Eml4-alk融合基因荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种EML4‐ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，适用于肺腺癌中EML4‐ALK融合基因突变的检测。本发明所述的试剂盒包括针对EML4‐ALK融合基因9种融合变体的保守序列特异设计的探针及引物以及阳性对照物。该试剂盒能快速、准确、高敏感度地检测9种最常见的EML4‐ALK融合基因变体，包括亚型1（E13；A20）、亚型2（E20；A20）、亚型3（E6a/b；A20）、亚型4（E14；A20）、亚型5（E2a/b；A20）、亚型6（E18；A20）、亚型7（E14；A20）7种变异亚型的9种融合变体，从而建立检测9种最常见EML4‐ALK融合基因变体的实时荧光定量PCR体系。
【专利说明】EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及一种EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测的试剂盒，适用于肺腺癌中EML4-ALK融合基因突变的检测。
【背景技术】
[0002]肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。近50多年来，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和病死率均迅速上升。1995年全世界有60万人死于肺癌，而且每年人数都在上升，2003年世界卫生组织(WHO)公布的死亡率是110万/年，发病率是120万/年。肺癌的病因至今尚不完全明确，医学统计表明肺癌的致病因素主要为吸烟(包括二手烟)，80%的男性肺癌和75%的女性肺癌是由吸烟造成的，此外与石绵、氡、砷、电离辐射、卤素烯类、多环性芳香化合物、镍等工业致癌物的接触，种族、家属史对肺癌的发病均有影响。
[0003]肺癌分小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，NSCLC包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌、类癌等。NSCLC占所有肺癌病例的80% — 90%，严重威胁人类健康。NSCLC的治疗包括手术、化疗、放疗、分子靶向治疗及生物免疫治疗等多种方法。手术治疗是NSCLC最佳治疗方法，但当NSCLC发现时，仅20% — 30%的病例有手术指征，且术后复发和转移率仍高达50%以上。分子靶向治疗以其符合生理、低毒和理论上高效的特点，越来越成为非小细胞肺癌治疗的热点。祀向治疗为肺癌的治疗增添了一个新的领域，也为肺癌的治疗带来了新的希望。
[0004]分子靶向治疗是一种针对肿瘤发生、发展过程的细胞信号传导及其他生物学途径的治疗手段，其特点是能选择性地作用于肿瘤细胞，定向阻断癌细胞的增殖、转移、信号传导，阻止肿瘤新生血管的生成，破坏癌细胞的新陈代谢，故特异性高，不良反应小，拥有良好的发展前景。肺癌靶向治疗涉及肿瘤细胞生长的多个重要环节，目前研究较为成熟且应用于临床的主要有两个作用点，`一个是血管内皮生长因子受体(VEGFR)，另一个为表皮生长因子受体(EGFR)。此外，还有最新发现的棘皮动物微管结合蛋白4-间变淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like4, EML4-ALK)融合基因。已有研究提不该融合基因可能存在于肺癌在内的多种实体肿瘤，但以NSCLC的检出率最闻，同时因其与EGFR突变、K-ras突变的不共存现象以及含有EML4-ALK基因患者的鲜明临床特征，提示该靶点是肺腺癌特异性较高的分子标记物。EML4-ALK的发现定义了 NSCLC的一个新亚型，堪称近年来NSCLC研究史上一个里程碑式的事件。编码EML4的基因位于2号染色体短臂的21号基因座位，而编码ALK的基因位于2号染色体23号基因座位，两者在染色体上相隔约1270万个碱基对，且转录方向相反。基因融合时，EML4基因在染色体上发生断裂，形成不同长度的外显子拼接片段，调转方向，插人位置相对保守的ALK基因19、20外显子之间，从而形成长度不等的各种EML4-ALK融合变体，目前，至少已经发现了 9种变异亚型，分别为亚型I (E13 ；A20)(这种命名法指的是EML4的13号外显子与ALK的20号外显子发生融合)、亚型 2 (E20 ;A20)、亚型 3 (E6a/b ;A20)、亚型 4 (E14 ;A20)、亚型 5 (E2a/b ;A20)、亚型6 (E13 ；A20)(注:亚型6为EML4的第13外显子加上一个49bp的小片段再与ALK的第20外显子相连)、亚型7 (E14 ;A20)、亚型8 (E15 ;A20)、亚型9 (E18 ;A20)。最常见的融合变体为亚型I (E13 ;A20)，其次为亚型3 (E6a/b ;A20)，经检测，这两种变体在EML4-ALK融合基因NSCLC患者的发生率分别为33%和29%。所有这些融合基因均有生物学功能，表达产物为一种嵌合型酪氨酸激酶。EML4-ALK融合变异日前已经被鉴定为NSCLC，特别是肺腺癌的一个独特的分子亚型，EML4-ALK融合基因阳性患者有其独特的临床病理特征。针对这一靶点的检测，将有助于筛选EGFR-TKI合适的治疗人群并开启NSCLC靶向治疗的新领域。
[0005]目前国际上检测EML4-ALK融合基因常见的技术方法有:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学(IHC)、RACE-偶联PCR测序(RACE-coupledPCR sequencing)。
[0006]RT-PCR是PCR的一种广泛应用的变形，在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR可能是确认NSCLC存在ALK融合基因的一种快速诊断方法，理论上，这种技术的优势在于其检测突变转录本的高敏感性，如发现扩增产物则意味着ALK融合基因。但在临床实践中，该技术面临诸多挑战:(I)引物多元化，研究需要设计多个引物检测9个变异体和2个非EMIA易位；(2)福尔马林固定石蜡包埋的组织DNA高度片段化，不利于检测；(3)PCR结果常出现假阳性，很难作为常规临床检测方法。
