一种细胞观测实验用芯片的制作方法

专利名称：一种细胞观测实验用芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞芯片制造的技术领域，特别与一种用于培养、观测细胞的细胞芯片的结构有关。
背景技术：
近几年涉及细胞培养、测量、实验等方面的微流路芯片技术发展异常迅速，国际上许多的实验室都在致力于发展出真正能满足实验室和医学及临床的细胞芯片(Jamil El-Ali et al. Cells on chips. Nature 2006，442，403—441)。例如，St印hen R. Quake 于 2007 年 11 月在美国 Analytical Chemistry (Rafael Go'mez-Sjolberg et al. Versatile, Fully Automated, Microfluidic Cell Culture System. Anal. Chem. 2007, 79，8557-8563)上发表了将细胞培养的芯片单元进行阵列化的比较成熟的细胞芯片技术，并且运用这种芯片培养了骨髓间质干细胞。采用微流体控制细胞的方法多种多样，近几年这方面的文献较多，这里不一一赘述。以乂印&11 R. Quake实验室的工作为例，其芯片集成了 96个可寻址的细胞培养单元，使得细胞芯片循着计算机的模式发展，同时也向细胞芯片的真正实用化迈进了一步。但是，正如Jamil El-Ali et al. 2006 在 Nature 上发表的 Review (Cells on chips)中所评价的那样，“新近发展出来的微制造发明装置在应用及基础研究两方面都有利于细胞及组织生物学的发展。但是，迄今为止这些装置仅适用于应对简单的低复杂性的测试。”实际上，这就是说，这些装置都因为有这样那样的缺陷而无法真正达到预期的目标。 这些缺陷包括芯片本身的复杂性、可靠性、重复性、耐用性等因素，也包括其对复杂自动控制技术的苛刻要求以及制造的成本问题等等。iitephen R. Quake实验室的将芯片单元集成化是一个解决这种种问题的一个很好的也很容易想到的思路。而本发明则从待集成的芯片单元本身出发来解决细胞芯片的各种问题。因此这是一个提高细胞芯片品质的一个快速而根本的思路。从乂印&11 R. Quake实验室发明的集成化细胞芯片不难看出，其被集成的芯片单元实际上是矩形的微容器。如图IA所示，是流体流经矩形微芯片单元10时的流速分布，箭头的方向与长短表示流速的方向及大小。液体进入微容器后，其速度基本上是均勻分布的， 其速度随距离的分布如图IB所示。显然，决定该微容器中各区域流速变动的因素只是其开口和出口的压力差。如果压力差有变化(这在微流路芯片中必然发生的)，则整个容器的流速就整体变化到另一个值。原来的速度值在微容器地任何区域都不存在。这对于依赖于稳定流速来使细胞停留并培养的技术来说是一个无法回避的缺陷。特别对于较长期的细胞培养及实验过程来说，由于芯片流路或通道中的动力环境必定会有或多或少的变化，这种缺陷就显得十分突出。从细胞进样来讲，由于细胞在进样过程中能否在微容器中停留实际上就是取决于流速，而对于微容器整个区域内流速的涵盖范围十分狭窄(接近于一点)，对于控制的精度要求就非常苛刻。即便是控制的相当完美，由于细胞间黏附力的差异，有相当一部分细胞也会无法满意地停留在微容器中，它们要么会因为黏附力偏弱而逃离，要么会因为黏附力偏强而没有到位。当研究需要将不同类型的细胞同时控制在其中的时候，这样的微容器显然就会在进样的第一部面临非常大的失败几率，因为不同种类的细胞对流体流速的要求差别太大了。如果细胞芯片要迈向真正的实用阶段，这几个问题是必须要解决的，而且这不能依靠将芯片单元点阵化的思路来解决，只能从根本上改变芯片单元本身的设计。综上所述，芯片必须在芯片单元内部解决流速控制问题，以彻底解决不同细胞在进样、培养以及实验时对流速的不同要求。另外，在生命科学领域，细胞芯片的发展很重要的任务就是为研究活的生命体提供方法，而活的生命体，无论是单细胞生命体还是多细胞生命体，都需要持续的气体交换来维持生命特征，如释放(X)2获取02。气体交换装置能够在芯片的微观尺度上将气相中的分子吸收进液相中，也可以将液相中的分子释放到气相中，这为基于微芯片的化学，特别是分析化学方法提供了新技术。现有技术1 (W0/2006/080177) Gas Exchange Chip, Method Of Gas Extraction Using The Same, And Totally Organic Matter Carbon Measuring Instrument是一项有关气体交换芯片的专利。其基本的原理是将两个平行的流体通道用多个的微通道相连，由于微通道中的憎水作用使得两个流体通道的的液体互不混合，而气体则可以从一种液体中释放出来穿过连接通道扩散到另一种流体中。专利中指出了一项实验，该实验显示第一种流体中的(X)2扩散到了第二种流体中。