专利名称：一种利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法
技术领域：
本发明属于应用微生物领域，更具体涉及一种利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法。
背景技术：
天然腐植酸主要存在于土壤、河泥、海洋沉积物、褐煤和风化煤之中，由死亡的动植物残体经长期生物化学或地球物理化学作用后生成。目前国内腐植酸的生产大多采用不同腐植化程度的有机物料，例如泥炭、褐煤、风化煤等，通过酸碱抽提法提取，提取率低，得到的是矿物腐植酸，其活性腐植酸——黄腐酸含量低，且不含有益菌。国外至今还没有生物 (或矿物)腐植酸的生产企业和产品。在上个世纪九十年代初，我国华北曾有人通过秸杆粉渣堆怄法制造出腐植酸类物质，曾引起科学界轰动，被称作是“师法自然，超越自然”，由此开辟了中国特色的腐植酸新行业一生物黄腐酸行业；但由于一直沿用土法堆怄工艺，产量低、产品质量不稳定，而且产品又再通过化工工艺提取黄腐酸，因而丧失了产品中的重要成分——有益微生物。到目前为止，我国生物腐植酸行业还处于初级阶段，未能形成对腐植酸工业的重大影响，更未能发挥其在国民经济发展和生态环保方面的应有影响力。我国华北地区(主要是河北省)是生物黄腐酸的发源地，现有中试规模(年产干物质500吨以下)企业5-6家。 但这些厂还是人工堆建发酵法，产量低、产品质量不稳定，某些生产环节(如发酵、干燥)仍依赖于自然条件。福建省诏安县绿洲生化有限公司采用自然菌群复合发酵甘蔗渣生产生物腐植酸， 不但产品中含有黄腐酸，而且保留了有益菌，使产品功能更趋完善。但由于采用自然菌群发酵，菌种缺乏科学的培育和管理，容易发生变异、衰退和死亡，影响了产品质量和产量；而且发酵生产等工艺条件还有待于进一步改进。中国腐植酸工业协会和专家学者十分重视生物腐植酸行业的发展，一直关注该行业新成果新技术。近年来，多次提倡该行业应规模化、机械化，应以定向菌种提升产品功能， 实现生物腐植酸的产业化生产。
发明内容
本发明提供了一种利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法，该方法通过选育和开发优良生产菌种，提升生物腐植酸产品的产量和质量。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为利用枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌混合菌株固体发酵生产生物腐植酸。其中所述固体发酵的发酵培养基的主要成分为蔗渣与麸皮。发酵培养基中蔗渣与麸皮的比例为1:广1. 5:1 (w/w)0枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌的比例为2:1 (ν/ν)。枯草芽孢杆菌菌悬液和多粘类芽孢杆菌菌悬液的细胞浓度均控制在108cfu/mL。
枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌的总接种量为10% 14%，该百分比为两种菌悬液的总体积量占发酵培养基重量的比例。所述固体发酵的发酵条件为发酵培养基初始pH为圹5. 5，发酵温度5(T55°C。所述固体发酵的发酵工艺为发酵培养基初始pH5. 5、发酵培养基中蔗渣与麸皮的比例为1.5:1、混菌的总接种量12%、发酵温度55°C。本发明以糖厂蔗渣为原料，利用枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌混合固体发酵生产生物腐植酸。枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌的比例为2:1 (各种菌细胞浓度控制在 108cfu/mL)，两种菌总接种量为10% 14% (v/w)；发酵条件发酵培养基中蔗渣与麸皮的比例为1:广1.5:1，培养基初始pH为4 5.5，发酵温度5(T55°C。在此条件下发酵6d，活性腐植酸(黄腐酸)产量增长了 69. 97%。本发明的显著优点以糖厂蔗渣为原料，变废为宝，实现企业资源的再利用，体现了循环经济的发展原则，为我国一大批大中型糖厂的综合利用技术改造开辟了一条新路子；通过选育和开发优良生产菌种、采用混菌固体发酵生产工艺，提升生物腐植酸产品的生产能力与质量水平，所生产的生物腐植酸产品中不仅富含活性腐植酸(黄腐酸)，而且含有益生菌，为实现生物腐植酸的产业化生产打下基础。
具体实施例方式
1、优良生产菌种的筛选鉴定
