一种集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法。所述微流控细胞培养芯片，包括依次键合在一起的柔性聚合物主结构层、底膜和支承基底，以及温度控制组件、微泵、微阀和控制电路板等；柔性聚合物主结构层包括至少1个培养液/药液储存池、细胞培养池、废液池、微流体通道、微泵安装区等；微泵安装区内安装有微泵；支承基底上有温控组件安装卡槽；温控组件安装卡槽内安装有温度控制组件；控制电路板上布置有微阀和芯片控制电路；微阀的组装同时实现了芯片的整合。芯片制备工艺主要基于机加工和柔性聚合物模塑成型。本发明提供了一种集成化、工艺简单、流体通道内腔密闭、特别适用于空间在轨细胞学研究等特殊领域的细胞培养装置。
【专利说明】一种集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法
[0001]【技术领域】本发明涉及一种集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，该芯片特别适用于空间在轨细胞学研究等特殊领域的细胞培养，属于微流控芯片【技术领域】。
[0002]【背景技术】空间在轨细胞学研究已逐渐成为空间生命科学研究的重要组成部分，而有无适用的研究仪器设备是此项研究能否顺利进行的关键因素。目前已有一些可用于空间环境下细胞培养和形态观察的装置及技术，能满足细胞换液、加药、录像及固定等功能。但这些设备操作复杂、费时；多数装置的体积比较大；只能获得细胞某一静态时刻的响应信息，无法在空间环境下实时动态地进行细胞学效应研究。 [0003]随着微流控技术的进步，微流控细胞培养芯片为空间细胞学研究提供了新的平台。但是目前已有的微流控细胞培养芯片研究成果仍存在一些不适用于空间在轨细胞学研究的局限:细胞培养相关液体储存池和微流体驱动控制器件如微泵、微阀等多独立于微流控芯片主体之外，导致整个芯片系统较离散、且芯片系统整体体积较大；芯片主体与外部配套设备之间的宏微接口可能为细胞培养引入污染；细胞培养液更换等操作需要人为干预，不适用于载人航天这类缺少专业人员参与的特殊工作环境；培养芯片内部流道结构与外界有直接的气体接触，或细胞培养区为开放结构，因而空间失重因素导致的气液共存可能导致气泡进入细胞培养池而影响细胞的正常生长；芯片加工工艺复杂、成本较高，芯片部组件不易组装更换，不利于一次性使用等。
[0004]
【发明内容】
本发明的目的是提供一种集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，加工出的微流控细胞培养芯片具有集成化、小型化、自动化、微流体通道内腔密闭、芯片部组件易组装更换、适宜一次性使用等特点，特别适用于空间在轨细胞学研究等特殊领域的细胞培养，制备方法工艺简单、成本较低。
[0005]本发明提供的集成化微流控细胞培养芯片，包括依次键合在一起的柔性聚合物主结构层、底膜和支承基底，以及温度控制组件、微泵、微阀和控制电路板等；所述柔性聚合物主结构层包括至少I个培养液/药液储存池、细胞培养池、废液池、微流体通道、微泵安装区等；所述微泵安装区内安装有所述微泵；所述支承基底上有温控组件安装卡槽；所述温控组件安装卡槽内安装有所述温度控制组件；所述控制电路板上布置有所述微阀和芯片控制电路；所述微阀的组装同时实现了芯片的整合。
[0006]本发明提供的集成化微流控细胞培养芯片，其加工步骤包括:
[0007](I)用CNC数控机床精密加工制得所述柔性聚合物主结构层模塑成型用的模具，包括与所述主结构层内部流道结构一致的凸模，以及与所述主结构层外型一致的凹模；
[0008](2)组装所述凸模和凹模，将柔性聚合物预固物注入所述凸模和凹模确定的模塑空间，固化柔性聚合物预固物，脱去所述凹模和凸模，得到所述柔性聚合物主结构层；
[0009](3)硅片上旋涂柔性聚合物预固物、固化后得到所述底膜，键合所述底膜与所述柔性聚合物主结构层；
[0010](4)安装所述微泵于所述微泵安装区，安装所述温度控制组件于所述温控组件安装卡槽；
[0011 ] (5)键合所述支承基底与底膜；[0012](6)焊接或连接所述芯片控制电路相关导线，组装所述微阀；
[0013](7)对所述细胞培养池底面进行表面处理。
[0014]所述细胞培养池顶壁厚度与所述培养液/药液储存池壁厚按照一定比例设计加工，培养液/药液进入所述细胞培养池基于细胞培养池顶壁的弹性形变回复。