现有技术 2 Hachiya, H.，Tokeshi, M.，Yoshida, Y. & Kitamori, T. Gas—liquid crossing flow in microchannel and its application to gas analysis microchip. Proceedings of the IEEE Sensors 2004 1-3, 166 - 169 (2004)是一篇有关气体交换芯片的论文。其基本原理是在一个长的通道(约50mm)蚀刻高低不同的的微通道，使用时将气体和液体同时压入通道，通道内高低的差别使得混合的气体和液体最终可能在出口处形成分开的气一一液两相，从而得到气液气体交换的效果。显然，这两项气体交换的芯片技术都存在着很大的缺陷。第一项技术实际上是考虑两种液体间的气体交换，其中需要憎水处理，膜技术等等，尺寸较大，也不是一种直接气一一液接触的微米级装置。第二种技术采用的长的通道(约50mm)，不是在微观尺度上能实现气体交换的技术，其气——液湍流混合再分离的方式也并不稳定可靠的，无法在微米级尺度上形成溶解气体的梯度。

发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞观测实验用芯片，其能满足不同细胞在进样、培养以及实验时对流速的不同要求，减小由于微流路状况的不稳定对细胞控制造成的干扰。本发明的另一目的在于提供一种细胞观测实验用芯片，其能在微观尺度上实现气体稳定可靠的直接交换。为了实现上述目的，本发明的解决方案是
一种细胞观测实验用芯片，包括流体入口、细胞入口和出口，还包括至少一个宽度随位置变化的速度控制微芯片单元。所述速度控制微芯片单元为线性张开的形状。所述速度控制微芯片单元从入口开始，每经过一段固定的距离，其宽度就增加一倍。设入口处ζ = 0，初始宽度为，出口宽度为re，入口到出口的距离为z，而每经过距离々就需要把宽度增加为原来的两倍，在距离入口χ处的宽度为I，即= W0 2、" )，则所述速度控制微芯片单元的边缘曲线方程式为-.D = Llnl / {In Ve- In W0 )。所述速度控制微芯片单元中分布有用于协助细胞停留或隔离的凹坑。所述速度控制微芯片单元中设有用于协助细胞停留或隔离的围栏状突起的水坝。所述水坝为弧形设计，使流经水坝的流体方向与水坝正交。令a为水坝起始半宽，即X=O时的y值，b为终止半宽，即x=c时的y值，c为起止距离，D为当前距离，L为曲线从开头到X=D点处的长度，再令K = ln(b / a) / C5K1 =Sqr(l + a2 K2 e2DK) ;K2 = Sqr (1 + a2 K2)，则水坝弧形曲线的方程式为=L= (K1 - K2 + 111((^ - 1) / (K1 + 1))/2- In((K2 - 1) / (K2 + 1)) / 2) / K。所述芯片中增加一隔墙，此隔墙将芯片内分为气体通道和液体通道，在隔墙上还设有气体交换装置，气体交换装置具有连通气体通道和液体通道的通孔。所述通孔的孔壁呈半球形面，其半径朝向气体通道一侧，弧顶朝向液体通道一侧。所述气体交换装置由基片和盖片通过弹性钢夹定位而成。芯片必须在芯片单元内部解决流速控制问题，以彻底解决不同细胞在进样、培养、 以及实验时对流速的不同要求。由于不同的细胞不可能占据同样的空间(位置)，把不同的流速分布在不同的空间就成为解决问题的根本方法，本发明人根据这个概念设计出一种将不同速度分布在不同空间(位置)的芯片单元一一速度控制微芯片单元(以下简称SCMC，即 Speed-control microchip cell)。设计原理
速度控制的基本思路是在液体流经SCMC时空间不断开阔，而流速就不断随着开阔度的增加而降低。这种开阔度的增加可以通过增加宽度(或高度)的方法来达到。这类似于河流的入海口，其不断开阔的空间使得入海的流速不断降低，这对于河流中的悬浮颗粒在入海口附近加速沉积形成三角洲有很大的促进作用。这样，SCMC内的速度会因为不同位置宽度的连续变化而取得不同位置流速的连续变化。这种速度随空间的分布特征完全取决于设计时所规定的宽度变化函数，与宽度的变化有着可靠的对应关系。一般来说，将SCMC 设计为速度连续降低的方式，这是因为进样时要求有较高的入口速度以利于所有细胞进入 SCMC，待细胞进入SCMC之后再进行进一步的控制。而连续降低的方式可以让SCMC涵盖很大的速度范围，使得不同性能的细胞均能“各得其所”。当然，这种设计的SCMC使得低黏附力的或较轻或悬浮力强的细胞易于停留在尾部的低流速区而高黏附力的或较重或悬浮力弱的细胞易于停留在近入口处的高流速区，这实际上对各种不同的细胞起到了按黏附力、 重量或悬浮力等参数进行分选的作用。由于速度本身与宽度具有函数关系，而细胞研究又特别的需要可以通过改变宽度的变化来得到不同的形状来调整流速分布，如在部分地方可以通过缩小宽度来提高速度，甚至倒置速度分布。