对从自然界筛选得到的7株细菌(从甘蔗田土壤、稻田土壤、稻草秸秆堆肥、腐烂树根、 食用菌栽培基质等地筛选获得)进行发酵产腐植酸能力的比较，得到4株优良生产菌株A、 B、C和D,黄腐酸产量的增长率分别为18. 36%、16. 20%、15. 86%和12. 23%。取产腐植酸能力较强的这4株菌，进行不同的搭配组合(即AB、AC、AD、BC、BD、CD)， 测定发酵后不同组合的黄腐酸产量增长率。结果表明，AB组合的发酵效果最好，黄腐酸产量的增长率为28. 85% (表1);且当菌种比例A:B=2:1时，黄腐酸产量的增长率最高，为32. 28% (表 2)。表1不同菌种组合对黄腐酸产量的影响
备注黄腐酸产量增长率％ =(发酵产品的黄腐酸含量-发酵前培养基的黄腐酸含量) /发酵前培养基的黄腐酸含量
表2 AB菌种不同比例对黄腐酸产量的影响
对A、B菌种进行16s rDNA序列分析并结合生理生化鉴定，确定A、B菌种分别为枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌，菌株保存于福州大学生物科学与工程学院。
2、发酵培养基优化
在原有工厂发酵培养基中，蔗渣与麸皮的总含量占95%左右，是影响腐植酸产量的主要成分。考察蔗渣与麸皮不同比例(2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2)对黄腐酸产量的影响，结
4果表明，当蔗渣与麸皮的比例为1:1时，黄腐酸产量的增长率最大，为38. 13% (表3)。
表3蔗渣与麸皮不同配比对黄腐酸产量的影响
权利要求
1.一种利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法，其特征在于利用枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌固体发酵生产生物腐植酸。
2.根据权利要求1所述的利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法，其特征在于所述固体发酵的发酵培养基的主要成分为蔗渣与麸皮。
3.根据权利要求2所述的利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法，其特征在于发酵培养基中蔗渣与麸皮的比例为1:1 1.5:1 (w/w)0
4.根据权利要求1所述的利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法，其特征在于枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌的比例为2:1 (ν/ν)。
5.根据权利要求1所述的利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法，其特征在于枯草芽孢杆菌菌悬液和多粘类芽孢杆菌菌悬液的细胞浓度均控制在108cfu/mL。
6.根据权利要求1所述的利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法，其特征在于枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌的总接种量为10% 14%，该百分比为两种菌悬液的总体积量占发酵培养基重量的比例。
7.根据权利要求1所述的利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法，其特征在于所述固体发酵的发酵条件为发酵培养基初始PH为4-5. 5，发酵温度50 55°C。
8.根据权利要求1-7中任一条所述的利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法，其特征在于所述固体发酵的发酵工艺为发酵培养基初始PH5. 5、发酵培养基中蔗渣与麸皮的比例为1. 5:1、混菌的总接种量12%、发酵温度550C 0
全文摘要
本发明提供了一种利用混菌发酵生产生物腐植酸的方法。该方法利用枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌固体发酵生产生物腐植酸。本发明通过选育和开发优良生产菌种、采用混菌固体发酵生产工艺，提升生物腐植酸产品的生产能力与质量水平，所生产的生物腐植酸产品中不仅富含活性腐植酸(黄腐酸)，而且含有益生菌，为实现生物腐植酸的产业化生产打下基础。
文档编号C12R1/12GK102174583SQ201110042008
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月22日 优先权日2011年2月22日
发明者李殿殿, 李自然, 林娟 申请人:福州大学