[0007]FISH是用特定荧光标记探针与靶DNA进行杂交，通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，在荧光显微镜下观察探针标记或位点的技术。FISH是检测ALK融合基因更加特异的方法，其优势在于可商业开发系列探针，应用于肺腺癌检测ALK融合基因。虽然FISH是检测肺腺癌ALK融合基因的一种敏感和特异的方法，但也并非万无一失的，而且不能鉴别不同的EML4-ALK融合基因变体。不同数量断裂信号的治疗策略以及结果判读目前仍无统一标准。
[0008]IHC是指带显色剂标记 的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。IHC的最大优势是检测肿瘤特异性抗原的表达而不丢失能鉴别正常组织和病理组织的细胞和组织结构特征。对于活检组织切片使用组织染色来检测ALK蛋自表达，结果可能是微弱和局部的，同时IHC方法总是存在一定的主观性，对弱阳性结果的判断需要进一步用FISH等技术来验证。此外IHC同样不能鉴定ALK融合患者具体属于那种变体亚型。
[0009]广东省肺癌研究所吴一龙教授课题组采用RACE-偶联PCR测序技术检测分析ALK基因的融合变异，该方法的独到之处在于采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术结合两轮PCR技术来富集扩增ALK基因的融合变体，敏感性高，不但能检测EML4与ALK的融合，而且可以检测到其他任何基因与ALK的融合，还进一步通过测序的手段能够明确融合是来自EML4-ALK多种变体中的具体哪一种。但是，此方法涉及两轮PCR和测序，步骤繁琐且耗时，成本昂贵，难以普及推广。
[0010]最新出现的实时荧光定量PCR把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号检测PCR产物，解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题，避免了普通定量PCR操作过程中的污染，使其操作简便、快捷，结果准确，已成为基因表达定量的强有力的工具，具有敏感性和特异性高、重复性好及定量范围广等特点。定量检测要求检测方法敏感、特异、准确、精确、重复性好、线性范围广，且在各个基因型之间无差异。全自动的荧光定量PCR因其更优异的准确性、精确度和可重复性，成为最有前景的定量检测技术。
[0011]实时突光定量PCR 技术(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ_PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的突光探针,该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端一 3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
【发明内容】
[0012]本发明的目的在于提供一种EML4-ALK融合基因变体的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒能快速、准确、高敏感度地检测9种最常见的EML4-ALK融合基因变体，包括亚型I(E13 ;A20)、亚型 2 (E20 ;A20)、亚型 3 (E6a/b ;A20)、亚型 4 (E14 ;A20)、亚型 5 (E2a/b ；A20)、亚型6 (E18 ;A20)、亚型7 (E14 ;A20)7种变异亚型的9种融合变体，从而建立检测9种最常见EML4-ALK融合基因变体的实时荧光定量PCR体系。
[0013]本发明采用以下技术措施:一种快速、准确检测EML4-ALK融合基因的荧光定量PCR检测试剂盒。该试剂盒包括荧光定量反应液预混液(PCR Master Mix)、荧光定量反应液A、荧光定量反应液B、荧光定量反应液C、荧光定量反应液D、荧光定量反应液E、荧光定量反应液F、荧光定量反应液G、荧光定量反应液H、荧光定量反应液I，阳性对照样品A、阳性对照样品B、阳性对照样品C、阳性对照样品D、阳性对照样品E、阳性对照样品F、阳性对照样品G、阳性对照样品H、阳性对照样品`I。
[0014]荧光定量反应液A:检测的是EML4-ALK亚型I (E13 ；A20)融合基因。
[0015]反应体系包括:检测EML4-ALK亚型I (E13 ；A20)融合基因的引物和探针。
[0016]变体1-正向引物:5’ -GAGTCATGCTTATATGGAGCAAAACT-3’ (SEQ ID N0.1)。
[0017]变体1-反向引物:5’ -TCAGCTTGTACTCAGGGCTCTG-3’(SEQ ID N0.2)。
[0018]变体1-荧光探针:5’ -FAM-CCTAAAGTGTACCGCCGGAAGCACC-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.3)。
[0019]荧光探针的5 ^端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
[0020]阳性对照样品A:包含所检测EML4-ALK亚型I (E13 ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒。
[0021]荧光定量反应液B:检测的是EML4-ALK亚型2 (E20 ；A20)融合基因。
[0022]反应体系包括:检测EML4-ALK亚型2 (E20 ；A20)融合基因的引物和探针。
[0023]变体2-正向引物:5’ -AAGTATATAATGTCTAACTCGGGAGACTATGA-3’ (SEQ ID N0.4)0
[0024]变体2-反向引物:5’ -AGCAGTAGTTGGGGTTGTAGTCG-3’(SEQ ID N0.5)。[0025]变体2-荧光探针:5’ -FAM-TTGTACTTGTACCGCCGGAAGCACCA-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.6)。
[0026]荧光探针的5 ^端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
[0027]阳性对照样品B:包含所检测EML4-ALK亚型2 (E20 ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒。