按空间分布的速度并不排斥在时间轴上控制SCMC的内部速度。但由于速度在 SCMC的空间分布本身也是入口速度的函数，只要调节施加于SCMC两端的压力差，也就调节了 SCMC的入口速度，同时也就按比例调节了 SCMC的内部速度分布。但与现有技术中的细胞控制单元不同，这种调节不是移动一个“点”去覆盖另一个“点”，而是移动一个“面”去覆盖另一个“面”。这不仅是提高可靠性和可控制性的问题，更是使得多种不同性质的细胞得以共存在同一个SCMC单元的微环境中成为可能。而这正是细胞芯片迈向实用的关键技术。显然，SCMC在不同的位置分布了一个连续范围的速度值。即使由于微流路状况的不稳定造成了不可预计的波动，对于SCMC内部而言，其涵盖的速度值范围仅仅是极大值和极小值的波动，使得其最佳速度区间有所缩小而已，并不会出现矩形微容器那样的速度完全偏离的破坏性结果。而且这种波动在尾端慢速区的影响也按比例被缩小了，这使得SCMC 对于这种速度波动具有强的抗干扰特性。即使细胞在当前位置因速度值偏高而被流动的液体带走，其尾端进一步减速的区域迅速降低的速度也能使得细胞能够重新安定下来。而现有技术中的细胞控制单元结构则会由于速度的波动造成细胞迅速逃逸的结果。SCMC开放的空间结构及大范围的速度分布式的各种其他的微器件技术可以被有效地植入到所需的速度控制区。这就是说其他细胞芯片技术可以植入到SCMC中以综合使用。简单的如凹坑或围栏状突起的水坝就可以起到在特定的速度控制区协助停留细胞的作用或者利用这些结构对整个SCMC进行适度的隔离或分区。函数设计
流速分布的函数规律明确对于SCMC的性能的定量化、可控性及可预测性十分重要。如果只是简单地把结构设计为线性张开(似三角形)的形状，当然也能达到速度连续降低的效果。但是，这样的结构虽然设计上简单易行，速度分布上却并不令人满意。这是因为无论从人的直觉上还是从自然界各种尺度的变化上都是指数变化的规律比线性变化的规律更为合理。正如人对大小的感觉和对声音强度的感觉，都是以倍数(实际上是指数函数关系)为参考的。所以最典型的设计也应该是以指数函数关系为最基本函数的。也就是说，从入口开始，流体每经过一段固定的距离，其宽度就应该增加一倍，使流速降低为原来的1/2。这样，在有限的距离内，速度不但得到快速下降，也得到了均勻的下降。例如，设入口处(χ = 0)初始宽度为W0，而每经过距离々就需要把速度降低到远离的1/2，也就是把宽度增加为原来的两倍，则在距离入口 ζ处的宽度1可由式(1)给出。Wx = W0 2 U/I,)式(1) 当然，式(1)同式(2)具有类似的含义。wx = r^(x/I>,)式 O)
显然，在实际的设计中SCMC的尺寸直观上与入口宽度W0,出口宽度I及减速器入口到出口的距离Z有较为直接的关系，而々或f则属于内部参数。因此在把SCMC的设计尺寸和总减速倍率(实际上是I//^，)两个重要参数作为重要的考虑因素就可以了。这时D或 D’可以分别通过式(3)或式⑷求出，从而得到理想的SCMC边缘曲线。D = Lln2 / ( In We - In W0 )式(3) D' = L /{ In We- In W0 ) 式(4)
SCMC结构中水坝弧形设计的目的是为了让流经水坝的流速尽可能与水坝正交或接近于正交。由于液体在SCMC中流动的过程中除了中心对称轴上的流向是以直线前进以外，离开对称轴越远而离结构边缘越近则流线越接近于边缘曲线。观察SCMC内部各处的流线与边缘曲线类似，因此就把式(1) (2)的函数曲线的长度作为流线的长度来进行计算，即采用该函数路径积分的方法来估算入口处到某一点所流经的曲线的长度。以相同的曲线的长度为标准求算水坝弧形曲线的坐标。实际计算过程中采用计算机进行数值求算的方法通过弧线定长球的弧线的坐标，具体过程这里不一一赘述。以下给出的公式5是曲线长度计算的函数。用来计算等曲线长度的水坝形状。令a为起始半宽(即X=O时的y值)，b为终止半宽(即X=C时的y值)，c为起止距离，D为当前距离，L为曲线从开头到X=D点处的长度。再令K = ln(b / a) / c K1 = Sqr(l + a2 K2 e2DK)
K2 = Sqr(l + a2 K2)
贝丨J L= (K1 - K2 + 111((^ - 1) / (K1 + 1))/2- In((K2 - 1) / (K2 + 1)) / 2) / K 式(5) 制造工艺
芯片的材料一般采用玻璃(冕白玻璃)、PDMS (聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsiloxane)硅等生物相容性好的材料。但对于不同的材料其流场特性是不变的，因此从设计本身来讲并没有对材料有特别的要求。对于微芯片制造工艺的日常程序来说并没有任何不同，简单的描述就是设计并制造好掩模、利用掩模对光刻胶曝光，除去被曝光后的光刻胶，然后再除去暴露出来的铬保护层，露出玻璃基底；腐蚀玻璃基底到一定的深度即得到基片。将基片于带孔的玻璃或PDMS盖片键和牢固后即可得到需要的芯片。所以关键在于掩模的设计。在设计掩模的过程中，SCMC的内部被设计为并不连续的形状，这是因为光刻腐蚀是各向同性的，它既向下腐蚀也向水平方向腐蚀。这样原本不相连的空间就在腐蚀后连在了一起，并且在底部形成了山丘状的拦水坝。同时，在边缘处也形成了同样的形状。显然， 腐蚀的深度d、通道缝隙hi、水坝高度t!2、设计间隙W等几个参数之间有着式(6)、式(7)的关系。hi = SQR( d2 - ( w / 2 )2 )式(6) h2 = d - hi 式(7)
