一种人白介素28b基因多态性荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用荧光PCR技术检测人白介素28B（IL28B）基因多态性的试剂盒。它在单个反应管中采用3条引物扩增rs12979860基因CC型和TT型序列，通过2条不同波长MGB荧光探针检测该基因的CC型和TT型。试剂盒操作简便、检测结果准确可靠，可应用于临床丙型肝炎患者IL28Brs12979860基因多态性检测，进而预测抗病毒药物治疗效果。
【专利说明】—种人白介素28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学分子生物学领域，具体涉及一种人白介素28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]人白介素28B基因(Interleukin 28B, IL28B)位于人第19号染色体短臂(19ql3)，编码干扰素λ 3 (INF-λ 3)参与人体抗病毒免疫反应，IL28B能刺激干扰素释放，增加细胞毒性T淋巴细胞数量，目前研究表明IL28B基因上游约3kb附近的单核苷酸多态性(SNP) rsl2979860与聚乙二醇干扰素、利巴韦林联合治疗丙型肝炎的效果显著(TanakaY, et al，Nat Genet，2009，41:1105-1109)，其中 rsl2979860 多态性 CC 型比 CT 杂合型、TT型丙型肝炎或者的病毒清除率高2~3倍、且CC型比非CC型丙型肝炎患者获得显著增高的持续病毒反应与治疗终末反应(J Hepatol, 2011, 55:692-701 ； Nature, 2009,461:798-801 ；Antivir Ther，2011，16:141-47)。因此，丙型肝炎患者在抗病毒治疗前，检测与确定IL28B rsl2979860基因多态性亚型，可以预测抗病毒药物疗效，有助于临床选择治疗方案，如选择抗病毒药物的种类和决定治疗持续的时间，同时还可用于肝移植前的供体筛查、复发性丙型肝炎患者的管理。
[0003]基因测序是检测IL28B rsl2979860基因多态性的金标准方法，但是具有操作技术要求高、检测灵敏度低、不能区分杂合型的缺点，近年来也有利用等位基因特异性PCR(AS-PCR)、实时荧光PCR技术、熔解曲线或高分辨率熔解曲线分析(HRM)方法检测IL28Brsl2979860 基因多态性的文献报道(J Molecular Diagnostics, 2011,13(4):446-51;J Clin Microbiol，2012:50:3353-55 ;中华检验医学杂志，2013，36 (I):59-62 和 36 (8):722-26)，其中AS-PCR需要用凝胶电泳观察条带大小判断结果，检测灵敏度低、操作不方便；文献报道的荧光PCR检测或者采用单波长分管检测不同rsl2979860基因亚型、操作复杂，或者使用单管检测但存在不同亚型交叉影响的问题，而HRM分析对仪器要求较高，多态性检测结果受仪器影响，这些检测方法存在的不足限制了 IL28B rsl2979860基因多态性检测在临床上的应用。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种单管检测人白介素28B基因(IL28B)多态性的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用3条引物扩增IL28B rsl2979860基因CC型和TT型序列，通过2条不同波长MGB荧光探针检测该基因的CC型和TT型；3条引物具有SEQ ID N0:1~3的序列，2条荧光探针具有SEQ ID NO:4和5的序列，SEQ ID NO:4序列探针5’端标记FAM荧光基团、SEQ ID N O:5序列探针5’端标记JOE或HEX或VIC荧光基团，探针3’端均标记MGB-NFQ基团；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。本发明通过双波长TaqMan MGB探针荧光PCR技术实现单管检测IL28B rsl2979860基因多态性，区分CC型、TT型以及杂合型，试剂盒使用简便、检测结果准确可靠，可应用于临床丙型肝炎患者IL28B rsl2979860基因多态性检测，进行抗病毒治疗效果预测。
[0005]技术方案
通过对GenBank中人IL28B rsl2979860基因序列查询，用Vector NT1、Oligo等软件对基因序列进行比对设计，按照TaqMan MGB荧光PCR设计的原则，优选了 2条上游引物和I条下游引物扩增rsl2979860基因CC型和TT型核苷酸序列中的66 bp片段、2条MGB探针分别检测该基因的CC型、TT型。上述引物探针设计具有如下特点:
具有SEQ ID NO:1和2序列的2条上游引物3’端末尾I~3个核苷酸位置设计了rsl2979860基因单核苷酸突变位点，分别配合共有下游引物扩增CC型和TT型序列；具有SEQ ID NO:4和5序列的2条MGB探针3’端I~5个核苷酸分别与上游引物SEQ ID NO:I和2的3’端序列互补重叠，对应检测CC型和TT型。
[0006]3条引物和2条MGB荧光探针核苷酸序列(5’ -> 3’)如下:
CC 型上游引物(CCpf):gAgCTCCCCgAAggCgCg，序列记为 SEQ ID NO:1。
[0007]TT 型上游引物(TTpf):gAgCTCCCCgAAggCgTg，序列记为 SEQ ID NO:2。
[0008]下游共有引物(pr):ggCgAggggCTTTgCTgg ,序列记为 SEQ ID NO:3。
[0009]CC型荧光探针(CCprobe)=CAATTCAACCCTggTTCgC，序列记为 SEQ ID N0:4，其中探针 5’端标记 FAM (6-carboxy-f Iuorescein)突光基团、3’端标记 MGB-NFQ (Minor groovebinder-nonfluorescent quencher)淬灭基团。
[0010]TT 型荧光探针(TTprobe):CAATTCAACCCTggTTCACg，序列记为 SEQ IDNO:5，其中探针 5’ 端标记 JOE (5-dichloro-dimethoxy-fIuorescein)或 HEX(5-hexachloro-fIuorescein)或 VIC 突光基团、3’ 端标记 MGB-NFQ 萍灭基团。
