程序为：94°C预变性30s;94°C变性5s，55°C退火15s，72°C延伸15s，共40个 循环。 阳163] 反应结束后自动生成标准曲线，如图6所示。
[0164]如图6所示，标准品CRNA拷贝数浓度的对数值与Ct值之间呈现出良好的线性 关系，线性方程为：y= -3. 1751og(x)+39. 86,决定系数（R2)为0. 999,扩增效率似为 106. 5%。 阳1化]实施例3 阳166] 1、实时巧光定量PCR与常规PCR灵敏度的对比 阳167] 将标准品CRNA W 10倍倍比稀释后，分别进行实时巧光定量RT-PCR检测和常规 RT-PCR检测，结果如图7和图8所示。图7和图8中，1~8: W 10倍倍比稀释的浓度依 次为1.48Xl〇s……1.48Xl〇icopies-yli的cRNA;9:阴性对照。图7显示，实时巧光定 量RT-PCR能够检测到1. 48X IQicopies?y 11的cRNA，图8显示常规RT-PCR只能检测到 1. 31 X IO4Copies?y 1 1的cRNA，表明实时巧光定量RT-PCR比常规RT-PCR的灵敏度高1000 倍。
[0168] 2、实时巧光定量PCR的重复性
[0169] 利用DPS软件对不同浓度CRNA在同一次试验和不同试验间得到的Ct值进行统计 学分析（表2)。
[0170]表2实时巧光定量RT-PCR的重复性试验结果阳171]
阳172]表2中，组内重复的最大变异系数为0. 86%，表明该方法具有较好的组内重复性； 组间重复的最大变异系数为2. 65%，表明该方法具有较好的组间重复性。说明该方法获得 的数据比较稳定。 阳17引 3、实时巧光定量PCR的特异性
[0174]利用建立的实时巧光定量PCR方法对Actin-T3、ASPV-cp、ASGV-cp、A化SV-CP 四种阳性重组质粒进行检测，W双蒸水为空白对照。结果如图9所示，其中，l:Actin-T3; 2:ASPV-cp ;3:ASGV-cp ;4:ACLSV-cp ;5:(1地2〇。从图9可W看出，除Actin-T3反应管中检测 到了呈明显上升趋势的巧光信号外，其余各处理的检测结果均显示为阴性，表明该方法中 的引物和探针具有较高的特异性，能够特异地检测到Actin。
[01巧]其中，本发明实施例中的苹果组织可W为苹果的叶，也可W为苹果的果实，也可W为苹果的根皮，也可W为苹果的种皮，等等，只要是苹果上的组织即可。
[0176] 另外，本发明还将上述中的PCR反应体系微调其中的成分进行实时巧光定量PCR， 如TransStartProbeqPCRSuperMix10Jil，Act-Probe-F4pmol、Act-Probe-R4pmol， Act-Probe4pmol，模板，双蒸水补齐至20yI;
[0177]TransStartProbeqPCRSuperMix10yI,Act-Probe-FSpmoUAct-Probe-R 5pmol，Act-Probe5pmol，模板，双蒸水补齐至 20yI;
[0178]用该PCR反应体系进行了标准曲线的制作，W及待检测样品的检测，结果与上述 实施例一致。 阳179] 本发明还将上述中的PCR扩增程序微调后进行实时巧光定量PCR，如：94°C预变性 30s;94°C变性7s，55°C退火10s，72°C延伸15s，共40个循环；
[0180]或94°C预变性35s;94°C变性5s，55°C退火15s，72°C延伸20s，共35个循环； 阳181]用该PCR扩增程序进行了标准曲线的制作，W及待检测样品的检测，结果与上述 实施例一致。
[0182] 本发明制得的标准曲线，可用于多种苹果组织中的Actin基因的定量，如取苹果 果肉，先按照上述实施例制成标准品，然后制成标准曲线；待检测样本可W为苹果的叶，也 可W为苹果的果实，也可W为苹果的根皮，也可W为苹果的种皮，等等。各待检测样本提取 RNA，反转录得到cDNA，将该CDNA与标准品CRNA反转录得到的CDNA同样的实时巧光定量 反应体系和PCR程序进行试验，得到的Ct值与所述标准曲线比对即可得到待检测样本中 Actin基因的表达量。
[0183] 本发明对50个不同苹果组织提取RNA，逆转录得到cDNA，经实时巧光定量PCR检 ，得到50个不同苹果组织中的Actin基因的表达量。 阳184]另外，本发明对Actin基因的定量，为后续Actin基因作为内参基因来相对定量功 能性基因或绝对定量功能性基因的表达量意义重大。
[0185]尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可W作出许多其它的更改和修改。因此，运意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有运些变化和修改。
【主权项】