[0028]荧光定量反应液C:检测的是EML4-ALK亚型3a (E6a ；A20)融合基因。
[0029]反应体系包括:检测EML4-ALK亚型3a (E6a ；A20)融合基因的引物和探针。
[0030]变体3a-正向引物:5’ -ACCAAAACTGCAGACAAGCATAAAG-3’ (SEQ ID N0.7)。
[0031]变体3a-反向引物:5’ -AGCTTGCTCAGCTTGTACTCAGG-3’(SEQ ID N0.8)。
[0032]变体3a-荧光探针:5’ -FAM-TGTCATCATCAACCAAGTGTACCGCCG-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.9)。
[0033]荧光探针的5 ^端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
[0034]阳性对照样品C: 包含所检测EML4-ALK亚型3a (E6a ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒。
[0035]荧光定量反应液D:检测的是EML4-ALK亚型3b (E6b ；A20)融合基因
[0036]反应体系包括:检测EML4-ALK亚型3b (E6b ；A20)融合基因的引物和探针。
[0037]变体3b-正向引物:5’ -AACACCCAAATTAATACCAAAAGTTACC-3’ (SEQ ID N0.10)。
[0038]变体3b-反向引物:5’ -CAGCTCCTGGTGCTTCCG-3’(SEQ ID N0.11)。
[0039]变体3b-荧光探针:5’ -FAM-AATGTCAACTCGCGAAA-TAMRA-3’ (SEQ ID N0.12)。
[0040]荧光探针的5 ^端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
[0041]阳性对照样品D:包含所检测EML4-ALK亚型3b (E6b ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒。
[0042]荧光定量反应液E:检测的是EML4-ALK亚型4 (E14 ；A20)融合基因。
[0043]反应体系包括:检测EML4-ALK亚型4 (E14 ；A20)融合基因的引物和探针。
[0044]变体4-正向引物:5’ -AGTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTCA-3’(SEQ ID N0.13)。
[0045]变体4-反向引物:5’ -TTGTCAGATGAGAAATGGGATGTTA-3’ (SEQ ID N0.14)。
[0046]变体4-荧光探针:5’ -FAM-AGCTTGTACTCAGGGCTCATCCAGCATATCTCTA-TAMRA-3’(SEQ IDN0.15)。
[0047]荧光探针的5 ^端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
[0048]阳性对照样品E:包含所检测EML4-ALK亚型4 (E14 ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒。
[0049]荧光定量反应液F:检测的是EML4-ALK亚型5a (E2a ；A20)融合基因。
[0050]反应体系包括:检测EML4-ALK亚型5a (E2a ；A20)融合基因的引物和探针。
[0051]变体5a-正向引物:5，-GTTTTGAGGCGTCTTGCAATCT-3’ (SEQ ID N0.16)。
[0052]变体5a-反向引物:5’ -GGTTGTAGTCGGTCATGATGGTC-3’(SEQ ID N0.17)。
[0053]变体5a-荧光探针:5’ -FAM-CTCAAGTAAAGTGTACCGCCGGAAGCA-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.18)。
[0054]荧光探针的5 ^端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
[0055]阳性对照样品F:包含所检测EML4-ALK亚型5a (E2a ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒。
[0056]荧光定量反应液G:检测的是EML4-ALK亚型5b (E2b ；A20)融合基因。
[0057]反应体系包括:检测EML4-ALK亚型5b (E2b ；A20)融合基因的引物和探针。
[0058]变体5b-正向引物:5’ -GTGCTTCCGGCGGTACACT-3’ (SEQ ID N0.19)。
[0059]变体5b-反向引物:5’ -TTGAGGCGTCTTGCAATCTCT-3’(SEQ ID N0.20)。
[0060]变体5b-荧光探针:5，-FAM-CCTCCCCTGAGCTCTGAACCTTTACTTGA-TAMRA-3 ’( SEQ IDN0.21)。
[0061]荧光探针的5'端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
[0062]阳性对照样品G:包含所检测EML4-ALK亚型亚型5b (E2b ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒。
[0063]荧光定量反应液H:检测的是EML4-ALK亚型6 (E18 ；A20)融合基因
[0064]反应体系包括:检测EML4-ALK亚型6 (E18 ；A20)融合基因的引物和探针。
[0065]变体6-正向引物:5’ -GGGTGGTCAGCTGCAACAT-3’(SEQ ID N0.22)。
[0066]变体 6-反向引物:5’ -GAGACTCAGGTGGAGTCATGCTT-3’(SEQ ID N0.23)。
[0067]变体6-荧光探针:5’-FAM-CCACTTCCTTTAGGTCCTTTCCCAGGTGT-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.24)。荧光探针的Y端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
