>[0065] 此方法所提太行鸡血凝块DNA浓度大都在200~30化g/y1左右，纯度A260/280 在1. 8~1. 9之间，A260/230在1. 6~1. 9之间。
[0066] 依据现有技术或其他可能的技术从鸡其他部位提取DNA并制备扩增模板，也可W 用于本发明。
[0067] 3、PCR扩增
[0068] 3.UPCR反应体系
[0069] 亚尚I!物I訊5s 化5神 发询引物13U5aO5f.ll 2XEsmix ..如I DNA模板 化5叫1 ddH2〇 3.Sjil
[0070] 其中，2XEsmix的生产厂家为康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0690,规格 为Iml;
[0071] 引物浓度为8~12yM;
[0072] 上述DNA模板在PCR扩增体系中的浓度达到2. 5ng/ul W上即可。
[0073] 3. 2、扩增反应程序
[0074] ① 9'rc 5mm @951： 3 舱 ③6(rc 地 ?72VlminSOs ⑤goto③③④for巧-35个循环 ⑥ 巧13 IOmin ③4°C保存
[00巧]4、琼脂糖凝胶电泳检测
[007引采用1 %~1. 2%的琼脂糖凝胶进行检测，电压采用130~150V均可，电泳时间 20~25分钟。
[0077] 5、结果分析与判定
[0078] 扩增出1305bp目的条带的模板对应的为慢羽鸡；未扩增出该片段的模板对应的 为快羽鸡。
[007引实施例3
[0080] 1、引物设计和制备
[0081]Elferink等（2008)发现控制羽速的慢羽K等位基因是由串联重复序列构成，其总 长度为176324bp，由两个基因部分重复所引起：P化R基因和编码精子鞭毛蛋白的S阳F2基 因，包含了P化R基因的外显子1-外显子11和558bp的外显子12W及SPEF2基因的外显 子1-外显子5;并设计引物，在慢羽鸡中扩增出一段长78bp的断点连接序列，而快羽鸡扩 增不出该段序列，因此可作为区分快慢羽的一种分子检测方法。在该研究成果基础上，设计 引物扩增出一段包含78bp的长度为1305bp的断点连接序列，只有慢羽鸡能扩增出来，快羽 鸡扩增不出该段序列，由此可区分鸡的快慢羽型。该片段容易扩增，特异性强，PCR产物可 直接测序。
[0082] 利用上述连接重复片段的断点连接序列设计引物，并由生工生物工程（上海）股 份有限公司进行引物合成，其中：
[0083]正向引物 1305s:5,CCTCCTTGCCAAACCTTA3,；
[0084]反向引物 1305a:5'ATCAGCCAGATCCGTCAG3'。
[0085]2、试剂盒提取抗凝鸡血DNA步骤：
[0086] 选用北京全式金生物技术有限公司生产的Easy化reBloodGenomicDNAKit进 行提取，货号为邸121-12。
[0087] (1)取20~25y1抗凝鸡血于1. 5ml离屯、管中，并加入500y1BB3溶液，20mg/ y1蛋白酶K20y1，满旋15s充分混匀样品，56°C7jC浴2~3h。
[008引似短暂离心将全部的溶液加入离屯、柱中，12000Xg离屯、Imin,弃上清液。
[0089] (3)加入 500y1 溶液CB3,12000Xg离屯、30s，弃上清液。
[0090] (4)加入SOOiil溶液WB3,12000Xg离屯、30s，弃上清液。
[0091] (5)重复步骤4 一次。
[0092] 化）12000Xg离屯、2min，彻底去除残留的WB3。
[0093] (7)将离屯、柱置于一干净的离屯、管中，在柱的中央加入预热的50~200ul EB(65°C)，室溫静置2~5min，12000Xg离屯、Imin，洗脱DNA，4°C保存（长时间存放-20°C 保存）。
[0094] 鸡血通常用邸TA或ACD作抗凝处理，抗凝全血在2~8度可保存达两个月，但随 保存时间的增加，DNA的得率和完整性会受影响。抗凝血的DNA更易抽提，且更稳定，DNA含 量高。