1. 一种用于苹果Actin基因实时荧光定量PCR检测的引物组和探针，其特征在于，由具 有SEQ ID No. 1所示碱基序列的上游引物Act-Probe-F、具有SEQ ID No. 2所示碱基序列的 下游引物Act-Probe-R和具有SEQ ID No. 3所示碱基序列的探针Act-Probe组成。2. 根据权利要求1所述的引物组和探针，其特征在于，所述探针为TaqMan探针； 优选地，所述探针5'端标记荧光基团FAM，3'端标记淬灭基团BHQl。3. -种苹果Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 以权利要求1或2中所述的Act-Probe-F和Act-Probe-R作为引物，并以Act-Probe 作为探针对待检测样本进行实时荧光定量PCR检测。4. 根据权利要求3所述的苹果Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于， 所述实时荧光定量PCR检测结果通过与由标准品的不同拷贝数的对数值与Ct值组成的标 准曲线进行对比得知； 所述实时荧光定量PCR检测采用的待检测样本为苹果组织总RNA反转录得到的cDNA ; 所述cDNA与由所述标准品反转录得到的cDNA以相同的反应体系和PCR程序进行实时 荧光定量PCR，得到的Ct值与所述标准曲线比对即可得到待检测样本中Actin基因的表达 量。5. 根据权利要求4所述的苹果Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于， 所述标准品通过以下方法制备： (a)、提取苹果组织的总RNA，总RNA经反转录获得cDNA; (b) 、以引物Act-sta-Fl和Act-sta-Rl对cDNA进行PCR扩增，扩增后对目标片段回收， 其中，Act-sta-Fl碱基序列如SEQ ID No. 4所示，Act-sta-Rl碱基序列如SEQ ID No. 5所 示； (c) 、回收目标片段，连接至载体上，进行质粒扩增，扩增后提取质粒，进行线性化； (d) 、将线性化的含有目标片段的质粒体外转录成单链RNA，得到cRNA即为所述标准 品。6. 根据权利要求5所述的苹果Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于， 所述载体为PEASY-T3载体，所述线性化采用Pst I内切酶进行酶切。7. 根据权利要求5所述的苹果Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于， 所述质粒扩增具体为： 将回收的目标片段连接至载体，转化至E. coli DH5 a感受态细胞，挑取阳性克隆进行 增菌培养。8. 根据权利要求5所述的苹果Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于， 所述标准品的0D26Q/0D 2S。比值在L 8-2. 0之间。9. 根据权利要求5所述的苹果Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于， 所述标准品的不同拷贝数的数量级为：10 1拷贝-10 8拷贝，优选以10倍进行等分。10. 根据权利要求3所述的苹果Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在 于，所述实时焚光定量PCR检测采用的PCR反应体系为：TransStart Probe qPCR Super Mix IOul，Act-Probe-F 4_5pmol、Act-Probe-R 4_5pmol，Act-Probe 4_5pmol，待检测样 本I y 1-2 y I，双蒸水补齐至20 y I ; 优选地，实时荧光定量PCR扩增程序为：94°C预变性30-35s ;94°C变性5-7s，55°C退火
【专利摘要】本发明涉及分子检测领域，特别涉及苹果Actin基因的实时荧光定量PCR检测用引物组和探针及其检测方法。本发明提供的一种苹果Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：以Act-Probe-F和Act-Probe-R作为引物，并以Act-Probe作为探针对待检测样本进行实时荧光定量PCR检测。本发明提供的苹果Actin基因的实时荧光定量RT-PCR检测方法，特异性强、重复性好、灵敏度高，检测下限为1.48×101copies·μl-1，其灵敏度是常规RT-PCR技术的1000倍。为采用实时荧光定量PCR方法对苹果功能基因及病原基因的表达进行定量分析奠定基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105154573
【申请号】CN201510687825
【发明人】秦子禹, 王娜, 项殿芳
【申请人】河北科技师范学院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月21日