一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物及鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子遗传学领域，具体而言，设及一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物 及鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 雌雄鉴别是现代养鸡生产中的重要技术，由于鸡为ZW型性别决定，快慢羽基因位 点位于Z染色体上，慢羽是显性基因，因而目前很多种鸡场通过筛选培育纯慢羽系和纯快 羽系种群，通过慢羽母鸡与快羽公鸡杂交的商品代维鸡快慢羽自别雌雄，快羽维鸡为母鸡， 而公鸡为慢羽。快慢羽的区分主要是由初生维鸡翅膀上的主翼羽和覆主翼羽的长短来确 定。
[0003]快慢羽自别雌雄的鉴定方法最主要的问题是在能进行准确鉴定的时间上有一定 的限制，一般进行羽速鉴定只有在维鸡出维后24h内才可W进行。此外，要实现羽速自别雌 雄，需要构建相应的配套系，通过羽速表型构建配套系至少需要经过2~3个世代才能实 现，并且建系时需从维鸡开始。最后，快慢羽的鉴别方法本身也是不够明确的，当前普遍认 为维鸡出生时，主翼羽长于覆主翼羽2mmW上的为快羽，主翼羽比覆主翼羽长2mmW下、等 长或略短的为慢羽，但有时候2mm的差别是不容易辨别的。由于存在W上不足，使快慢羽区 分性别技术的推广与应用受到限制，因此很多企业目前仍采用翻肛等其他传统方法雌雄鉴 别。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的在于提供一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物，该引物特异性 好，扩增效率高，可用于鸡快慢羽表型的分子鉴定。
[0005]本发明的第二目的在于提供一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，该方法可W解决 快慢羽鉴定中存在的鉴定标准不够明确、雌雄配套系建系时间长、鉴定时间有限制的问题。
[0006]-种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物，其碱基序列分别为SEQIDNO: 1和SEQID NO: 2所示。
[0007]通常说来，每增加一个核巧酸引物特异性提高4倍，运样，大多数应用的最短引物 长度为18个核巧酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。
[0008]-般引物长度为18~30碱基，本发明所述引物长度为18个碱基。由于赌的原因， 较短的引物退火结合到祀DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越大，因而 本发明所述的引物具有很高的扩增效率。
[0009]一般引物序列中G+C含量一般为40 %~60 %，一对引物的GC含量和Tm值应该协 调。本发明所述引物沈QIDN0:1中G+C含量为50%，SEQIDN0:2中G+C含量为55. 6%， 且碱基分布随机，因而具有适中的解链溫度，便于扩增。
[0010] 所述引物自身不存在互补序列（连续互补碱基小于3bp);引物3'端无修饰不易 错配；最终扩增产物长度为1305bp，容易成功扩增出目的片段。
[0011] 综上，该引物特异性好，扩增效率高，可很好的用于鸡快慢羽表型的分子鉴定。
[0012] 一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，包括W下步骤：
[0013]1)、模板DNA的提取：从鸡血凝块或抗凝鸡血中提取总DNA;
[0014]2)、用SEQIDNO: 1和SEQIDN0:2所示引物，W1)所提取的总DNA为模板进行 PCR扩增；
[001引 3)、将2)中PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳；
[0016] 4)、对3)中的电泳结果进行分析。
[0017] 优选的，如上所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，在步骤1)中，所述模板DNA从 鸡血凝块或鸡抗凝血中提取。
[0018]用血凝块法提取DNA模板的优点是鸡血处理和保存条件较为简单，不需要额外的 抗凝处理，且可保存较长时间。该方法操作较为简便，无需特殊设备，适合一般实验室开展。
[0019] 抗凝全血在2~8度可保存达两个月，但随保存时间的增加，DNA的得率和完整性 会受影响。抗凝血的DNA更易抽提，且更稳定，DNA含量高。
[0020] 应当注意的是，依据现有技术或其他可能的技术从鸡血中提取DNA并制备扩增模 板，也可W用于本发明。
[0021] 优选的，所述PCR扩增反应体系为：
[0022] SEQ TDNO: 1 0.5^1 SEQ IDNO: 2 0.5叫 2xEsmix 5|a! DNA WM 0部I ddHjO 3Sjil。
[002引其中，上述引物的浓度均为8~12yM;
[0024] 上述从鸡血凝块或抗凝鸡血中提取的DNA的浓度一般可达到200~30化g/ul，而 其在PCR扩增体系中的浓度达到2. 5ng/ulW上即可。
[00巧]本发明设及同一体系或配比中各组分的量，应视为对相关各组分之间比例关系的 限定，而不是对各自用量绝对值的限定，各组分之间的比例关系可适当改变。
[0026] 2XEsmix是2倍浓缩的PCR扩增预混和溶液，含有化qDNA聚合酶、Mg2\dNTPs 和缓冲液。
[0027]TaqDNA聚合酶具有良好的热稳定性，可在PCR循环的高溫条件下仍能保持较高 的催化活性；Mg2+是化qDNA聚合酶的辅酶，其浓度直接影响着酶的活性与特异性；dNTPs是 DNA扩增的原料；缓冲液可为化qDNA聚合酶的扩增提供合适的催化条件。