因此，通过控制掩模地缝隙设计宽度及腐蚀深度，水坝的尺寸高度及缝隙可以得到准确地控制。对于贴壁细胞的培养来说，水坝不是必须的。但水坝的设计可以改善SCMC的性能，使其在保留细胞，分割空间方面有个更出色的控制特性。显然，Ii1如果较大更易于保留细胞，而h2较小则可以是较小的细胞通过而阻挡较大的细胞。综上所述，本发明提供的一种细胞观测实验用芯片，由于速度控制微芯片单元在不同的位置分布了一个连续范围的速度值，即使由于微流路状况的不稳定造成了不可预计的波动，对于速度控制微芯片单元内部而言，其涵盖的速度值范围仅仅是极大值和极小值的波动，并不会出现矩形微容器那样的速度完全偏离的破坏性结果，而且这种波动在尾端慢速区的影响也按比例被缩小了，这使得本发明对于这种速度波动具有强的抗干扰特性， 其能满足不同细胞在进样、培养以及实验时对流速的不同要求，减小由于微流路状况的不稳定对细胞控制造成的干扰。另外，本发明的气体交换装置使气体直接交换，借用芯片的微结构设计形成稳定的表面张力微气泡，在气——液两相之间形成气相和液相的直接接触，气体在通道中能够以比液体快得多的速度行进，液体中快速形成气体的浓度梯度并进行控制，气体交换得以直接进行。并且由于气泡的直径可控，一般10-40微米左右，具有在微米级尺度迅速形成溶解气体的梯度以及不同气体间的迅速切换的功能。该技术适用于各个学科如生命、化学、物
理等各种需要溶解气体梯度及气体交换装置的领域。


图IA是现有技术矩形微芯片单元中流体流向的示意图IB是现有技术矩形微芯片单元中流体线速度随距离变化的示意图2A是速度控制微芯片单元中流体流向的示意图2B是速度控制微芯片单元中流体线速度随距离变化的示意图3A是速度控制微芯片单元中分布凹坑的示意图3B是速度控制微芯片单元中设置环形水坝的示意图4是水坝掩模设计示意图5A是腐蚀后芯片的实拍图片；
图5B是图5A中虚线部分的放大图6是本发明细胞观测实验用芯片的示意图7是水坝的截面示意图8是水坝截面的另一示意图9是速度控制微芯片单元中流体的流动速度示意图10是速度控制微芯片单元内部不同位置的流体流动速度示意图11是速度控制微芯片单元入口处红细胞速度与压差的线性关系图12是四组不同压差下速度随距离的变化曲线；
图13是四组不同压差下细胞密度随距离的变化曲线；
图14是在不同压差下速度控制微芯片单元内部的实拍图像；
图15是兔全骨髓细胞在速度控制微芯片单元内细胞密度随距离的变化曲线；
图16是兔全骨髓细胞在速度控制微芯片单元内的实拍图像；
图17是流动培养基中的骨髓细胞；
图18是一个白细胞的运动路径示意图19是一个白细胞被激活、趋化、吞噬、搬运一个细胞颗粒的示意图； 图20是白细胞搬运和传递细胞颗粒的示意图21是甲藻单细胞在速度控制微芯片单元内细胞密度随距离的变化曲线；
图22是培养中被阻隔在水坝前的甲藻细胞实拍图像；
图23是一个甲藻细胞的运动路径示意图M是被水坝阻拦的甲藻细胞在培养过程中蜕皮逃离的过程；
图25是细胞蜕皮逃离过程的连续显微图像；
图26是每个细胞逃离的时间在时间轴上的示意图27是本发明细胞观测实验用芯片中设置气体交换装置的示意图观是气体交换装置的形成示意图四是同时设置多个的气体交换装置的示意图30是稳定的压力控制图31是压力——曲率实测结果图；图32是鸡血红蛋白氧气通过气体交换装置从气体相进入液体相的过程； 图33是氧气及二氧化碳在血红蛋白的指示下通过气体交换装置的扩散情况； 图34是图33的a——b剖面图； 图35是每3分钟切换氧气和氮气的结果；
图36是新鲜兔骨髓中巨噬细胞的运动路径受气体交换装置扩散形成的溶解氧梯度变化引起的运动路径的改变情况；
图37是气体交换装置制造腐蚀过程；
图38是测试单个气体交换装置在封闭通道中气体扩散情况的芯片； 图39是非永久性的玻璃芯片封装图； 图40是调节液体相中的溶解气体梯度的CCD光谱数据图； 图41是纯水和饱和蔗糖水在20°C下的压力——曲率实测结果。