[0011]上述引物探针序列也可以是和SEQ ID NO:1~5序列同源性大于85%以上的序列。
[0012]所述荧光PCR反应体系各成分组成如下:Tris-HCl (pH8.3) 10 mM、KCl 50 mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0.2 mM、MgCl2 3 mM、3 条引物各 0.8 μ Μ、2 条 MGB 荧光探针各
0.2 μ M、Taq DNA聚合酶2 U、UNG酶0.5 U，提取的模板10 μ 1，总反应体积30 μ I。
[0013]所述荧光PCR 扩增程序如下:50°C 2min、95°C IOmin 后按照 95°C 10sec、62°C35sec循环扩增40次，循环步骤中62°C时采集FAM和JOE波长荧光信号。
[0014]所述人IL28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒质控品包括阴性对照、CC型阳性对照、TT型阳性对照各I个，其中阴性对照为去离子水，CC型、TT型阳性对照分别为人工构建含有IL28B rsl2979860基因CC型、TT型扩增片段的TA克隆质粒，浓度为IO5 copy/ml。
[0015]通过上述设计优选获得的3条扩增引物和2条荧光探针，本发明提供了实时荧光PCR检测的试剂盒，优化了 PCR反应体系和扩增程序。当然本研究领域技术人员根据荧光PCR的一般要求可以调整PCR反应体系和程序，也同样能实现检测的目的。
[0016]有益效果
本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成人IL28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒，其主要特点如下:
(1)通过型特异性的引物探针特殊重叠设计，提高了试剂盒检测的特异性。
[0017](2)通过反应体系和扩增程序优化，在两种基因型扩增效率和非特异扩增之间获得平衡，提高了试剂盒检测的准确性，避免因结果不准确造成误诊。[0018](3)试剂盒实现了单管检测IL28B rsl2979860基因多态性，使用简便快速，可在2小时内报告检测结果。
[0019](4)试剂盒扩增体系中的dUTP - UNG酶系统避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。
[0020]试剂盒的上述特点，均为采用特殊设计的IL28B rsl2979860基因多态性引物探针并与荧光PCR技术组合应用而直接引起，实现rsl2979860 CC型和TT型检测，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于临床丙型肝炎患者的IL28B rsl2979860基因多态性检测。
[0021]
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0023]实施例1:1L28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒引物探针的设计
根据NCBI GenBank数据库中查询的人IL28B rsl2979860基因序列，采用VectorNT1、Oligo等引物设计软件，优选获得的检测引物探针序列如表1所示，引物对扩增IL28Brsl2979860基因上66 bp片段。
[0024]表1设计的试剂盒EBV和内参照检测弓丨物探针
【权利要求】
1.一种单管检测人白介素28B基因(IL28B)多态性的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用3条引物和2条MGB荧光探针检测该基因rsl2979860的CC型和TT型，并且3条引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1~3，2条荧光探针核苷酸序列分别为SEQ ID NO:4和5，SEQ ID NO:4序列探针5’端标记FAM荧光基团、SEQ ID NO:5序列探针5’端标记JOE或HEX或VIC荧光基团，两条探针3’端均标记MGB-NFQ淬灭基团；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。
2.如权利要求1所述的试剂盒，使用的3条引物中有2条上游引物(SEQID N0:1和2)和I条下游引物(SEQ ID NO:3), IL28B rsl2979860基因单核苷酸突变位点设计在SEQID NO:1和2上游引物的3’端末尾I~3个核苷酸位置，辅以共有的下游引物分别扩增CC型和TT型。
3.如权利要求1所述的试剂盒，使用SEQID NO:4和5这2条MGB荧光探针序列的3’端I~5个核苷酸分别与上游引物SEQ ID NO:1和2的3’端序列互补重叠，对应检测CC型和TT型。
4.如权利要求1所述的试剂盒，所述荧光PCR反应液各成分终浓度为:Tris-HCl(pH8.3) 10 mM、KCl 50 mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0.2 mM、MgCl2 3 mM、3 条引物各 0.8y M、2条MGB荧光探针各0.2 ii M、Taq DNA聚合酶2 U、UNG酶0.5 U，提取的模板10 yl，总反应体积30ii I。
5.如权利要求1所述的试剂盒，所述荧光PCR扩增程序为:50°C2min、95°C IOmin后按照95°C IOsec、62°C 35sec循环扩增40次，循环步骤中62°C时采集FAM和JOE波长荧光信号。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其质控品包括阴性对照、CC型阳性对照、TT型阳性对照各I个。`
【文档编号】C12Q1/68GK103667514SQ201310751791
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】吴大治, 夏懿, 吴梅 申请人:上海星耀医学科技发展有限公司, 上海复星医药（集团）股份有限公司