[0015]所述底膜是一层柔性聚合物薄膜。
[0016]所述支承基底可以是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板或玻纤板。
[0017]所述柔性聚合物主结构层、底膜和支承基底在对应位置处带有相同形状和尺寸的螺栓安装孔和导线穿出孔。
[0018]所述微泵进出口分别插于所述微泵安装区的微泵进出口安装槽后需将进出口安装槽密封。
[0019]所述温度控制组件包括发热元件ITO导电玻璃和粘在其上的温度敏感元件钼电阻PtlOO或PtlOOO，所述钼电阻的管脚引出温敏元件连接导线，所述ITO导电玻璃两侧镀有金电极，所述金电极引出ITO玻璃供电导线。[0020]所述微阀为电磁常闭微阀，主要包括微阀开闭控制微通道、电磁驱动机构和微阀调节螺母，所述微阀开闭控制微通道为前述微流体通道中位于需要控制其内部流体通断的任意2个储液池之间的一段，所述电磁驱动机构位于所述微阀开闭控制微通道下下方，固定于所述控制电路板上，一对所述微阀调节螺母对称于所述电磁驱动机构固定于所述控制电路板上。
[0021]所述培养液/药液储存池体积与所述细胞培养池体积之比大于所需更换培养液/药液次数，池壁厚度为Omm-0.3mm,但不为O。
[0022]所述细胞培养池底面可以为平面或带有细胞捕获微结构，所述培养池靠近所述微泵入口一侧带有网格状或条状栅栏。
[0023]所述废液池体积大于所述细胞培养池、培养液/药液储存池体积的总和,池壁厚度为Omm-0.3mm,但不为O。
[0024]所述微流体通道宽0.5-1.2mm,最大高度0.1-0.2mm。
[0025]所述柔性聚合物主结构层仅包含微流体通道部分的层厚为0.2-0.5_。
[0026]所述底膜仅包含微流体通道部分的层厚为0-0.3mm,但不为O。
[0027]所述微流体通道在各个所述培养液/药液储存池到所述细胞培养池之间的路径形状可以相同，或选择适当路径令某些储存池相应支路的流阻大于其他储存池相应支路流阻。
[0028]所述柔性聚合物主结构层与底膜键合形成的内腔与外界不连通。
[0029]所述微泵泵体上有柔性控制插头，与所述芯片控制电路中的微泵转接头插接后驱动所述微泵。
[0030]所述控制电路板位于所述细胞培养池正下方处开有细胞培养池观察窗口。
[0031 ] 所述控制电路板一侧有金手指，可插接芯片外计算机接口或专用供电接口为所述芯片控制电路供电，以及与芯片外计算机通讯。
[0032]所述芯片控制电路供电电压为5-12V。
[0033]所述培养液/药液储存池和废液池可以在所述柔性聚合物主结构层上一体化成型，也可以先分别加工出单个储液池后再键和到不包括所述培养液/药液储存池和废液池的柔性聚合物主结构层上。
[0034]对所述细胞培养池底面进行表面处理,可以用聚多巴胺(PDA)、多聚赖氨酸(PLL)或鼠尾胶原蛋白I型中的任意一种溶液进行包被。
[0035]本发明提供的集成化微流控细胞培养芯片工作过程为:开始培养细胞时，去除柔性聚合物主结构层与底膜键和形成的内腔中的气体后用注射器将培养液/药液、细胞悬液分别依次注入培养液/药液储存池和细胞培养池，控制电路板一侧的金手指插入芯片外计算机接口或专用供电接口为芯片控制电路供电，细胞培养池内部温度稳定于预设温度，因微阀常闭，内腔中没有液体流动。细胞开始贴壁并生长。需要向细胞培养池中更换入新的培养液/药液时，微泵及微泵到废液池之间的微阀开启，细胞培养池中原有废液排到废液池中，同时细胞培养池顶壁向底部塌陷。当废液排出量和细胞培养池顶壁塌陷达到预定程度时，微泵及微泵到废液池之间的微阀关闭，培养液/药液储存池到细胞培养池之间的微阀开启，培养液/药液储存池中的培养液/药液随着细胞培养池顶壁的弹性形变回复和培养液/药液储存池池壁的塌陷而进入细胞培养池。新的培养液/药液充满细胞培养池后，培养液/药液储存池到细胞培养池之间的微阀关闭，开始新一轮的细胞静态培养，直至下一轮更换新的培养液/药液时，重复上述微泵微阀工作时序。
