专利名称：一种删除转基因水稻精米中的外源基因的表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻基因工程领域，具体涉及一种删除转基因水稻精米中的外源基因的表达载体及其应用。
背景技术：
自1988年以原生质体为受体首次获得转基因水稻以来，水稻转基因技术已获得快速发展(Toriyama，K.，et al. Transgenic rice plants after direct gene transformation into protoplasts. Bio/Technology, 1988,6 :1072-1074)。巨前，禾ll用不同的转基因方法，科学家业已将抗除草剂基因、抗虫基因、抗病基因、抗逆基因及不同品质改良基因等外源目的基因导入不同水稻品种(系)，获得了大量转基因水稻。迄今为止，美国批准了安万特公司的转bar基因的耐除草剂水稻LL RICE 06、LL RICE 62和LL RICE 601 ；伊朗政府批准了抗虫转基因水稻的商业化种植；而在中国，“华恢1号”和“Bt汕优63” 两个转基因水稻品系的生产应用安全证书也于2009年12月得以颁发。然而，由于转基因技术的开发与利用的时间较短，人类对其生物安全性认识还十分有限，在科学界和社会大众中，很多人对此心存顾虑，担心转基因水稻中的外源基因，如一些杀虫、抗菌基因、过敏蛋白可能危及人类健康，以及担心抗抗生素抗性基因一旦整合到人类病原微生物，将对人类产生潜在的危险。水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，它是超过一半世界人口的主粮。我们通常所食用的稻米是指加工后的精米，它是水稻种子的胚乳部分。因此，发明一种删除水稻精米中的外源基因的转基因方法，解决转基因水稻的食品安全性问题具有重要的理论意义和应用价值。位点特异性重组(site-specificrecombination)是遗传重组的一类(Lyznik， LA. , et al. Site-specific recombination for genetic engineering in plants. Plant Cell Reports, 2003, 21 :925-932)。这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组也只发生在同源的短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋白质分子参与催化，重组的蛋白不是rec 系统而是int等。位点特异性重组系统主要包括两个重要元件重组酶(recombinase)和该重组酶能特异识别的位点(recognition site)。其工作原理是重组酶专一性地识别并介导两个同向特异性识别位点，形成所谓的Holiday结构，进而攻击并破坏识别位点，使环
(Voziyanov,Y. , et al. A general model for site-specific recombination by the integrase family recombinases. Nucleic Acids Res. ,1999,27 930-941)。目前，能在植物中有效利用的位点特异性重组系统主要包括大肠杆菌噬菌体pi 的 Cre/loxP 系统(Odel1, J.，et al. Site-directed recombination in the genome of transgenic tobacco. Mol Gen Genet.，1990，223 :369-378)、接合酵母的 R/rs 系统 (Sugita， K. ， et al.A transformation vector for the production of marker freetransgenic plants containing a single copy transgene at high frequency. The Plant J.，2000，22 :461-469)、酿酒酵母的 FLP/FRT 系统(Lloyd，AM.，et al. Functional expression of the yeast FLP/FRT site-specific recombination system in Nicotiana tabacum. Mol Gen Genet.，1994，242 :653-657)和大肠杆菌噬菌体 λ 的 Xis/attp 系统， Cre、FLP、R和X是重组酶，LoxP、FRT、rs和attp为相应的特异性位点，这些特异性位点DNA 序列各异，但大体结构相似，一般均由几十个碱基组成，含有一个6-8bp的核心区域和一对反向重复序列。