专利名称：一株生物表面活性剂高效产生菌s2及其发酵培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株生物表面活性剂高效产生菌S2及其发酵培养基，属于生物技术领域。
背景技术：
生物表面活性剂是天然表面活性剂的一种，主要是指微生物在一定培养条件下产生的一些具有明显降低表面张力的代谢产物。与化学合成的表面活性剂相比，它们除具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等相同特性外，还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的环境友好特性，如无毒、可自然生物降解、生态安全等优点。另外生物表面活性剂也常比化学活性剂具有更高的表面活性，因为生物表面活性剂的化学结构要比化学合成的表面活性剂复杂和庞大的多，单个分子要占据更大的空间，因而表面活性要强于化学合成表面活性剂，乳化能力也更强，它们在医药、化妆品、洗涤剂和食品等工业方面具有潜在的应用价值。特别是在在难降解疏水性有机污染物如多环芳烃、多氯联苯、石油烃的修复中，生物表面活性剂具有重要的作用，因为它能使这些疏水性有机物乳化并明显增溶，使得降解菌更容易降解这些物质。微生物产生的生物表面活性剂包括许多不同的种类，如糖脂、脂肽、多糖-脂类复合物、磷脂、脂肪酸和中性脂等。它们主要是由利用碳氢化合物作碳源的微生物所产生。近年来，随着人们对环境保护意识的增强，环境治理力度的加大，生物表面活性剂的开发和应用倍受重视，在石油开采、环境治理、食品工业、造纸工业、生物医药等领域应用越来越广泛，而且逐渐向其它领域渗透。例如，有研究报道，将生物表面活性剂与能够单独降解蒽的微生物配合使用，6天后可使蒽的降解量增加4倍。现有报道的产生物表面活性剂的微生物主要为假单胞菌，其产生量相对比较低。 例如，中国海洋大学梁生康等通过摇瓶试验研究了铜绿假单胞菌产生物表面活性剂的情况，最大产量为2. 14g/L。这不仅与生物表面活性剂产生菌的种类有关也与培养基组成有很大关系，因此，筛选高效菌株以及相应的培养基仍十分重要。
发明内容
技术问题本发明的目的在于针对生产实际中对高效产生物表面活性剂的大量需求的情况，筛选出一株产生物表面活性剂高效菌并研制出相应的发酵培养基配方。技术方案下面为本发明的主要内容本发明提供的一株能够生产生物表面性剂的菌株S2，经过鉴定确认为铜绿假单孢菌I^seudomonas aeruginosa S2。该菌株于2009年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，其保藏编号为CGMCC No. 3034。菌株经PCR扩增后，其16S rDNA序列在GenBank的登录号为EU590647。其最佳发酵培养基为菜油50g ·ΙΛ硝酸钠IOg ·ΙΛ氯化钾1. Ig ·ΙΛ磷酸二氢钾3. 4g ·ΙΛ磷酸氢二钾4. 4g · L—1，硫酸镁0. 5g · L—1，酵母膏0. 5g · L—1，微量元素溶液5. 0ml, ρΗ7· 2 7. 4。其中微量元素溶液配方为(g · L—1)硫酸锌0.四，氯化钙0. M，硫酸铜0. 25，硫酸镁0. 17。上述铜绿假单孢菌S2经鉴定，具有如下生物学特征(1)菌株的形态特征革兰氏阴性菌，在平板上培养3d后，形成直径3_5mm的圆形菌落，菌落表面光滑，隆起，呈淡黄色。显微镜镜检得到细菌的菌体形态呈杆状，大小分别是 6-8X8-12 μ m0革兰氏阴性，无芽孢和荚膜。(2)菌株的生理生化特征可以在ΡΗ6-8下生长，对葡萄糖、V-P反应、甲基红、吲哚反应呈阴性，对接触酶、氧化酶、液化明胶、水解淀粉、产荧光色素、产脓青素、产精氨酸双水解酶呈阳性，并能在41°C下生长。该菌株主要产鼠李糖脂，最佳条件下发酵液表面张力可由 75mN · πΓ1降至35mN · πΓ1，CMC值为0. 25g · L—1，远远低于一般化学表面活性剂的CMC值，发酵液乳化性能优于对照的十二烷基磺酸钠(SDQ及十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等常用的化学表面活性剂。发酵的产物为鼠李糖脂单一产物，4 发酵，产量可高达4. 7g/L。发酵溶液对疏水性有机物如石蜡油等具有明显的乳化和增溶作用，而且作用持久。(3)菌株的分子生物鉴定结果该菌株S2的16S rRNA共测出1267个碱基，在核酸数据库 GenBank (NCBI) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)登录号为 EU590647。16S rDNA 的序列如下tggattacgc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggataac gtccggaaacgggcgctaat accgcatacg tcctgaggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta tcagatgagcctaggtcgga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagaggatgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggacaatgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagttgggaggaag ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac gttaccaaca gaataagcac cggctaacttcgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgtaggtggttcag caagttggat gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tactgagctagagtacggta gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagtggcgaaggcg accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagataccctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt tgggatcctt gagatcttag tggcgcagctaacgcgataa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccgcacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta cctggccttg acatgctgagaactttccag agatggattg gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgtgtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cctcgggtgggcactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggcccttacggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatcccataaaaccg atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg
CtBgtBBtCgtgBBtCB0菌株S2与假单孢属(I^eudomonas)中的铜绿假单胞菌(aeruginosa)相似性最高，同源性达到99%以上，因此，鉴定为铜绿假单胞菌S2。有益效果该菌株与已有的同类菌株相比具有明显优点铜绿假单胞菌S2的发酵液CMC值仅为0. 25g · 远远低于一般化学表面活性剂的CMC值。发酵2天，产量可达到4.7g/L。铜绿假单胞菌S2发酵液能维持油与水乳化液体积在80 %以上，且可稳定长达 150h以上，其性能明显优于SDS和CTAB等常用的化学表面活性剂。
具体实施例方式下面叙述本发明的实施例。1、菌株的分离纯化称取采自南京市扬子石化的油泥10g，加入90ml无菌水，220r/min摇床振荡池； 静止30min后取上清IOml接种到装有90ml发酵培养基的摇瓶中，于^°C、220r/min的恒温摇床上振荡培养3d，以此摇瓶中的培养菌液作为菌种，在同样条件下进行二次转接培养。 将富集液划线和稀释涂布于蓝色凝胶平板，37°C培养3 5d，挑选菌落周围产生蓝圈较大的菌株进行进一步分离和纯化。挑选蓝圈较大的菌株，在牛肉膏蛋白胨细菌平板上划线纯化，37°C培养2 3d，挑选单菌落在斜面培养基上留种。将斜面保存菌株接种到摇瓶发酵培养基中，28°C、220r/min振荡培养3 5d，取发酵液进行表面活性的测定。上述菌株富集培养使用液体发酵培养基，添加质量百分比为2%的植物油作为唯一碳源。上述平板初筛培养基使用蓝色凝胶培养基(g/L)，其成分为牛肉膏1，葡萄糖20， 蛋白胨5，酵母膏0. 2，琼脂18，十六烷基三甲基溴化胺0. 2，亚甲基蓝0. 005上述分离铜绿假单胞菌S2的发酵培养基使用液体发酵培养基，添加百分比为5% 的植物油作为唯一碳源。2、铜绿假单孢菌S2的发酵，发酵温度为25°C(1)菌种筛选铜绿假单孢菌S2，保藏号CGMCC No. 3034 ；(2)斜面培养将菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，25°C条件下，静止培养M 小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于20mL含有质量体积比为的植物油的发酵培养基中，25°C条件下，振荡培养48小时，制得种子液；(4)扩大培养以5%的体积比的接种量，将种子液接种于IOOmL含有质量体积比为5%的植物油的发酵培养基中，25°C条件下，振荡培养48小时。发酵培养基组成为菜油 50g · L—1，硝酸钠 IOg · L—1，氯化钾 1. Ig · L—1，磷酸二氢钾 3. 4g · L—1，磷酸氢二钾 4. 4g · L-1， 硫酸镁0. 5g · ΙΛ酵母膏0. 5g · L—1，微量元素溶液5. 0ml, pH7. 2 7. 4。其中微量元素溶液配方为(g · L-1)硫酸锌0. 29，氯化钙0. 24，硫酸铜0. 25，硫酸镁0. 17。(5)收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液8000r/min，4°C离心20min，处理两次，除菌体，发酵液即为具有表面活性剂的溶液。经测定，发酵液中生物表面活性剂鼠李糖脂的浓度为4. 7g/L，发酵液CMC为0. 25g · L—1。3、生物表面活性剂鼠李糖脂的提纯将2(5)中的上清液用盐酸调至pH 2.0，出现絮状沉淀，4°C静置过夜；再离心处理 (10000r/min,30min,4°C )，倒掉上清液，用尽量少的pH为2. 0的盐酸溶液将离心管中的沉淀洗下，用lmol/L的NaOH将沉淀的pH调至7. 0，冷冻干燥，得到黄褐色疏松状的固体，即表面活性剂粗产品。将上述所得的粗产品用CH2Cl2萃取，减压蒸馏，用0. 01mol/L的NaOH溶解，用滤纸过滤，再用盐酸将滤液的PH调至2. 0，再次出现沉淀，4°C、10000r/min离心30min，得淡黄色沉淀，冷冻干燥即得表面活性剂。4、铜绿假单孢菌S2发酵液的乳化性能测定取一刻度试管(18mmX 180mm)，内加4mL石蜡油和4mL上述发酵液，测定发酵液内鼠李糖含量。配制与发酵液中鼠李糖含量相同浓度G700mg/L)的十二烷基磺酸钠(SDS) 及十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，分别加入4mL菜油，置于相同规格的刻度试管内作为对照，每种处理3个重复，用KQ-250B型超声波仪于80W下超声处理40s，然后避光静置， 在不同时间测量乳化液和油相体积。结果见表1。 表1.不同表面活性剂对石蜡油的乳化效果(％ )