具体实施例方式如图6所示，是本发明提供的细胞观测实验用芯片的一个较佳实施例。该细胞观测实验用芯片包括流体入口 4、细胞入口 6、冲洗通道7、速度控制微芯片单元1和出口 5，芯片中央的喇叭口形容器就是速度控制微芯片单元1。流体(培养基或试剂)可先经过过滤后从左边的流体入口 4进入，最后从右边的出口 5出。出口网状过滤器保证出口处的液压分布均勻。细胞可从靠近流体入口 4的细胞入口 6处进入。多余的液体或细胞可从对面的冲洗通道7流出。如图2A所示，是速度控制微芯片单元(SCMC)I中流体流向的示意图。从图中可以看出流体流经喇叭形开口的速度控制微芯片单元1时的流速分布(箭头的方向与长短表示流速的方向及大小)，图2B显示的是SCMC中线速度随流经距离的分布(图中的虚线表示速度上下波动时的情况)，由图中可以看出流体的流速随流经的距离呈指数变化。在喇叭口形开口的速度控制微芯片单元中可根据需要设置微型结构如凹坑2 (图3A)或环形水坝3 (图 3B)以帮助细胞在微流中的停留。参阅图4 一图8是制造水坝的工艺。速度控制微芯片单元1中的水坝可通过掩模设计一次成型。图4中黑色区域为掩模的不透光区域，白色为透光区域。玻璃芯片腐蚀成型时从白色向黑色进行(如图4中白色箭头所示)。图5A是腐蚀出来的芯片实拍图片，中央黑点为流经速度控制微芯片单元的细胞。图5B为图5A虚线部分的局部放大图片，可见腐蚀后扩展连接形成的弧形水坝。由于腐蚀成型时是各向同性的，其垂直方向上的截面(a-a’) 的形状(参见图7)也与呈现同样的弧形。腐蚀的深度为d，水坝的高度为h1;水坝上方的缝隙高度为Ii2，则掩模不透光区域的宽度w和腐蚀深度d决定了 Ill和h2，从图8中可以看出这几个参数之间的关系。
流速分布测试
流速分布是SCMC最重要的参数。图9是SCMC入口处的实拍图像。用于指示液体流动的是便于取得的鸡血红细胞。箭头的长度指示红细胞每3s经过的路程，在图中可见红细胞在0s，ls，k，3s时的位置。随着入口及出口液压差(ΔΡ)的变化，红细胞在3s中经过的距离(由及间隔Is的图像重叠获得各个细胞在不同时间的位置)明显变长。由于这些红细胞在芯片的流体中处于不同的高度，其反映的流速也有所差异。这是因为近壁的流速较弱，而远离芯片通道壁的流速较强。这样，测试流速的过程中需要较多细胞的统计处理。在图9 中可见随着压差的增加，流体中红细胞的运动速度迅速增加了。压差由不同高度的液面差精确给出，精度为士 0.5Pa。压差施加于芯片的流体入口 4和出口 5处。仪器设备由厦门安东电子有限公司提供。在精密调节压差的情况下对SCMC入口处红细胞的运动速度进行了大样本的测定，测定结果见图11。由图11可以看出压差与流体运动速度有着十分稳定的关系。曲线略微有一些向下弯曲是因为红细胞有一定的黏附力，在流速比较低的时候，细胞自身的重量容易使得细胞本身与芯片壁接触，造成黏附阻力而降低平均速度。稳定的压差——流速关系确保了对芯片中速度场的可靠控制。图10是速度控制微芯片单元1内部各处(入口、中部、尾部)在同样压差条件下的流速情况。在同样的一个入口出口压差(AP=250pa)的驱动下，不同距离处的速度(如图中不同位置的放大图形)从0. 2mm处的每3秒200 μ m左右迅速降低到近出口处的每3秒 0-3 μ m0很明显，在流体从入口流到尾部的过程中，流速迅速而规律地降低了。高精度大样本的测试结果见图12。测试中选择了四个不同的压差以考察速度场受入口速度的影响情况。由图中的指数回归方程可以看出，数据所显示的速度分布完全符合预期的规律，即使指数分布规律。SCMC中的流速在入口到出口的距离函数上以规律性的指数函数方式降低，并且，不同的入口速度并不影响这种函数分布规律，芯片的指数函数降低方程中的衰减常数只有很小的变动。这些数据及回归方程充分说明了 SCMC的设计制造达到了预期的目的，SCMC中的速度分布流场完全受到精确的控制，任意位置的速度向量都是可预测的和可调节的。细胞密度分布测试
细胞在进入SCMC后就会受到SCMC中速度场的作用，这种作用会由于不同细胞在同一时刻占据不同的位置，以及同一细胞在不同时间占据不同的位置时所受到的液体推动是不同的。这样细胞在进入SCMC后经过一定的时间就会扩散开来，这种扩散的方式是考察SCMC 性能所需了解的。细胞在不同的压差驱动下深入到速度控制微芯片单元的深度有所不同。 细胞的在不同距离处的分布由细胞密度所表示，细胞密度由每个减速单元即两个水坝之间的空地处显微镜视野中的细胞(酵母细胞，采用25倍相差物镜)统计得出。酵母细胞具有比红细胞大一些的黏附力，易于获得，在相差显微镜下呈现很强的反差，易于识别计数。因此采用酵母细胞来进行SCMC内部细胞分布的测量。具体方法是将酵母细胞悬浮液从进样口引入，到达一定数量后终止细胞进样改由无细胞纯水驱动。在显微镜的监控下把这些酵母细胞引入SCMC不同的深度，即图13中不同的距离。实验过程中直接控制压差来控制细胞进入的深度，加大压差产生较高的流速就可将细胞推倒尾部。待细胞进入预期位置后减弱压差到平衡速度，使得细胞在SCMC中的分布基本保持不变，进行快速拍照，对照片中的酵母细胞进行计数，最后得到每一个减速单元的细胞密度。数据绘制于图13中。实验中实拍的图像见图14，细胞在低入口出口差压下某些位置处的实拍图像(A、B、C、D)及在高入口出口差压下某些位置处的实拍图像(E、F、G、H)。从图13中可以看出随着压差驱动的进样深度的增加，细胞分布的宽度在增加，这正如色谱中的峰变宽一样，是一种动态分布的过程，在这个过程中体现出动态流场对细胞群体的作用。在这种动态过程中，细胞质之间的细微差别可能在空间位置上体现出来。正如图13中所展示的那样，随着细胞群体进入深度的增加，分布宽度的增加，原来单一的峰
