基中，培养基组成为:蔗糖40-46g/L，蛋白胨 6-9g/L，KH2PO4L 6g/L,MgSO40.76g/L ;然后在温度为 27_30°C、转速为 160_200r/min的摇瓶中深层发酵2-5天。本发明采用的灵芝菌株保藏号为CCGMC 5.0616。
[0021]本发明灵芝菌发酵物中β -葡聚糖提取和检测方法为:在发酵产物(菌体和发酵液)中加入4倍体积的饮用自来水,在85°C下回流提取3小时，5000r/min离心15min,除去菌体残渣，上清液在旋转蒸发器中浓缩至原体积的1/4，再加入4倍体积的工业酒精，沉淀获得总多糖。总多糖溶解于80°C热水溶液后，在溶液中加入Sevage试剂[氯仿:正丁醇=5:1 (v/v)]，振荡，离心弃去多糖中的蛋白等杂质，然后用刚果红比色法定量β -葡聚糖的含量。本发明采用中国普通微生物菌种保藏管理委员会保藏的灵芝(灵芝)菌种(Ganoderma Iucidum),菌株保藏号为CCGMC 5.0616。菌种的有关性质可以参阅中国普通微生物菌种保藏管理委员会(CCGMC)菌种目录，本发明不再详述。
[0022]与现有灵芝发酵技术相比，本发明具有以下优势:
[0023]I)本发明涉及的灵芝发酵技术针对性强，具体针对灵芝β_葡聚糖的现代发酵技术，不是传统的灵芝总多糖的发酵技术。
[0024]2)通过在灵芝发酵一段时间后补加适量的地鳖虫油，可显著提高灵芝发酵菌物中β_葡聚糖的产量，其产量高达193.6mg/L，远远高于未添加地鳖虫油的传统发酵的产量。
[0025]3)本发明的发酵工艺简单，且葡聚糖总的发酵时间较短，生产效率明显提高，适合工业化生产。
[0026]4)本发明添加的是可食用的地鳖虫油，且添加量很少，无毒副作用。
【具体实施方式】
[0027]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0028]实施例1:
[0029]地鳖虫油的制备:虫体自然风干后，粉碎成60目的细粉，用料液比为1:30 (m/v)的无水乙醚溶液在温度为25°C下回流提取2.3小时，抽滤获得乙醚提取液，用氮气反复吹干乙醚溶济后，获得地鳖虫液态油。
[0030]灵芝β_葡聚糖发酵:采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ganoderma Iucidum),保藏号:CCGMC 5.0616。
[0031]灵芝种子培养基组成:蔗糖37g/L，蛋白胨8g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;液体发酵培养基组成:蔗糖40g/L，蛋白胨7g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L。将菌丝块接种于含1.2L种子培养基的2L摇瓶中，在发酵温度为29°C、转速为180r/min的回转式摇瓶柜中发酵8天，获得种子液，以无菌水调成2.0g/L的浓度(以菌体干重计)，然后接种120mL种子液于含1.2L发酵培养基的2L摇瓶中。发酵温度为29°C，转速为190r/min，先发酵2天，然后一次性补加60mg/L地鳖虫油，在发酵温度为28°C，转速为170r/min条件下继续发酵7天，结束发酵，收获发酵物。
[0032]在发酵产物(菌体和发酵液)中加入4倍体积的饮用自来水，在85°C下回流提取3小时，5000r/min离心15min,除去菌体残洛,上清液在旋转蒸发器中浓缩至原体积的1/4,再加入4倍体积的工业酒精，沉淀获得总多糖。总多糖溶解于80°C热水溶液后，在溶液中加入Sevage试剂[氯仿:正丁醇=5:1 (V/V)],振荡,离心弃去多糖中的蛋白等杂质,然后用刚果红比色法定量β_葡聚糖的含量。结果β_葡聚糖的产量为171.9mg/L。
[0033]实施例2:
[0034]地鳖虫油的制备:虫体自然风干后，粉碎成80目的细粉，用料液比为1:40 (m/v)的无水乙醚溶液在温度为30°C下回流提取2.5小时，抽滤获得乙醚提取液，用氮气反复吹干乙醚溶济后，获得地鳖虫液态油。