[0068]阳性对照样品H:包含所检测EML4-ALK亚型6 (E18 ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒。
[0069]荧光定量反应液1:检测的是EML4-ALK亚型7 (E14 ；A20)融合基因。
[0070]反应体系包括:检测EML4-ALK亚型7 (E14 ；A20)融合基因的引物和探针。
[0071]变体7-正向引物:5’ -CAGTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC-3’(SEQ ID N0.25)。
[0072]变体7-反向引物:5’ -TTGTCAGATGAGAAATGGGATGTTAT-3’ (SEQ ID N0.26)。
[0073]变体7-荧光探针:5’ -FAM-TGGCTTGCAGCTCCTGGTGCTCTATT-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.27)。
[0074]荧光探针的5 ^端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
[0075]阳性对照样品1:包含所检测EML4-ALK亚型7 (E14 ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒。
[0076]本发明所述的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒的原理为:采用荧光定量PCR方法对EML4-ALK融合基因进行定量检测。分别针对EML4-ALK融合基因9种融合变体的保守序列特异设计TaqMan探针及引物一对，当遇到EML4-ALK融合基因相应融合变体特定基因序列时，TaqMan探针可与之完全结合，PCR扩增时，荧光报告基团因酶解分离而发出荧光，能够实时检测相应荧光信号的积累，从而实现检测EML4-ALK融合基因含量的目的。
[0077]本发明提供的9种融合变体的全基因序列虽然是GENBANK已公开的序列，但保守序列的确定却是需要筛选比对以及实验验证的，选定好保守序列之后，再通过Primerf软件进行设计引物和探针序列，并于NCBI上blast验证其特异性后再经过大量的实验验证，并优化反应相关条件。
[0078]本发明提供的两端都标有突光发光基团的特异性突光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5' -3'外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。 [0079]与现有检测方法比较，本技术采用荧光定量PCR技术检测EML4-ALK融合基因具有以下优势:
[0080]1.检测灵敏度高，特异性好:本发明分别针对EML4-ALK融合基因9种变异体设计了特异性引物和荧光探针，相关反应液分管进行检测，可以排除各引物间的干扰，比将采用混合反应液的情形更能极大地提高检测特异性和灵敏度，且假阳性低
[0081]2.线性关系好，可定量检测，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小；
[0082]3.操作简单，自动化程度高，FQ-PCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少，因此也就降低了结果偏差的几率；
[0083]4.结果判读明确、直观，可对结果进行定量分析。荧光定量PCR法结果的判读:在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单、直观；
[0084]5.检测的样本量大，一次最多可检测384例；
[0085]6.安全:整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害；
[0086]7.没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。
[0087]8.本发明提供的特异性检测试剂盒能一次性筛查EML4-ALK融合基因9种变异体，快速简便。
【专利附图】
【附图说明】
[0088]图1 为 EML4-ALK 亚型 I (E13 ；A20)融合基因的 FQ-PCR 图。
[0089]图2为EML4-ALK亚型I (E13 ；A20)融合基因的测序结果图。
[0090]图3 为 EML4-ALK 亚型 2 (E20 ；A20)融合基因的 FQ-PCR 图。
[0091]图4为EML4-ALK亚型2 (E20 ；A20)融合基因的测序结果图。
[0092]图5 为 EML4-ALK 亚型 3a (E6a ；A20)融合基因的 FQ-PCR 图。
[0093]图6为EML4-ALK亚型3a (E6a ；A20)融合基因的测序结果图。
[0094]图7 为 EML4-ALK 亚型 3b (E6b ；A20)融合基因的 FQ-PCR 图。
[0095]图8为EML4-ALK亚型3b (E6b ；A20)融合基因的测序结果图。
[0096]图9 为 EML4-ALK 亚型 4 (E14 ；A20)融合基因的 FQ-PCR 图。
[0097]图10为EML4-ALK亚型4 (E14 ；A20)融合基因的测序结果图。
[0098]图11 为 EML4-ALK 亚型 5a (E2a ；A20)融合基因的 FQ-PCR 图。
[0099]图12为EML4-ALK亚型5a (E2a ；A20)融合基因的测序结果图。
[0100]图13 为 EML4-ALK 亚型 5b (E2b ；A20)融合基因的 FQ-PCR 图。
[0101]图14为EML4-ALK亚型5b (E2b ；A20)融合基因的测序结果图。[0102]图15 为 EML4-ALK 亚型 6 (E18 ；A20)融合基因的 FQ-PCR 图。
[0103]图16为EML4-ALK亚型6 (E18 ；A20)融合基因的测序结果图。
[0104]图17 为 EML4-ALK 亚型 7 (E14 ；A20)融合基因的 FQ-PCR 图。
[0105]图18为EML4-ALK亚型7 (E14 ；A20)融合基因的测序结果图。
[0106]图19为EML4-ALK融合基因特异性检测的FQ-PCR图。
【具体实施方式】