[0036]本发明提出的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法的显著特点为:培养液/药液储存池、细胞培养池、废液池等所有储液池和微泵、微阀等微流体驱动控制器件都集成到微流控细胞培养芯片中，芯片整体体积远小于需要外部配套设备的传统微流控细胞培养芯片，且避免了传统微流控细胞培养芯片中芯片主体与外部配套设备之间的宏微接口污染；细胞培养池中的液体更换通过控制微泵微阀的工作时序实现，芯片完全自动化工作，无需人为干预；柔性聚合物主结构层与底膜键合形成的内腔与外界不连通，避免了外界气体进入细胞培养池影响细胞的正常生长；基于细胞培养池项壁弹性形变回复的进样方式，使细胞培养池内部的原有废液排出更加彻底，同时减少了为微流体驱动部件供电的时间，进而减小了全培养周期的功耗；芯片的主要加工工艺为机加工和柔性聚合物模塑成型，操作简单；微阀和微泵可以回收，组装到新的细胞培养芯片内，降低了制作成本；前述的集成化、小型化、自动化、微流体通道内腔密闭、芯片部组件容易组装更换、适宜一次性使用等特点，特别适用于空间在轨细胞学研究等特殊领域的细胞培养。`【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为本发明提供的集成化微流控细胞培养芯片结构三维分解示意图
[0038]图2为本发明提供的集成化微流控细胞培养芯片组装后的三维结构示意图
[0039]图3为本发明柔性聚合物主结构层模塑成型时使用的模具凸模三维结构示意图
[0040]图4本发明柔性聚合物主结构层模塑成型时使用的模具凹模三维结构示意图
[0041]图5本发明柔性聚合物主结构层模塑成型时使用的模具凸模与凹模组装后结构示意图。
[0042]图6为本发明制备柔性聚合物主结构层时采用非一体化成型工艺时首先单独加工出的储液池三维结构局部剖切示意图。
【具体实施方式】[0043]下面结合附图对本发明做进一步说明。
[0044]本发明提供的集成化微流控细胞培养芯片结构如图1和图2所示，包括依次键合在一起的柔性聚合物主结构层1、底膜2和支承基底3，以及温度控制组件、微泵9、微阀和控制电路板4等；柔性聚合物主结构层I包括至少I个培养液/药液储存池5、细胞培养池6、废液池12、微流体通道7、微泵安装区8等；底膜2是一层柔性聚合物薄膜；支承基底3可以是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板或玻纤板；柔性聚合物主结构层1、底膜2和支承基底3在对应位置处带有相同形状和尺寸的螺栓安装孔23和导线穿出孔24 ;微泵安装区8内安装有微泵9，其进出口分别插于微泵安装区8的微泵进出口安装槽且进出口安装槽需密封；支承基底3上有温控组件安装卡槽25，其内部安装有温度控制组件，温度控制组件包括发热元件ITO导电玻璃14和粘在其上的温度敏感元件钼电阻13，ITO导电玻璃14两侧镀有金电极，并引出ITO玻璃供电导线15，钼电阻13的管脚引出温敏元件连接导线21 ;控制电路板4上布置有芯片控制电路20 ;温敏元件连接导线21和ITO玻璃供电导线15穿过导线穿出孔24后焊接到芯片控制电路20的相应位置；微阀为电磁常闭微阀，主要包括微阀开闭控制微通道7、电磁驱动机构16和微阀调节螺母17，微阀开闭控制微通道7为前述微流体通道7中位于需要控制其内部流体通断的任意2个储液池之间的一段，电磁驱动机构16位于微阀开闭控制微通道7正下方，固定于控制电路板4上，一对微阀调节螺母17对称于电磁驱动机构16固定在控制电路板4上，组装微阀时，微阀紧固螺栓11穿过螺栓安装孔23与微阀调节螺母17配合，同时实现整个细胞培养芯片的整合。
[0045]培养液/药液储存池5的体积与细胞培养池6的体积之比大于所需更换培养液/药液次数，池壁厚度为Omm-0.3mm,但不为O。细胞培养池6底面可以为平面或带有细胞捕获微结构，在靠近所述微泵9入口一侧带有网格状或条状栅栏。细胞培养池6的顶壁厚度与培养液/药液储存池5的壁厚按照一定比例设计加工，令培养液/药液进入细胞培养池6是基于细胞培养池顶壁的弹性形变回复。废液池12的体积大于细胞培养池5、培养液/药液储存池6体积的总和，池壁厚度为Omm-0.3_，但不为O。微流体通道7宽0.5-1.2_，最大高度0.1-0.2_。柔性聚合物主结构层I中仅包含微流体通道7部分的层厚为0.2-0.5_。底膜2中仅包含微流体通道7部分的层厚为0-0.3mm，但不为O。微流体通道7在不同培养液/药液储存池5到细胞培养池6之间的路径形状可以选择如图1和图2所示，使药液储存池相应支路的流阻大于培养液储存池相应支路的流阻，也可以所有支路的路径形状相同。柔性聚合物主结构层I与底膜2键合形成的内腔与外界不连通。微泵9泵体上有柔性控制插头10，与芯片控制电路20中的微泵转接头18插接后驱动微泵9。钼电阻13可以是PtlOO或PtlOOO。控制电路板4位于细胞培养池6正下方处开有细胞培养池观察窗口 19。控制电路板4 一侧有金手指22，可插接芯片外计算机接口或专用供电接口为芯片控制电路20供电，以及与芯片外计算机通讯。芯片控制电路20供电电压为5-12V。培养液/药液储存池5和废液池12可以基于图3所示模具在柔性聚合物主结构层I上一体化成型，也可以先分别加工出图6所示的单个储液池后再键和到不包括培养液/药液储存池和废液池的柔性聚合物主结构层上。