[0028] 优选的，如上所述的PCR扩增反应体系的相应反应程序中，退火溫度为60°C，反应 循环次数为23~35个循环。
[0029] 通常PCR扩增时的退火溫度为40°C~60°C。退火溫度是由引物的Tm值来决定的， 在Tm值允许范围内，选择较高的退火溫度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性。本发明所采用的引物退火溫度为6(TC，具有较高的特异性。
[0030] 随着反应的进行，酶会逐渐失活、dNTPs等原料会逐渐消耗掉，此外有一些非特异 产物的扩增也会相应增加。因此虽然随着反应循环数的增加，产物会增多，但循环次数依然 不宜过多，因而本发明限定为23~35个循环。
[0031] 优选的，所述琼脂糖凝胶电泳所采用的琼脂糖采用1~1. 2%的琼脂糖凝胶；电泳 的电压为130~150V恒压，电泳时间为20~25分钟。
[0032] 优选的，所述对结果的判断方法为，扩增出1305bp目的条带的模板对应的为慢羽 鸡；未扩增出该片段的模板对应的为快羽鸡。
[0033] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0034] 1)、本发明所用引物特异性好，扩增效率高，且所需模板量较少即可完成PCR反 应，可很好的用于鸡快慢羽表型的分子鉴定。
[0035]2)、很多分子鉴定实验都需要两对或多对引物来扩增出多条扩增产物，有的方法 还需要酶切反应来进行辅助鉴定，运些操作无疑增加了鉴定的时间成本和金钱成本；并且 多对引物还容易造成引物之间的交叉污染，不同引物还可能会发生非特异性结合；同时不 同引物间的Tm值也可能存在差异，还会对退火溫度的选定造成影响，进而影响扩增效率。 本发明采用一对引物即可鉴定出鸡的羽速类型，避免了W上问题。
[0036]3)、本发明鉴定准确率可达100%，而传统的比较主翼羽与覆主翼羽长度的方法准 确率只有90%左右，本发明有效避免了表型鉴定时存在的人为误差。
[0037]4)、本发明解决了对鸡进行羽速鉴定只有在维鸡出维后24h内完成的时间限制。
【附图说明】
[0038] 图1为实施3中琼脂糖凝胶电泳结果的扫描图。
【具体实施方式】
[0039] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可W通过市售购买获得的常规产品。
[0040] 实施例1
[0041] 一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，包括W下步骤：
[0042] 1)、模板DNA的提取：通常从鸡血中提取，当然也可W从其他组织提取；
[0043]2)、用沈QIDNO: 1和沈QIDN0:2所示引物，W1)所提取的DNA为模板进行PCR 扩增；
[0044] 3)、将2)中PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳；
[0045] 4)、对3)中的电泳结果进行分析。
[004引实施例2
[0047] 1、引物制备
[0048] 由生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成，其中：
[0049]正向引物 1305s:5,CCTCCTTGCCAAACCTTA3,；
[0050]反向引物 1305a:5'ATCAGCCAGATCCGTCAG3'。
[0051] 2、试剂盒提取鸡血凝块DNA步骤：
[0052] 选用康为世纪生物科技有限公司的ClotBloodDNAKit进行提取，产品货号 CW0545。
[005引（1)称取凝固血块0.1~0. 2g，置于离屯、管中，并加入550y1Buffer GTL，电动匀 浆器匀浆，为充分粉碎血块，可加入小磁珠，进行机械破碎。
[0054] (2)加入20yl蛋白酶K，上下颠倒使样品充分混匀。在摇床里56°C过夜解育至所 有颗粒完全溶解。
[00巧](3)加入200y1 Buffe巧P，满旋震荡20s，冰上解育3~5min。l：M00Xg离屯、3min，将上清移至新的离屯、管中（若上清中还有浑浊，可适当增加离屯、时间）。
[0056] (4)加入1/2体积无水乙醇，满旋震荡15s。短暂离屯、，使管壁和盖子上液体集中 到管底。
[0057] (5)将步骤4中所得溶液全部加入到装入收集管（CollectionTube)中的吸附柱 (SpinColumnDM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。13400Xg离屯、Imin,倒掉收集 管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[005引（6)向吸附柱中加入500y1BufferGWl，13400Xg离屯、Imin,倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中。
[005引（7)向吸附柱中加入500ulBufferGW2,13400Xg离屯、Imin,倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0060]做13400Xg离屯、2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室溫数分钟W彻底 惊干。
[006。（9)将吸附柱置于一新离屯、管中，向吸附柱中间部位悬空加入100~200iil BufferGE,室溫放置 2 ~5min，13400Xg离屯、Imin，收集DNA溶液，-20°C保存DM。
[0062] 本方法是经多次实验后优选出来的，0. 1~0. 2g的血凝块较为节约材料，且提取 DNA的含量较高。
[006引蛋白酶K可W使膜蛋白降解，使与DNA结合的蛋白质降解，从而使DNA充分游离。 通常加入较多的Proteinase时抽提出的DNA含量较高，为了保证消化效果，步骤（2)常采 用过夜解育。
[0064] 加入BufferGE时应注意悬空加入，防止移液枪被DNA污染。