10型也分裂为两个(见高压和最高压的峰型)。合理的解释是，这一群酵母菌可能在性质上如浮力、重量、黏附力等综合因素上存在着细微的差别，因而在进入SCMC的过程中在移动速度上体现出不同，最后在分布位置上体现出不同。因此，可以利用SCMC来进行细胞的分离及筛选。对于本实验来说，从图片中可以看出速度较快的酵母菌团聚体(见图14中的H)比较多，而这种团聚体通常是比较年轻的酵母菌形成的，因此造成这种可被SCMC速度场识别的物理或化学性质差别可能是酵母菌的年龄差别的体现，但具体细节还不清楚。图15是引入兔全骨髓细胞的分布结果。从这张分布图中可以看出骨髓细胞在9mm 处被有效的地截留了。这是因为芯片制作时在水坝上方预留的空间为20微米左右，这与大部分的骨髓细胞的大小相当。在流缓慢到一定的程度时，骨髓细胞就不易通过这个空间，加上水坝的重力阻隔作用，骨髓细胞可以被有效地保留。与之相比较，兔红细胞因为较小、较低的黏附力和较强的悬浮力而在流体的驱动下自由地流动(见图16)。这里需要注意的是， 骨髓细胞的停留并非在水坝的上游，而是在上游和下游都有。这是因为水坝本身并非只是起到阻挡的作用，而也起到了改变流场的作用，在下游一方有可能造成涡流或速度迅速减缓的区域，使得细胞在此处易于停留。应用实例
以下是将细胞引入SCMC的两个实例，从这两个例子可以看出复杂的细胞被引入SCMC 后被可靠地控制在SCMC中，从而使细胞的培养和观察实验得到可靠的技术支持。兔全骨髓细胞的培养与观察
兔全骨髓细胞取自家兔大腿骨骨髓，利用同样一只家兔的血液的血清(保留部分红细胞)来进行骨髓细胞的进样及培养观察实验。兔骨髓细胞在被有效引入并保留在SCMC中后，保持血清培养基持续的流动，观察即开始。图像由CCD自动拍摄，间隔从ls-lmin不等。 连续监测培养1天以上，以获取足够长时间的动态图像进行分析。图17显示流动培养基中的骨髓细胞。彩色为灰度图片人工着色，以强调需重点说明的细胞(下同)。红色箭头指示培养基流动的方向。红色细胞为图红细胞，随流体流动，指示处流体流动的速度和路径。绿色为一个兔骨髓细胞，在流体运动后开始旋转。图17展示出骨髓细胞(绿色)在载有红细胞的液体培养基的流动中产生了旋转的效应。这种旋转效应对液体的运动有一定的时间滞后效应(约10s)，并且由于其旋转的长期性和稳定性，提示这种旋转可能是细胞内部的动力机制，而非细胞膜被液体流物理推动产生的旋转作用。这种旋转的生物学意义上待进一步的研究。图18展示了一个白细胞在 22min内的自主运动过程，途中的数字表示连续运动的顺序时间(min)。在这个过程中，白细胞穿越了水坝缝隙，体现了白细胞的变形虫体征和强大的运动能力。图19展示一个白细胞(大的白色圆圈中的黄色细胞)被激活、趋化、吞噬、搬运一个细胞的颗粒(小白圆圈中的红色细胞)的过程。黄色箭头大致指示了细胞运动的路径。图像下方的时间时图像采集的相对时间和图像的数字编号(圆圈数字)，数字编号在时间轴上标示为坐标点以直观显示出图像采集的时间。一个骨髓细胞分化为白细胞并在第4小时觉察上游的一个小颗粒细胞的化学信号，并在半小时后将其捕获并搬运的过程。这个过程的观察生物学或医学上有很重要的意义。如白细胞的搬运作用可能与炎症反应刺激癌细胞的转移机制有关。图20则是更详细的白细胞对细胞的转移搬运过程的记录。一个白细胞(黄色)搬运一个细胞颗粒(红色)并传递给一个骨髓细胞(绿色)，然后该细胞颗粒(红色)被另一个白细胞(橙色)夺走的过程。最后一幅图中的黄色箭头和橙色箭头分别表示第一个白细胞(黄色)和第二个白细胞 (橙色)的运动路径，红色箭头表示搬运和传递的细胞颗粒的运动路径。图中数字及坐标轴的意义同图19。海洋有害赤潮甲藻细胞的培养与观察
海洋有害赤潮甲藻细胞是能快速游动的细胞，要在芯片中进行观察需要对芯片进行特别的设计。图21 —沈展示了 SCMC如何结合水坝高度的设计恰到好处地捕获了快速游泳的甲藻细胞，并观察了其孢囊萌发的过程。图21显示甲藻单细胞进样后在速度控制微芯片单元内的典型分布。纵坐标的数字表示每个减速单元内的细胞数(两个水坝之间)。图22 显示培养中被阻隔在水坝前的甲藻细胞。图中的黑色箭头表示液体中的一个颗粒的运动路径，每个箭头的长度表示每秒钟该颗粒移动的距离，该颗粒指示了液体的流速。图23显示一个正在游泳的甲藻细胞在一个减速单元内的运动路径(每秒一幅的叠加图片)。白色箭头指示了游泳的方向和路径，其每一直线段表示其每秒钟移动的距离。图对显示被水坝阻拦的甲藻细胞在培养的过程中蜕皮逃离的过程。白色箭头表示其蜕皮后逃离的路径。图中的小写英文字母为每个蜕皮逃离的细胞编号。图25显示每个蜕皮逃离的细胞的蜕皮过程的连续显微图像截取(截取间隔为30s)。时间顺序为从左到右(见细胞g下方的时间，其他细胞的时间序列与此类似)。图沈显示每个细胞的蜕皮逃离时间在整个坐标轴上的表示。坐标轴上的小写字母与图对和25中的小写字母相对应，表示同样一个细胞。这项技术可以为赤潮爆发机制的研究开辟一条新路。气体交换装置的设计
