用于苹果Actin基因实时荧光定量PCR检测的引物组和探针及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子检测领域，具体而言，设及用于苹果Actin基因实时巧光定量PCR 检测的引物组和探针及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，mRNA转录水平的定量分析作为了解基因功能的一个重要方面，已经成为 基因研究领域的热点。实时巧光定量RT-PCR巧ea^timeRT-PCR)是近年来发展起来的一 项新技术，不仅可对目的基因进行定性检测，还可对其表达量进行准确地定量，已被广泛应 用于基因研究领域中。
[0003] 但在实际研究中，对目的基因的定量分析多是在不同的组织中进行的，因此需要 尽量一致的实验条件，但由于样品在RNA的产量、质量W及逆转录效率上可能存在的差别， 因此，试验中的表达差异比较大。
[0004] 为了减少运种差异，通常会选择看家基因作为内参基因对目的基因的表达量进行 校正和标准化，因此，选择合适的内参基因成为试验结果准确的关键。持家基因是指所有细 胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，表达水平受环境 因素影响较小，而且是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，因此常 被作为内参基因使用。理想的内参基因应在各种类型的细胞、组织W及各种实验因素条件 下均能恒定表达。
[0005] 其中，0 -Actin是构成细胞骨架的主要成分一肌动蛋白的一种，研究结果表明，它 具有基因序列高度保守、mRNA表达数量高且稳定的特点，常作为内参基因被广泛使用。
[0006] 实时巧光定量RT-PCR技术（quantitativeReal-timeRT-PCR,qRT-PCR)是美国 AppliedBiosystems公司于1996年开发的一项新技术，通过实时监测体外DNA分子PCR复 制过程中每个循环扩增产物的巧光信号变化，实现对DNA模板的定量和定性分析，具有特 异性和灵敏度高、重复性好、无污染、耗时短的优点。
[0007] 按其巧光检出方式不同可分为巧光嵌合法和巧光探针法两大类。巧光嵌合法最常 使用的是SYBRGreenI，是一种能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波 长的染料。它与PCR合成的双链DNA结合，在激发光照射下产生巧光，通过巧光强度的检测， 可W实时检测PCR扩增的产物，所W对所有具有双链结构的DNA都能产生巧光，能对PCR产 物特异性检测。探针法常用的是化qManProbe,是一种根据目标片段的保守序列设计的特 殊标记序列，5'端带有巧光物质，3'带有泽灭物质，PCR扩增时化qDNA聚合酶的5' -3' 外切酶活性将结合在DNA模板上的探针裂解，巧光基团从探针上游离出来，与泽灭基团分 离，使巧光基团发出巧光。因为化qManProbe对检测目标具有较高的特异性，该方法已被 应用于病原体的多重实时巧光定量PCR检测研究中。
[0008] 目前检测Actin基因的方法多采SYBRGreenr法，技术方案为：
[0009] (1)设计实时巧光定量RT-PCR检测引物
[0010] (2)提取果树供试样品的RNA并反转录成cDNA
[0011] (3)WCDNA为模版，利用设计的特异扩增引物进行实时巧光定量PCR检测
[0012] Actin基因的SYBRGreenI实时巧光定量检测方法的缺点：
[0013] (1)检测的专一性（特异性）差，非特异扩增也会产生巧光信号；
[0014] (2)对设计的引物要求高，要求设计的引物不能产生特异扩增和引物二聚体；
[0015] (3)只能用于单重检测，不能用于同一次反应中多个目标的多重检测。
[0016] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0017] 本发明的第一目的在于提供用于苹果Actin基因实时巧光定量PCR检测 的引物组和探针，所述的引物组和探针特异性强，重复性好，灵敏度高，检测下限为 1. 48XIQicopies.y1 1，其灵敏度是常规RT-PCR技术的1000倍。
[0018] 本发明的第二目的在于提供一种苹果Actin基因的实时巧光定量PCR检测方法， 该方法通过将待检测样本与标准曲线比对，得到Actin基因的绝对定量，从而为检测其他 功能性基因的相对定量W及绝对定量提供可靠的基础。
[0019] 为了实现本发明的上述目的，特采用W下技术方案：