其中，Cre/LoxP和FLP/FRT系统是在植物中研究最为广泛而深入的一个位点特异性重组系统，常常被用来删除转基因植物中的标记基因和转基因植物花粉中的外源基因(易厚富和王金发，异源位点特异性重组系统在植物在的研究。遗传，1999，21 (5) 62-66 ；Luo, K. , et al. 'GM-gene-deletor' :fused IoxP-FRT recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobacco plants. Plant Biotech J·,2007,5: 263-274)。授权公告号为CN1281750C的发明专利公开了一种诱导型位点特异性重组系统定时删除特定外源基因的方法，删除转基因植物中的外源基因，在特定时间内通过施入诱导剂，激活重组酶基因转录，从而删除特定外源基因。其步骤包括(1)将化学诱导启动子控制下的位点特异性重组系统和待删除的外源基因引入一种植物表达载体以构建一种重组载体，使得所述化学诱导启动子控制下的位点特异性重组系统中的重组酶基因和待删除的外源基因同时位于所述位点特异性重组系统中的重组识别位点之间；( 将所述重组载体转化植物；C3)使外源基因表达；C3)在需要删除外源基因时施入化学诱导启动子相应的诱导剂，删除外源基因，其中所述化学诱导启动子是乙酰苯胺类除草剂安全剂诱导启动子。该方法构建的表达载体中采用的是化学诱导型启动子，控制位点特异性重组系统，需要添加相应除草剂作为诱导剂如2-氯乙酰苯胺，诱导重组酶基因的表达，启动位点特异性重组系统，达到删除外源基因的目的，所以在删除外源基因的同时又引入了新的化学物质。然而， 对于水稻来说，其抽穗开花、种子充实灌浆均有一定期限，通常需要10天以上，而且对于不同植株来说，其生育期也不一致，况且化学物质的有效性还受环境等因素影响，因此很难利用上述方法实现完全删除种子中的外源基因；当然，如果要完全删除种子中的外源基因，则势必要施更多的诱导剂，从而一定程度上将污染环境。因此对于粮食作物尤其是人类赖以生存的主要粮食作物如水稻来说，该方法还是存在安全风险。目前为止，尚没有可以有效地且对水稻基本无损害地去除转基因水稻精米中的外源基因的方法。因此本领域迫切需要开发一种有效获得转基因水稻的精米中无外源基因的方法。
发明内容
本发明提供了一种删除转基因水稻精米中的外源基因的表达载体及其应用，构建含胚乳特异性启动子控制下的位点特异性重组系统和待删除基因的表达载体，转化水稻细胞，删除水稻精米中的外源基因。一种用于删除转基因水稻精米中的外源基因的表达载体，包括原始载体以及插入原始载体的重组序列，所述的重组序列由两端的LoxP-FRT元件、中间的外源目的基因表达盒和Cre基因或FLP基因表达盒组成，所述Cre基因或FLP基因表达盒的启动子为胚乳特异性启动子。所述表达载体的原始载体为PSB130或PCAMBIA1300。本发明还提供了一种删除转基因水稻精米中的外源基因的方法，包括将重组序列插入原始载体，构建表达载体，将表达载体转入水稻细胞，培育生成水稻植株，所述的重组序列由两端的LoxP-Frt元件、中间的外源目的基因表达盒和Cre基因或Flp基因表达盒组成，所述Cre基因或Flp基因表达盒的启动子为胚乳特异性启动子。所述表达载体通过农杆菌介导或基因枪转入水稻细胞。所述的胚乳特异性启动子为EnP2或RAGl，所述的EnP2 (GenBank Accession NO: AK107215)碱基序列如SEQ ID NO :1所示，根据发明专利CN201010146054. 0中公开的方法， 从林拥军教授(华中农业大学生命科学院，武汉，湖北)提供的含有EnP2胚乳特异启动子的质粒中扩增；所述的 RAGl (GenBank Accession NO :D11433. 1)碱基序列如 SEQ ID NO 2 所不，根据 Wu等(Wu, CY. , et al. Promoters of rice seed storage protein genes direct endorsperm-specific gene expression in transgenic rice. Plant Cell Physiol., 1998,39 :885-889)在文献中公开的方法从水稻品种日本晴基因组中扩增。所述的LoxP-FRT元件的碱基序列如SEQ ID NO 3所示，根据Luo等(Luo K.，et al. 'GM-gene-deletor':fused loxP-FRT recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobacco plants. Plant Biotech. J.