[0107]样本说明:下面实施例中所用阳性样本收集自中山大学附属肿瘤医院病理科临床病理诊断的EML4-ALK基因融合的蜡块组织。从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应用。
[0108]实施例1:EML4-ALK亚型I (E13 ；A20)融合基因的检测设计能特异性检测EML4-ALK亚型I (E13 ；A20)融合基因的探针及引物一对:
[0109]变体1-正向引物:5’ -GAGTCATGCTTATATGGAGCAAAACT-3’ (SEQ ID N0.1)；
[0110]变体1-反向引物:5’ -TCAGCTTGTACTCAGGGCTCTG-3’ (SEQ ID N0.2)；
[0111]变体1-Taqman-探针:5’ -FAM-CCTAAAGTGTACCGCCGGAAGCACC-TAMRA-3’ (SEQ IDN0.3)；
[0112]然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测:反应体系为15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探针各 0.2μ I (20μ Μ)，样品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*Taqmanuniversal PCR0
[0113]Master Mix (购自美国应用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0114]PCR反应条件:95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，扩增反应65个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图1所示，为EML4-ALK亚型I (E13 ；A20)融合基因阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例1中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出EML4-ALK亚型I (E13 ；A20)融合基因，如图2所示,通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定EML4-ALK亚型
I(E13 ；A20)融合基因突变情况。
[0115]实施例2:EML4-ALK亚型2 (E20 ；A20)融合基因的检测
[0116]设计能特异性检测EML4-ALK亚型2 (E20 ；A20)融合基因的探针及引物一对:
[0117]变体2-正向引物:5’ -AAGTATATAATGTCTAACTCGGGAGACTATGA-3’ (SEQ ID N0.4)；
[0118]变体2-反向引物:5’ -AGCAGTAGTTGGGGTTGTAGTCG-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0119]变体2-Taqman-探针:5，-FAM-TTGTACTTGTACCGCCGGAAGCACCA-TAMRA-3，(SEQ IDN0.6)；
[0120]然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测:反应体系为15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探针各 0.2μ I (20μ Μ)，样品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0121]Master Mix (购自美国应用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0122]PCR反应条件:95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，扩增反应65个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图3所示，为EML4-ALK亚型2 (E20 ；A20)融合基因阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例2中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出EML4-ALK亚型2 (E20 ；A20)融合基因，如图4所示,通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定EML4-ALK亚型
2(E20 ；A20)融合基因突变情况。
[0123]实施例3:EML4-ALK亚型3a (E6a ；A20)融合基因的检测
[0124]设计能特异性检测EML4-ALK亚型3a (E6a ；A20)融合基因的探针及引物一对:
[0125]变体3a-正向引物:5’ -ACCAAAACTGCAGACAAGCATAAAG-3’ (SEQ ID N0.7)；
[0126]变体3a-反向引物:5’ -AGCTTGCTCAGCTTGTACTCAGG-3’ (SEQ ID N0.8)；
[0127]变体3a-Taqman-探针:5 ’ -FAM-TGTCATCATCAACCAAGTGTACCGCCG-TAMRA-3 ’ (SEQID N0.9)；
[0128]然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测:反应体系为15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探针各 0.2μ I (20μ Μ)，样品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*Taqmanuniversal PCR [0129]Master Mix (购自美国应用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0130]PCR反应条件:95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，扩增反应65个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图5所示，为EML4-ALK亚型3a (E6a ;A20)融合基因阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例3中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出EML4-ALK亚型3a (E6a ;A20)融合基因，如图6所示,通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定EML4-ALK亚型3a (E6a;A20)融合基因突变情况。