[0046]培养细胞前，先将整个细胞培养芯片在60°C恒温干燥箱中放置24h干热灭菌，再用聚多巴胺(PDA)、多聚赖氨酸(PLL)或鼠尾胶原蛋白I型中的任意一种溶液对细胞培养池6底面进行表面处理。[0047]制备本发明提供的集成化微流控细胞培养芯片时，首先用CNC数控机床精密加工制得图3~图5所示的柔性聚合物主结构层模塑成型用模具，包括如图3所示的与主结构层内部流道结构一致的凸模，以及如图4所示的与主结构层外型一致的凹模；组装凸模和凹模得到图5所示的完整模具，将柔性聚合物预固物注入凸模和凹模确定的模塑空间，固化柔性聚合物预固物，脱去凹模和凸模，得到柔性聚合物主结构层I ;在硅片上旋涂柔性聚合物预固物、固化后得到底膜2，键合底膜2与柔性聚合物主结构层I ;将微泵9安装于微泵安装区8，再将温度控制组件安装于温控组件安装卡槽25 ;键合支承基底3与底膜2 ;把温敏元件连接导线21和ITO玻璃供电导线15焊接到芯片控制电路20的相应位置；组装微阀，同时完成整个细胞培养芯片整合；将微泵柔性控制插头10与微泵转接头18插接；最后对细胞培养池6底面进行表面处理。
[0048]开始培养细胞时，先去除柔性聚合物主结构层I与底膜2键和形成的内腔中的气体，再用注射器将培养液/药液、细胞悬液分别依次注入培养液/药液储存池5和细胞培养池6 ;把控制电路板4 一侧的金手指22插入芯片外计算机接口或专用供电接口为芯片控制电路20供电，将细胞培养池6内部温度稳定于预设温度，因微阀常闭，内腔中没有液体流动。细胞开始贴壁生长。需要向细胞培养池6中更换入新的培养液/药液时，开启微泵9及微泵9到废液池12之间的微阀，细胞培养池6中原有废液排到废液池12中，同时细胞培养池顶壁向底部塌陷。当废液排出量和细胞培养池顶壁塌陷达到预定程度时，微泵9及微泵9到废液池12之间的微阀关闭，培养液/药液储存池5到细胞培养池6之间的微阀开启，培养液/药液储存池5中的培养液/药液随着培养池顶壁的反弹和培养液/药液储存池5池壁的塌陷而进入细胞培养池6。新的培养液/药液充满细胞培养池6后，培养液/药液储存池5到细胞培养池6之间的微阀关闭，开始新一轮的细胞静态培养，直至下一轮更换新的培养液/药液时，重复上述微泵微阀工作时序。培养液/药液储存池5及相应微流道支路、微阀数量至少是1，当数量大于I时，各路培养液/药液的更换一般分别进行，即细胞培养池6与各个培养液/药液储存池之间的各个微阀不会同时开启。
【权利要求】
1.一种集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，所述微流控细胞培养芯片，包括依次键合在一起的柔性聚合物主结构层、底膜和支承基底，以及温度控制组件、微泵、微阀和控制电路板等；所述柔性聚合物主结构层包括至少I个培养液/药液储存池、细胞培养池、废液池、微流体通道、微泵安装区等；所述微泵安装区内安装有所述微泵；所述支承基底上有温控组件安装卡槽；所述温控组件安装卡槽内安装有所述温度控制组件；所述控制电路板上布置有所述微阀和芯片控制电路；所述微阀的组装同时实现了芯片的整合。
2.按权利要求1所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，其加工步骤包括: (1)用CNC数控机床精密加工制得所述柔性聚合物主结构层模塑成型用的模具，包括与所述主结构层内部流道结构一致的凸模，以及与所述主结构层外型一致的凹模； (2)组装所述凸模和凹模，将柔性聚合物预固物注入所述凸模和凹模确定的模塑空间，固化柔性聚合物预固物，脱去所述凹模和凸模，得到所述柔性聚合物主结构层； (3)硅片上旋涂柔性聚合物预固物、固化后得到所述底膜，键合所述底膜与所述柔性聚合物主结构层； (4)安装所述微泵于所述微泵安装区，安装所述温度控制组件于所述温控组件安装卡槽； (5)键合所述支承基底与底膜； (6)焊接或连接所述芯片控制电路相关导线，组装所述微阀； (7)对所述细胞培养池底面进行表面处理。`