，2007，5 :263-274)在文献中公开的 LoxP-FRT 序列及NOS终止子序列人工合成。所述的FLP基因为人工合成序列，碱基序列如SEQ ID NO 4所示。所述的Cre基因(GenBank Accession NO :X03453. 1)来源于大肠杆菌，碱基序列如 SEQ ID NO 5 所示。所述的外源目的基因表达盒中包含的外源目的基因为抗虫基因、抗除草剂基因、 药物蛋白基因、抗病基因和工业酶基因中的至少一种，优选为抗虫基因、抗除草剂基因、抗病基因中的至少一种。抗虫基因优选为CrylAbCrylAb/lAc，CryIAc, Vip3A或Vip3H(徐宁，苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白(Vip3)突变体的杀虫活性及其对胰蛋白酶的敏感性。 硕士学位论文，2007，浙江大学图书馆)；抗除草剂基因优选为Bar基因(De Block Μ.，et al.Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants. Plant Physiol.，1989,91 :694-701)、EPSPS 基因(赵特，一种抗草甘膦基因的发现和抗草甘膦转基因水稻的培育。博士学位论文，2008，浙江大学图书馆)、Bxn基因(钟蓉等， 转TA^-barnase基因的甘蓝型油菜的雄性不育的研究。植物学报，1996，38 (7) :582-585)、 Pat 基因(Kumar A.，et al. Genetic characterization of glufosinate-ammonium tolerant summer rape lines. Crop Sci.，1998，38 :1489-1494)或 AHAS 基因(Miki B. ,et al. Transformation of Brassica napus canola cultivars with Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase genes and analysis of herbicide resistance. Theor Appl Genet.，1990,80 :449-458)；所述抗病基因优选为 Pi25、Xa21、Pi2 或 Pi9(www. ricedata. cn/gene/gene—pi. htm ；www.ricedata. cn/gene/gene_xa. htm)。
更优选地，所述的外源目的基因表达盒中包含的外源目的基因为抗虫基因 CrylAb/CrylAc和(或)抗草甘膦基因。抗虫基因CrylAb/CrylAc和(或)抗草甘膦基因已在美国专利US 4940835中公开。在本发明中，将外源目的基因表达框和重组酶的胚乳特异性表达框紧密连锁并连接在同一个T-DNA区域的两个同向特异位点间，利用农杆菌介导法或基因枪法将该T-DNA 片段完整整合到水稻基因组中，使目的基因及重组酶基因能在转基因后代中稳定遗传。所述的胚乳特异性启动子是种子特异性启动子中的一种，该类特异性启动子仅在种子的胚乳中发挥作用，在植物的其它器官和组织中则不能表达。所以借助位点特异重组系统并利用胚乳特异性启动子驱动重组酶仅在胚乳中特异表达，就可以删除胚乳中的位于两个同向特异位点间的DNA序列，倘若目的基因的表达框也位于同向特异位点间，则可以获得胚乳(即水稻精米)中无外源目的基因的转基因水稻。本发明的有益效果本发明方法获得的转基因水稻在除水稻胚乳即精米以外的组织器官中表达外源目的基因，如抗虫基因和(或)抗除草剂基因等，达到抗虫和(或)抗除草剂的目的，而在胚乳即精米中又没有外源目的基因，解决了其食用安全性问题，通过将外源目的基因表达框和重组酶的胚乳特异性表达框紧密连锁并在水稻种子的胚中表达外源目的基因，解决了目的性状的遗传稳定性问题。
图 1 是 T-DNA 载体 pl300-3^-Ubi-YFP-EnP2_FLP 的示意图；图 2 是 T-DNA 载体 pSB3^-Actinl-Bt-RAGl_FLP 的示意图；图3是实施例2中PCR扩增转基因水稻中YFP基因的电泳图谱；其中(A)为转基因水稻糙米，⑶为转基因水稻精米；泳道1-11为转基因水稻，P 为质粒 pl300-3^-Ubi-YFP-EnP2-FLP。