[0020] 一种用于苹果Actin基因实时巧光定量PCR检测的引物组和探针，由具有SEQID No. 1所示碱基序列的上游引物Act-Probe-F、具有SEQIDNo. 2所示碱基序列的下游引物 Act-Probe-R和具有沈QIDNo. 3所示碱基序列的探针Act-Probe组成。
[0021] 本发明提供的用于苹果Actin基因实时巧光定量PCR检测的引物组和探针，特异 性强，重复性好，灵敏度高，检测下限为1. 48XIQicopies?y1 1，其灵敏度是常规RT-PCR技 术的1000倍。
[0022] 优选地，所述探针为化qMan探针。 阳02引常见的巧光基团：FAM、肥X;常见的泽灭基团：TAMRA，B册1。经验证，选用FAM和B册1效果更佳。更优选地，所述探针5'端标记巧光基团FAM，3'端标记泽灭基团B册1。 [0024] 与SYBRGreenI实时巧光定量检测方法相比，本发明使用化qMan探针，检测特异 性高，只有特异扩增产物才会产生巧光信号，非特异扩增和引物二聚体不会产生巧光信号； 可对同一次反应中的多个目标进行多重检测。
[00巧]本发明还提供了一种苹果Actin基因的实时巧光定量PCR检测方法，包括W下步 骤：
[0026] W上述的Act-Probe-F和Act-Probe-R作为引物，并WAct-Probe作为探针对待 检测样本进行实时巧光定量PCR检测。
[0027] 本发明提供的苹果Actin基因的实时巧光定量RT-PCR检测方法，特异性强、重复 性好、灵敏度高，检测下限为1.48Xl〇icopies?iil1，其灵敏度是常规RT-PCR技术的1000 倍。为采用实时巧光定量PCR方法对苹果功能基因及病原基因的表达进行定量分析奠定基 础。
[0028] 进一步地，所述实时巧光定量PCR检测结果通过与由标准品的不同拷贝数的对数 值与Ct值组成的标准曲线进行对比得知；
[0029] 所述实时巧光定量PCR检测采用的待检测样本为苹果组织总RNA反转录得到的 cDNA；
[0030] 所述cDNA与由所述标准品反转录得到的cDNAW相同的反应体系和PCR程序进行 实时巧光定量PCR，得到的Ct值与所述标准曲线比对即可得到待检测样本中Actin基因的 表达量。
[0031] 预先制得由标准品制得的标准曲线，将待检测样本W同样的条件进行实时巧光定 量PCR，得到的Ct值与标准曲线比对即可得到待检测样本中Actin基因的表达量，增加了测 定Actin基因的表达量的准确度，防止了其他因素对表达量的影响，更好的定量Actin基因 的表达量。
[0032] 进一步地，所述标准品通过W下方法制备： 阳03引（a)、提取苹果组织的总RNA，总RNA经反转录获得CDNA ;
[0034] 化）、W引物Act-sta-Fl和Act-sta-Rl对cDNA进行PCR扩增，扩增后对目柄;片 段回收，其中，Act-Sta-Fl碱基序列如SEQ ID No. 4所示，Act-Sta-Rl碱基序列如SEQ ID No. 5所示；
[0035] (C)、回收目标片段，连接至载体上，进行质粒扩增，扩增后提取质粒，进行线性 化；
[0036] (d)、将线性化的含有目标片段的质粒体外转录成单链RNA，得到CRNA即为所述标 准品。
[0037] 其中，苹果组织可W为苹果的叶，也可W为苹果的果实，也可W为苹果的根皮，也 可W为苹果的种皮，等等，只要是苹果上的组织即可。 阳03引经在Genbank网站，查找已公布的苹果Actin基因序列（AB6368619. 1)，利用 Primer primer 5.0设计，经多次验证，得到特异性好，灵敏度高的扩增Actin基因全长序 列的引物Act-Sta-Fl和Act-sta-Rl，用于标准品的制作。引物Act-Sta-Fl和Act-Sta-Rl 扩增的目标片段为l〇48bp。
[0039] 此外，根据扩增的Actin基因的测序结果，利用软件ClustalX(1.81)将其与其 它植物的Actin基因序列进行比对，找到相对保守的序列作为检测标祀区域，利用Primer Expressv3. 0和PrimerPrimer5. 0软件设计！"SqMan探针Act-Probe和特异性扩增引物 Act-Probe-F和Act-Probe-R。 W40]在标准品的制备中，通过使用引物Act-Sta-Fl和Act-Sta-Rl对苹果组织 的RNA逆转录得到的CDNA进行特异性PCR扩增，得到特异性的苹果Actin基因片段； 再WAct-Probe-F和Act-Probe-R作为引物，并WAct-Probe作为探针对待检测样本 进行实时巧光定量PCR检测，特异性强，重复性好，灵敏度增高，标准品的检测下限为 1. 48 X IQicopies.y 1 1，其灵敏度是常规R