图27展示了设在芯片(可以是速度控制微芯片单元1或其他位置)中的气体交换装置。 芯片气体交换装置9(称作surface tension alveolus:简称STA)设计的目的是在芯片气体交换装置9内达到气体——液体两相的直接接触，因此设计时两相首先用隔墙(Wall)S 隔开，将芯片内分为气体通道和液体通道，芯片气体交换装置9的设计结构则埋入隔墙8 中，气体交换装置具有连通气体通道和液体通道的通孔81，使得两相在被隔墙8隔开的同时，镶嵌于隔墙8中的芯片气体交换装置9能够为两相间的气体交换提供直接的途径。芯片气体交换装置9实际上可以是半球形的微米级的气泡，即其通孔的孔壁呈半球形面，其半径朝向气体通道一侧，弧顶朝向液体通道一侧。由于表面张力的作用，会形成额外的压强，即Laplace压力，可由Laplace公式(1)计算得出。ΔΡ = Y (1 / R1 + 1 / R2)(1) 式中的Rl和R2为最大和最小曲率半径。气体交换装置的制造
微米级的半球形气泡气体交换装置在芯片中的生成及稳定是气体交换装置能否真正得到的应用，实现气体交换装置的气体交换的功能具有至关重要的作用。为了达到这个目的，并且在蚀刻产生气——液两相的隔墙的时候就同时把产生气体交换装置的微结构植入隔墙中，隔墙的光刻掩模的作了如图观的设计。在气体一侧的隔墙上开一个三角形的缺口。该缺口导致隔墙在生成时形成额外的由气体一侧朝向液体一侧的腐蚀，其腐蚀前沿以三角形的顶点为圆心形成向前不断扩大的半球形腐蚀空间，及至刚好穿透隔墙，即形成可生成气体交换装置的微结构。其半球形的具有方向性的空间使得气体交换装置微泡能够在压力控制下稳定的植入其中，从而能够执行稳定的气体交换功能。腐蚀过程(见图37)中可利用显微镜观察监控。举例说明，欲得到深度为40微米的微通道，隔墙的最终厚度为20微米，可设计掩模上的隔墙宽度为100微米，三角形缺口的高度为25微米，宽度为15微米，这样就可以得到合适的可产生气体交换装置的微结构，见图37。气体交换装置的整体封装方法
通常的玻璃芯片的封装采用热压技术，即采用560摄氏度左右的高温加压的方法让玻璃基片91和玻璃盖片92融合。这是一种永久固化的方法。具有高温加压时易破坏玻璃表面的光学性质，形象成品质量的缺点。同时永久的固化芯片内部的微结构无法拆开清洗，使得芯片的使用寿命大大降低。虽然永久的固化封装不影响气体交换装置的性质，但本发明同时创新了一种非永久性的玻璃芯片的封装方法(图39)。该发明采用弹性钢夹93持续外加压力的方式，使得玻璃的洁净表面在实验中一直处于压力粘合之中，通道的密封特性与永久封装的芯片没有差别，但却可以在实验完成后清洗，以便重复使用。而且，由于避免了高温加压，玻璃芯片的表面无需承受任何的损伤，工艺简单易行，不存在高温加压封装的损失率。气体交换装置的使用方法
作为气体交换装置或溶解气体梯度产生装置应用在芯片中时，需要在气体——液体两相中施加压力差，其中气相一方需要略高一些，以克服液体向气体方向的浸润作用并使得气体交换装置向液体方向伸展，使得气体交换装置的气液界面暴露在液体一方。这样，液体中的溶解气体可以通过气体交换装置的气——液界面扩散到气体相中，气体相中的气体也可以通过气——液界面扩散到液体相中去，从而实现气体交换和溶解气体梯度的形成。由于气体在芯片中的运动速度可以很快(可达lml/s)，气体的切换即使在芯片外进行，也可以保证芯片内的气体交换装置也能在数秒内接收到气体的变化。气体交换装置的稳定控制
气体交换装置的稳定建立在两个方面，即一、容纳具有方向性的半球形微结构与微泡的空间形状像匹配(可以通过控制蚀刻深度控制)；二、稳定的压力控制(图30)。图30展示了压力控制曲率的具体实施过程当气体一方压力增加时，气体交换装置向液体方向伸展， 液泡的曲率增加；当气体一方压力降低时，气体交换装置回缩，曲率下降。这种压力——曲率的控制是一种稳定可重现的控制。因此，要想得到某种曲率的气体交换装置，只需给与某个确定的压力即可。气体交换装置的压力调节范围
气体交换装置被压力所控制，但也只存在于一定的压力范围内。如果压力过大，气体交换装置将过渡向液体相中伸展而导致破裂，气体直接进入液体相；如果压力过小，表面光张力的作用以及液体玻璃界面的浸润作用将使得气体交换装置向气体方向移动，曲率变小直至气体交换装置的半球形形状消失，远离隔离墙对面的液体而失去气体——液体交换的能力。但不同气体——液体——固体界面情况会有不同的表面张力及浸润情况，与此对应的压力调节范围也有所不同。不同表面张力液体在玻璃芯片中的压力调节范围