具体实施例方式以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在Ausubel编写白勺由 John Wiley and Sons 公司出片反的 Current Protocols in Molecular Biology 禾口 J· Sambrook 等编写的由 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出版的 Molecular Cloning =A Laboratory Mannual,3rd ED.等文献均有详细的说明。以下施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市售购买产品。实施例1 水稻 T-DNA 转化载体 pl300-3^-Ubi-YFP-EnP2_FLP 的构建1)、重组系统的人工合成与构建IHig Luo ^ (Lou K. ,et al. 'GM-gene-deletor':fused IoxP-FRT recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobacco plants.Plant Biotech. J., 2007，5 :263-274)在文献中报道的IoxP-FRT序列，以及NOS序列，由大连宝生物(中国， 大连)人工合成重组系统loxP-FRT-FLP-Nos-loxP-FRT (碱基序列如SEQ ID NO :6)，在序列的两端含有HindIII和EcoRI酶切位点，在FLP序列前含一段多克隆位点序列(多克隆序列的酶切位点是 ClaI-NdeI-PstI-SwaI-SalI-NcoI-BamHI-NruI-KpnI-HpaI-Bspl407I-AscI-SnaBI-BglII-Apal-StuI-SpeI-SacII-XhoI-SmaI)，经 HindIII 和 EcoRI 酶切后插入 PCAMBIA1300 中，形成 pl30(K^6。2)、胚乳特异启动子ΕηΡ2的克隆胚乳特异性启动子EnP2 (GenBank Accession NO :AK107215)，根据发明专利 CN2010101460M.0中公开的方法由林拥军教授(华中农业大学生命科学院，武汉，湖北)提供含有EnP2胚乳特异启动子的质粒，分别合成两条引物(表1)，从质粒中PCR扩增出胚乳特异启动子 EnP2(SEQ ID NO :1)。表1.扩增胚乳特异启动子EnP2的引物序列
权利要求
1.一种用于删除转基因水稻精米中的外源基因的表达载体，包括原始载体以及插入原始载体的重组序列，所述的重组序列由两端的LoxP-FRT元件、中间的外源目的基因表达盒和Cre基因或FLP基因表达盒组成，其特征在于，所述Cre基因或FLP基因表达盒的启动子为胚乳特异性启动子。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的原始载体为PSB130或 PCAMBIA1300。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的胚乳特异性启动子为启动子 EnP2或启动子RAG1，所述的EnP2碱基序列如SEQ ID NO 1所示，所述的RAGl碱基序列如 SEQ ID NO 2 所示。
4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的外源目的基因表达盒中包含的外源目的基因为抗虫基因、抗除草剂基因、药物蛋白基因、抗病基因和工业酶基因中的至少一种。
5.一种删除转基因水稻精米中的外源基因的方法，包括将重组序列插入原始载体，构建表达载体，将表达载体转入水稻细胞，培育生成转基因水稻，所述的重组序列由两端的LoxP-FRT元件、中间的外源目的基因表达盒和Cre基因或 FLP基因表达盒组成，所述Cre基因或FLP基因表达盒的启动子为胚乳特异性启动子。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体通过农杆菌介导或基因枪转入水稻细胞。
全文摘要
本发明公开了一种用于删除转基因水稻精米中的外源基因的表达载体，包括原始载体以及插入原始载体的重组序列，所述的重组序列由两端的LoxP-FRT元件、中间的外源目的基因表达盒和Cre基因或FLP基因表达盒组成，所述Cre基因或FLP基因表达盒的启动子为胚乳特异性启动子。本发明还公开了一种利用所述的表达载体删除转基因水稻精米中的外源基因的方法，将获得的表达载体转入水稻细胞，培育生成转基因水稻植株。本发明方法获得的转基因水稻即能达到抗虫和(或)抗除草剂等目的，而在胚乳即精米中又没有外源目的基因，解决了其食用安全性问题。
文档编号C12N15/63GK102392038SQ20111033947
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者张春娇, 潘刚, 王宁, 程方民 申请人:浙江大学