[0131]实施例4:EML4-ALK亚型3b (E6b ；A20)融合基因的检测
[0132]设计能特异性检测EML4-ALK亚型3b (E6b ；A20)融合基因的探针及引物一对:
[0133]变体3b-正向引物:5’ -AACACCCAAATTAATACCAAAAGTTACC-3’ (SEQ ID N0.10)；
[0134]变体3b-反向引物:5’ -CAGCTCCTGGTGCTTCCG-3’ (SEQ ID N0.11)；
[0135]变体3b-Taqman-探针:5，-FAM-AATGTCAACTCGCGAAA-TAMRA-3’ (SEQ ID N0.12)；
[0136]然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测:反应体系为15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探针各 0.2μ I (20μ Μ)，样品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0137]Master Mix (购自美国应用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0138]PCR反应条件:95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，扩增反应65个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图7所示，为EML4-ALK亚型3b (E6b ;A20)融合基因阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例4中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出EML4-ALK亚型3b (E6b ;A20)融合基因，如图8所示,通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定EML4-ALK亚型3b (E6b ；A20)融合基因突变情况。
[0139]实施例5:EML4-ALK亚型4 (E14 ；A20)融合基因的检测
[0140]设计能特异性检测EML4-ALK亚型4 (E14 ；A20)融合基因的探针及引物一对:
[0141]变体4-正向引物:5’ -AGTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTCA-3’ (SEQ ID N0.13)；
[0142]变体4-反向引物:5’ -TTGTCAGATGAGAAATGGGATGTTA-3’ (SEQ ID N0.14)；
[0143]变体4-Taqman-探针:5，-FAM-AGCTTGTACTCAGGGCTCATCCAGCATATCTCTA-TAMRA-3 ’(SEQ ID N0.15)；
[0144]然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测:反应体系为15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探针各 0.2μ I (20μ Μ)，样品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0145]Master Mix (购自美国应用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0146]PCR反应条件:95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，扩增反应65个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图9所示，为EML4-ALK亚型4 (E14 ；A20)融合基因阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例5中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出EML4-ALK亚型4 (E14 ;A20)融合基因，如图10所示,通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定EML4-ALK亚型4 (E14 ；A20)融合基因突变情况。
[0147]实施例6:EML4-ALK亚型5a (E2a ；A20)融合基因的检测
[0148]设计能特异性检测EML4-ALK亚型5a (E2a ；A20)融合基因的探针及引物一对:
[0149]变体5a-正向引物:5’ -GTTTTGAGGCGTCTTGCAATCT-3’ (SEQ ID N0.16)；
[0150]变体5a-反向引物:5’ -GGTTGTAGTCGGTCATGATGGTC-3’ (SEQ ID N0.17)；
[0151]变体5a-Taqman-探针:5，-FAM-CTCAAGTAAAGTGTACCGCCGGAAGCA-TAMRA-3 ’ (SEQID N0.18)；