图 31 展示了 SDS 溶液(CH3 (CH2) 10CH2S03Na, 5mM)，DMEM 液体培养基(Dlubecco，s modified eagle medium, Gibco, USA)，纯水和饱和蔗糖水在20摄氏度下的STA压力—— 曲率实测结果(曲率的测定方法参见图41)。这些数据清楚地展示出不同表面张力液体(SDS<DMEM<H20<蔗糖水)的控制范围，为气体交换装置的稳定可靠的控制提供了有价值的参数。气体交换装置的材料适应范围
由于只用到了表面张力的压力控制，气体交换装置的一整套设计及方法不受芯片材料的限制。如非玻璃的材质，硅片，PDMS等有机材料均可采用这样的设计方法及控制方法。多个气体交换装置气体交换实验
多个的气体交换装置可同时分布在一堵气——液隔墙上，使得多个气体交换装置同时发挥作用(见图四)。采用新提取得鸡血红蛋白可以指示氧气通过气体交换装置从气体相进入液体相的过程(见图32)。该图显示氧气峰面在一分钟内深入到液体相100微米左右。 而两个并排的气体交换装置具有可比较的重现性。单个气体交换装置气体交换实验
为进一步确定气体交换能力，专门设计了芯片(见图38)来测试单个气体交换装置在封闭通道中气体的扩散情况。该实验更为详细地得到了氧气及二氧化碳在血红蛋白的指示下的通过气体交换装置的扩散情况(见图33、34，其中图34为图33的a——b剖面图)。氧气在液体中以 70 μ m/min的速度扩散进液体，但与血红蛋白结合的速度略为推迟，其推进的速度为3. 6 μ m/min。二氧化碳在随后的扩散中替换了氧结合的血红蛋白。气体切换可靠性实验
不同气体间的切换可以直接通过气体相的切换得到。图35是每3分钟切换氧气和氮气的结果。血红蛋白指示出的颜色变化(CCD的光谱数据见图40)展示出气体的切换通过气体交换装置迅速而重现地调节了液体相中的溶解气体梯度。气体切换影响巨噬细胞运动实验
图36为新鲜兔骨髓中巨噬细胞的运动路径受气体交换装置扩散形成的溶解氧梯度变化引起的运动路径的改变情况。
权利要求
1.一种细胞观测实验用芯片，包括流体入口、细胞入口和出口，其特征在于还包括至少一个速度控制微芯片单元。
2.如权利要求1所述的一种细胞观测实验用芯片，其特征在于所述速度控制微芯片单元为线性张开的形状。
3.如权利要求1所述的一种细胞观测实验用芯片，其特征在于所述速度控制微芯片单元从入口开始，每经过一段固定的距离，其宽度就增加一倍。
4.如权利要求3所述的一种细胞观测实验用芯片，其特征在于设速度控制微芯片单元入口处ζ = 0，初始宽度为，出口宽度为I，入口到出口的距离为Z，而每经过距离々就需要把宽度增加为原来的两倍，在距离入口 ζ处的宽度为I，即= /^2“〃)，则所述速度控制微芯片单元的边缘曲线方程式为-.D = Llnl / {In Ve- In W0 )。
5.如权利要求1所述的一种细胞观测实验用芯片，其特征在于所述速度控制微芯片单元中分布有用于协助细胞停留或隔离的凹坑。
6.如权利要求1所述的一种细胞观测实验用芯片，其特征在于所述速度控制微芯片单元中设有用于协助细胞停留或隔离的围栏状突起的水坝。
7.如权利要求6所述的一种细胞观测实验用芯片，其特征在于所述水坝为弧形设计， 使流经水坝的流体方向与水坝正交。
8.如权利要求7所述的一种细胞观测实验用芯片，其特征在于令a为水坝起始半宽， 即X=O时的y值，b为终止半宽，即X=C时的y值，c为起止距离，D为当前距离，L为曲线从开头到X=D点处的长度，再令K = ln(b / a) / c = Sqr (1 + a2 K2 e2DK) ;K2 = Sqr(l + a2 K2)，则水坝弧形曲线的方程式为=L= (K1 - K2 + 111((^ - 1) / (K1 + 1)) / 2 - In((K2 - 1) / (K2 + 1)) / 2) / K。
9.如权利要求1所述的一种细胞观测实验用芯片，其特征在于所述芯片中增加一隔墙，此隔墙将芯片内分为气体通道和液体通道，在隔墙上还设有气体交换装置，气体交换装置具有连通气体通道和液体通道的通孔。
10.如权利要求9所述的一种细胞观测实验用芯片，其特征在于所述通孔的孔壁呈半球形面，其半径朝向气体通道一侧，弧顶朝向液体通道一侧。
11.如权利要求9所述的一种细胞观测实验用芯片，其特征在于气体交换装置由基片和盖片通过弹性钢夹定位而组成。
全文摘要
本发明公开一种细胞观测实验用芯片，包括流体入口、细胞入口和出口，还包括至少一个宽度随位置变化的速度控制微芯片单元。本发明能满足不同细胞在进样、培养以及实验时对流速的不同要求，减小由于微流路状况的不稳定对细胞控制造成的干扰。另外，本发明的芯片中还增加一隔墙，此隔墙将芯片内分为气体通道和液体通道，在隔墙上还设有气体交换装置，气体交换装置具有连通气体通道和液体通道的通孔。此结构能在微观尺度上实现稳定可靠的气体直接交换。
文档编号C12M1/34GK102504997SQ20111033929
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者彭兴跃 申请人:彭兴跃