[0035]灵芝β_葡聚糖发酵:采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ganoderma Iucidum),保藏号:CCGMC 5.0616。
[0036]种子培养基组成:蔗糖40g/L，蛋白胨8g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;液体发酵培养基组成:蔗糖42g/L，蛋白胨7g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L。将菌丝块接种于含1.2L种子培养基的2L摇瓶中，在发酵温度为27°C、转速为180r/min的回转式摇瓶柜中发酵9天，获得种子液，以无菌水调成2.0g/L的浓度(以菌体干重计)，然后接种120mL种子液于含1.2L发酵培养基的2L摇瓶中。发酵温度为28°C，转速为180r/min，先发酵5天，然后一次性补加70mg/L地鳖虫油，在发酵温度为27°C，转速为160r/min条件下继续发酵5天，结束发酵，收获发酵物。
[0037]产品的提取和分析方法同实施例1，结果β -葡聚糖的产量为166.lmg/L。
[0038]实施例3:
[0039]地鳖虫油的制备:虫体自然风干后，粉碎成60目的细粉，用料液比为1:50 (m/v)的无水乙醚溶液在温度为30°C下回流提取2小时，抽滤获得乙醚提取液，用氮气反复吹干乙醚溶济后，获得地鳖虫液态油。
[0040]灵芝β_葡聚糖发酵:采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ganoderma Iucidum),保藏号:CCGMC 5.0616。
[0041]种子培养基组成:蔗糖39g/L，蛋白胨8g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;液体发酵培养基组成:蔗糖44g/L，蛋白胨7g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L。将菌丝块接种于含1.2L种子培养基的2L摇瓶中，在发酵温度为30°C、转速为180r/min的回转式摇瓶柜中发酵8天，获得种子液，以无菌水调成1.8g/L的浓度(以菌体干重计)，然后接种150mL种子液于含1.2L发酵培养基的2L摇瓶中。发酵温度为30°C，转速为190r/min，先发酵3天，然后一次性补加50mg/L地鳖虫油，在发酵温度为28°C，转速为180r/min条件下继续发酵7天，结束发酵，收获发酵物。
[0042]产品的提取和分析方法同实施例1，结果β -葡聚糖的产量为185.2mg/L。
[0043]实施例4:
[0044]地鳖虫油的制备:虫体自然风干后，粉碎成60目的细粉，用料液比为1:50 (m/v)的无水乙醚溶液在温度为32°C下回流提取2.8小时，抽滤获得乙醚提取液，用氮气反复吹干乙醚溶济后，获得地鳖虫液态油。
[0045]灵芝菌种、培养基组成、种子接种方法、接种量同实施例3。
[0046]接入种子液后，在发酵温度为30°C，转速为190r/min下，先发酵3天，然后一次性补加75mg/L地鳖虫油，在发酵温度为27°C，转速为180r/min条件下继续发酵7天，结束发酵，收获发酵物。产品的提取和分析方法同实施例1，结果β_葡聚糖的产量为179.3mg/L。
[0047]实施例5:
[0048]地鳖虫油的制备方法、灵芝菌种、培养基组成、种子接种方法、接种量同实施例3。
[0049]接入种子液后，在发酵温度为30°C，转速为190r/min下，先发酵4天，然后一次性补加80mg/L地鳖虫油，在发酵温度为28°C，转速为180r/min条件下继续发酵6天，结束发酵，收获发酵物。产品的提取和分析方法同实施例1，结果β_葡聚糖的产量为182.7mg/L。
[0050]实施例6:
[0051]地鳖虫油的制备方法、灵芝菌种、培养基组成、种子接种方法、接种量同实施例3。同时设立对照发酵组和补加地鳖虫油发酵组。
[0052]对照发酵组在接入种子液后，在发酵温度为30°C，转速为190r/min下，先发酵3天；然后在发酵温度为28°C，转速为175r/min条件下继续发酵7天后结束发酵。
[0053]地鳖虫油发酵组在接入种子液后，在发酵温度为30°C，转速为190r/min下，先发酵3天，然后一次性补加68mg/L地鳖虫油，继续在发酵温度为28°C，转速为175r/min条件下继续发酵7天，结束发酵，收获发酵物。
[0054]产品的提取和分析方法同实施例1。结果对照组(未加地鳖虫油)β_葡聚糖的产量为151.2mg/L，添加发酵组β -葡聚糖的产量为193.6mg/L。
【权利要求】
1.一种提高灵芝菌发酵物中β -葡聚糖产量的方法，其特征在于:在灵芝(GanodermaIucidum)菌种液体发酵过程中添加地鳖虫油。
2.根据权利要求1所述的一种提高灵芝菌发酵物中β_葡聚糖产量的方法，其特征在于:地鳖虫油的制备方法为:虫体风干后，粉碎成细粉，用乙醚回流提取，抽滤获得乙醚提取液，用氮气反复吹干乙醚溶剂后，获得地鳖虫液态油。
3.根据权利要求2所述的一种提高灵芝菌发酵物中β_葡聚糖产量的方法，其特征在于:地鳖虫油的制备方法为:虫体自然风干后，粉碎成40-80目的细粉，用料液比为1:30-1:50g/mL的无水乙醚溶液在温度为20-33°C下回流提取2_3小时，抽滤获得乙醚提取液，用氮气反复吹干乙醚溶剂后，获得地鳖虫液态油。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种提高灵芝菌发酵物中β-葡聚糖产量的方法，其特征在于:添加地鳖虫油的量为50-80mg/L。
5.根据权利要求4所述的一种提高灵芝菌发酵物中β_葡聚糖产量的方法，其特征在于:将灵芝种子液接种到液体发酵培养基中深层发酵后，再添加地鳖虫油继续发酵。
6.根据权利要求5所述的一种提高灵芝菌发酵物中β_葡聚糖产量的方法，其特征在于:将灵芝种子液接种到液体发酵培养基中深层发酵2-5天后添加地鳖虫油，在温度为26-28°C、转速为150-190r/min继续发酵6-9天结束。
7.根据权利要求5所述的一种提高灵芝菌发酵物中β_葡聚糖产量的方法，其特征在于:将灵芝菌种接种到蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，KH2PO4和MgSO4为矿物元素的种子培养基中，培养基组成为:蔗糖36-45g/L，蛋白胨6-9g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;然后在温度为27-30°C、转速为160-200r/min的摇瓶中发酵6_9天，获得灵芝的种子液。
8.根据权利要求5所述的一种提高灵芝菌发酵物中β_葡聚糖产量的方法，其特征在于:将灵芝种子液制备成菌体浓度为1.5-2.0g/L的接种液，按体积比10-15%的比例接种到液体发酵培养基中深层发酵2-5天。
9.根据权利要求8所述的一种提高灵芝菌发酵物中β_葡聚糖产量的方法，其特征在于:将灵芝种子液制备成接种液接种到蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，KH2PO4和MgSO4为矿物元素的液体发酵培养基中，培养基组成为:蔗糖40-46g/L，蛋白胨6-9g/L，KH2PO4L 6g/L，MgSO40.76g/L ;然后在温度为27-30°C、转速为160_200r/min的摇瓶中深层发酵2-5天。
10.根据权利要求1或2或3所述的一种提高灵芝菌发酵物中β_葡聚糖产量的方法，其特征在于:灵芝菌株保藏号为CCGMC 5.0616。
【文档编号】C12P19/08GK104357510SQ201410562487
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】王晓玲, 刘高强 申请人:中南林业科技大学