3.按权利要求1或2所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述细胞培养池顶壁厚度与所述培养液/药液储存池壁厚按照一定比例设计加工，培养液/药液进入所述细胞培养池基于细胞培养池顶壁的弹性形变回复。
4.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述底膜是一层柔性聚合物薄膜；所述支承基底可以是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板或玻纤板；所述柔性聚合物主结构层、底膜和支承基底在对应位置处带有相同形状和尺寸的螺栓安装孔和导线穿出孔。
5.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述温度控制组件包括发热元件ITO导电玻璃和粘在其上的温度敏感元件钼电阻PtlOO或PtlOOO，所述钼电阻的管脚引出温敏元件连接导线，所述ITO导电玻璃两侧镀有金电极，所述金电极引出ITO玻璃供电导线。
6.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述微阀为电磁常闭微阀，主要包括微阀开闭控制微通道、电磁驱动机构和微阀调节螺母，所述微阀开闭控制微通道为前述微流体通道中位于需要控制其内部流体通断的任意2个储液池之间的一段，所述电磁驱动机构位于所述微阀开闭控制微通道正下方，固定于所述控制电路板上，一对所述微阀调节螺母对称于所述电磁驱动机构固定于所述控制电路板上。
7.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述培养液/药液储存池体积与所述细胞培养池体积之比大于所需更换培养液/药液次数，池壁厚度为Omm-0.3mm，但不为O ;所述废液池体积大于所述细胞培养池、培养液/药液储存池体积的总和，池壁厚度为Omm-0.3mm，但不为O。
8.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述细胞培养池底面可以为平面或带有细胞捕获微结构，所述培养池靠近所述微泵入口一侧带有网格状或条状栅栏。
9.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述微流体通道宽0.5-1.2mm，最大高度0.1-0.2mm ;柔性聚合物主结构层仅包含微流体通道部分的层厚为0.2-0.5mm ;底膜仅包含微流体通道部分的层厚为0-0.3_，但不为O。
10.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述微流体通道在不同的所述培养液/药液储存池到所述细胞培养池之间的路径形状可以相同，或选择适当路径令某些储存池相应支路的流阻大于其他储存池相应支路流阻。
11.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述柔性聚合物主结构层与所述底膜键合形成的内腔与外界不连通。
12.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述控制电路板位于所述细胞培养池正下方处开有细胞培养池观察窗口 ；控制电路板一侧有金手指，可插接芯片外计算机接口或专用供电接口为所述芯片控制电路供电，以及与芯片外计算机通讯；芯片控制电路供电电压为5-12V。
13.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，所述培养液/药液储存池和废液池可以在所述柔性聚合物主结构层上一体化成型，也可以先分别加工出单个储液池后再键和到不包括所述培养液/药液储存池和废液池的柔性聚合物主结构层上。
14.按权利要求1-3中任一所述的集成化微流控细胞培养芯片及其制备方法，其特征在于，对所述细胞培养池底面进行表面处理，可以用聚多巴胺(PDA)、多聚赖氨酸(PLL)或鼠尾胶原蛋白I型中的任意一种溶液进行包被。
【文档编号】C12M3/00GK103667054SQ201310426589
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】施镠佳, 谭映军, 董景新, 王春艳, 顾寅, 叶雄英, 聂捷琳, 于建茹, 李莹辉 申请人:中国航天员科研训练中心, 清华大学