权利要求
1.一株生物表面活性剂高效产生菌，命名为铜绿假单胞菌S2(pseud0m0nas aeruginosa S2)，2009年4月^3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3034。
2.根据权利要求1所述的生物表面活性剂高效产生菌，其特征在于所述铜绿假单胞菌 S2的GenBmk注册号为EU590647，它的16S rRNA序列如下tggattacgc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggataac gtccggaaacgggcgctaat accgcatacg tcctgaggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta tcagatgagcctaggtcgga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagaggatgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggacaatgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagttgggaggaag ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac gttaccaaca gaataagcac cggctaacttcgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgtaggtggttcag caagttggat gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tactgagctagagtacggta gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagtggcgaaggcg accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagataccctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt tgggatcctt gagatcttag tggcgcagctaacgcgataa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccgcacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta cctggccttg acatgctgagaactttccag agatggattg gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgtgtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cctcgggtgggcactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggcccttacggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatcccataaaaccg atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcgCt>已已tCgtgBBtCB0
3.—种生物表面活性剂高效产生菌发酵培养基，其特征在于所使用的培养基为菜油 50g · L—1，硝酸钠 IOg · L—1，氯化钾 1. Ig · L—1，磷酸二氢钾 3. 4g · L—1，磷酸氢二钾 4. 4g · L-1， 硫酸镁0. 5g化-1，酵母膏0. 5g化-1，微量元素溶液5. 0ml, pH7. 2 7. 4 ；其中微量元素溶液配方为(g · L—1)硫酸锌0. 29，氯化钙0. 24，硫酸铜0. 25，硫酸镁0. 17。
全文摘要
本发明涉及一株生物表面活性剂高效产生菌S2及其发酵培养基，属于生物技术领域。该菌株S2为革兰氏阴性菌，菌体形态呈杆状，大小为6-8×8-12μm，无芽孢和荚膜。经形态、生理生化特性以及分子生物学鉴定，该菌株属于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，保藏编号为CGMCC No.3034。其最佳发酵培养基为以50g·L-1菜油为唯一碳源的新型培养基。鼠李糖脂是该菌株唯一的发酵产物，且产量高。发酵液CMC值为0.25g·L-1，与常见的化学表面活性剂相比，它对油类等疏水性物质具有更为明显的乳化作用和持久性。
文档编号C12R1/385GK102250790SQ201110158689
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者任洁, 周立祥 申请人:南京农业大学