[0152]然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测:反应体系为15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探针各 0.2μ I (20μ Μ)，样品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0153]Master Mix (购自美国应用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0154]PCR反应条件:95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，扩增反应65个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图11所示，为EML4-ALK亚型5a (E2a ；A20)融合基因阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例6中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出EML4-ALK亚型5a (E2a ；A20)融合基因，如图12所示,通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定EML4-ALK亚型5a (E2a;A20)融合基因突变情况。
[0155]实施例7:EML4-ALK亚型5b (E2b ；A20)融合基因的检测[0156]设计能特异性检测EML4-ALK亚型5b (E2b ；A20)融合基因的探针及引物一对: [0157]变体5b-正向引物:5，-GTGCTTCCGGCGGTACACT-3’ (SEQ ID N0.19)；
[0158]变体5b-反向引物:5’ -TTGAGGCGTCTTGCAATCTCT-3’ (SEQ ID N0.20)；
[0159]变体5b-Taqman-探针:5，-FAM-CCTCCCCTGAGCTCTGAACCTTTACTTGA-TAMRA-3，(SEQID N0.21)；
[0160]然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测:反应体系为15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探针各 0.2μ I (20μ Μ)，样品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0161]Master Mix (购自美国应用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0162]PCR反应条件:95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，扩增反应65个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图13所示，为EML4-ALK亚型5b (E2b ；A20)融合基因阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例7中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出EML4-ALK亚型5b (E2b ；A20)融合基因，如图14所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定EML4-ALK亚型5b (E2b ；A20)融合基因突变情况。
[0163]实施例8:EML4-ALK亚型6 (E18 ；A20)融合基因的检测
[0164]设计能特异性检测EML4-ALK亚型6 (E18 ；A20)融合基因的探针及引物一对:
[0165]变体6-正向引物:5’ -GGGTGGTCAGCTGCAACAT-3’ (SEQ ID N0.22)；
[0166]变体6-反向引物:5’ -GAGACTCAGGTGGAGTCATGCTT-3’ (SEQ ID N0.23)；
[0167]变体6-Taqman-探针:5，-FAM-CCACTTCCTTTAGGTCCTTTCCCAGGTGT-TAMRA-3，(SEQID N0.24)；
[0168]然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测:反应体系为15 μ I,正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探针各 0.2μ I (20μ Μ)，样品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0169]Master Mix (购自美国应用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0170]PCR反应条件:95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，扩增反应65个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图15所示，为EML4-ALK亚型6 (E18 ;A20)融合基因阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例8中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出EML4-ALK亚型6 (E18 ;A20)融合基因，如图16所示,通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定EML4-ALK亚型6 (E18 ；A20)融合基因突变情况。
[0171]实施例9:EML4-ALK亚型7 (E14 ；A20)融合基因的检测
[0172]设计能特异性检测EML4-ALK亚型7 (E14 ；A20)融合基因的探针及引物一对:
[0173]变体7-正向引物:5’ -CAGTAGTTGGGGTTGTAGTCGGTC-3’ (SEQ ID N0.25)；
[0174]Variant7-反向引物:5’-TTGTCAGATGAGAAATGGGATGTTAT-3’ (SEQ ID N0.26)；[0175]变体7-Taqman-探针:5，-FAM-TGGCTTGCAGCTCCTGGTGCTCTATT-TAMRA-3 ’ (SEQ IDN0.27)；
[0176]然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测:反应体系为15 μ 1，正、反引物各0.15 μ I(20μ Μ)，探针各 0.2μ I (20μ Μ)，样品模板 DNA2.5μ I (100_300ng/μ I )，2*TaqmanuniversalPCR
[0177]Master Mix (购自美国应用生物公司)7.5 μ 1，ddH204.3 μ I。
[0178]PCR反应条件:95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，58°C 33秒，扩增反应65个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，如图17所示，为EML4-ALK亚型7 (E14 ;A20)融合基因阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；另外，将上述实施例9中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出EML4-ALK亚型7 (E14 ;A20)融合基因，如图18所示,通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定EML4-ALK亚型7 (E14 ；A20)融合基因突变情况。
[0179]实施例10:特异性检测实验
[0180]采用本试剂盒分别检测以下几种融合基因:RET_KIF5B融合基因、ROSl融合基因、EML4-ALK融合基因。
[0181]检测结果为:EML4_ALK融合基因对应检测孔有特异性荧光定量PCR扩增曲线，融合类型为亚型1，检测结果为阳性；其余两个均无特异性扩增曲线，检测结果为阴性(见图19)。
[0182]由上可知:FQ_PCR法不仅是快速、高效、灵敏的检测方法，而且其结果的判读非常明确、直观，结果亦是可靠、特异的。
【权利要求】
1.一种EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒，包括荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品，其特征在于: 所述荧光定量反应液包括:荧光定量反应液A、荧光定量反应液B、荧光定量反应液C、荧光定量反应液D、荧光定量反应液E、荧光定量反应液F、荧光定量反应液G、荧光定量反应液H、荧光定量反应液I ; 其中，所述荧光定量反应液A包括:检测EML4-ALK亚型I (E13 ；A20)融合基因的序列为SEQ ID N0.1的正向引物、序列为SEQ ID N0.2的反向引物和序列为SEQ ID N0.3的探针；所述荧光定量反应液B包括:检测EML4-ALK亚型2 (E20 ;A20)融合基因的序列为SEQID N0.4的正向引物、序列为SEQ ID N0.5的反向引物和序列为SEQ ID N0.6的探针；所述荧光定量反应液C包括:检测EML4-ALK亚型3a(E6a ;A20)融合基因的序列为SEQID N0.7的正向引物、序列为SEQ ID N0.8的反向引物和序列为SEQ ID N0.9的探针；所述荧光定量反应液D包括:检测EML4-ALK亚型3b(E6b ;A20)融合基因的序列为SEQID N0.10的正向引物、序列为SEQ ID N0.11的反向引物和序列为SEQ ID N0.12的探针；所述荧光定量反应液E包括:检测EML4-ALK亚型4 (E14 ;A20)融合基因的序列为SEQID N0.13的正向引物、序列为SEQ ID N0.14的反向引物和序列为SEQ ID N0.15的探针；所述荧光定量反应液F包括:检测EML4-ALK亚型5a(E2a ;A20)融合基因的序列为SEQID N0.16的正向引物、序列为SEQ ID N0.17的反向引物和序列为SEQ ID N0.18的探针；所述荧光定量反应液G包括:检测EML4-ALK亚型5b(E2b ;A20)融合基因的序列为SEQID N0.19的正向引物、序列为SEQ ID N0.20的反向引物和序列为SEQ ID N0.21的探针；所述荧光定量反应液H包括:检测EML4-ALK亚型6 (E18 ;A20)融合基因的序列为SEQID N0.22的正向引物、序列为SEQ ID N0.23的反向引物和序列为SEQ ID N0.24的探针；所述荧光定量反应液I包括:检测EML4-ALK亚型7 (E14 ;A20)融合基因的序列为SEQID N0.25的正向引物、序列为SEQ ID N0.26的反向引物和序列为SEQ ID N0.27的探针；所述阳性对照样品包括:阳性对照样品A、阳性对照样品B、阳性对照样品C、阳性对照样品D、阳性对照样品E、阳性对照样品F、阳性对照样品G、阳性对照样品H、阳性对照样品I ; 其中，所述阳性对照样品A包含所检测EML4-ALK亚型I (E13 ;A20)融合基因基因组片断DNA质粒； 所述阳性对照样品B包含所检测EML4-ALK亚型2(E20 ;A20)融合基因基因组片断DNA质粒; 所述阳性对照样品C包含所检测EML4-ALK亚型3a (E6a ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒； 所述阳性对照样品D包含所检测EML4-ALK亚型3b (E6b ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒； 所述阳性对照样品E包含所检测EML4-ALK亚型4(E14 ;A20)融合基因基因组片断DNA质粒; 所述阳性对照样品F包含所检测EML4-ALK亚型5a(E2a ；A20)融合基因基因组片断DNA质粒；所述阳性对照样品G包含所检测EML4-ALK亚型亚型5b (E2b ;A20)融合基因基因组片断DNA质粒； 所述阳性对照样品H包含所检测EML4-ALK亚型6(E18 ;A20)融合基因基因组片断DNA质粒; 所述阳性对照样品I包含所检测EML4-ALK亚型7(E14 ;A20)融合基因基因组片断DNA质粒。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述探针均为荧光探针，5 ^端标记FAM荧光报.告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
【文档编号】C12Q1/68GK103468813SQ201310426392
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】邵琦 申请人:广州达健生物科技有限公司