[0095] 注意红细胞裂解后，一定要将红细胞碎片尽量去除，红细胞碎片残留太多会影响 后期的PCR等操作；蛋白酶K通常现用现配。
[0096] 依据现有技术或其他可能的技术从鸡血中提取DNA并制备扩增模板，也可W用于 本发明。
[0097] 3、PCR扩增
[0098] 3.UPCR反应体系
[0099] .正向引物 1305s 0.5'Lll 反向引物1305a 0.5川 2 XEsmi义 5[_il DNA模板 0.5111 ddH20 3.5林
[0100] 其中，2XEsmix的生产厂家为康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0690,规格 为Iml;
[0101] 引物浓度为8~12yM;
[0102] 上述DNA模板在PCR扩增体系中的浓度达到2. 5ng/ulW上即可。
[0103] 3. 2、扩增反应程序
[0104] (1)95 °C 5min ② 95°C 30s
[0105] ③ 60'，C 30s ④ 72VIminWs ⑤go化③③④for巧-35个循环 ⑥ 72VIOmin ⑦ 4°C俸揉
[0106] 4、琼脂糖凝胶电泳检测
[0107] 采用1 %~1. 2%的琼脂糖凝胶进行检测，电压130~150V，电泳时间20~25分 钟。
[010引5、结果分析与判定
[0109] 电泳结果参见图1所示，其中扩增出1305bp目的条带的模板对应的为慢羽鸡；未 扩增出该片段的模板对应的为快羽鸡。
[0110] 实验例1太行鸡羽速类型鉴定准确性检验（与传统方法比较）
[0111] 赞皇县天然农产品开发有限公司取亲本羽速基因型已确定的120只太行鸡（即运 些太行鸡羽速类型已知），其中快羽公鸡、慢羽公鸡、快羽母鸡和慢羽母鸡各30只，采用单 盲实验，实验者A将120只鸡随机混合，实验者B再分别用实施例3中的方法与表型鉴定 (表型鉴定为传统的比较主翼羽与覆主翼羽长度的方法）方法进行鸡快慢羽的检测，再由 实验者A根据实验值与真值的差异统计准确率。结果如下：
[0112]
[0113] 实验例2巧上长尾鸡羽速类型鉴定准确性检验
[0114] 张家口京星园生态农业公司取288份已知快慢羽表型的巧上长尾鸡的血样，用扩 增1305bp的引物对血样进行血液直接PCR，由此检测鸡的快慢羽类型，所得快慢羽的比例 与预期结果相符，该方法更快速，不用提取基因组，直接用血样（Iul稀释后的鸡血）做模 板，直接进行PCR扩增即可。随后又取得206份巧上长尾鸡慢羽公鸡的血样用实施例3中 的方法进行验证，所得结果与表型鉴定结果一致率达到95. 63%，由此检验该鉴定方法的可 靠性。
[0115] 实验例3海兰灰慢羽公鸡羽速类型鉴定准确性检验
[0116] 河北保定满城解化场取已知羽型的海兰灰慢羽公鸡30只，用实施例3中的方法进 行验证，检测结果准确率达100 %。
[0117] 实验例4海兰灰祖代四系羽速类型鉴定准确性检验
[011引河北华裕家禽育种有限公司取90份已知羽型的海兰灰祖代四系的血样，A、B和C系各30只，其中，A系为快羽公鸡，B系为快羽母鸡，C系为纯合慢羽公鸡，用实施例3中的 方法进行验证，检测结果与实际完全吻合，由此检验该鉴定方法的准确性。
[0119] 综上所述，本发明提供了一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物，该引物特异性好，扩 增效率高，可用于鸡快慢羽表型的分子鉴定。本发明还提供了一种鸡快慢羽表型的分子鉴 定方法，该方法可W解决快慢羽鉴定中存在的鉴定标准不够明确、雌雄配套系建系时间长、 鉴定时间有限制的问题。
[0120] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可W作出许多其它的更改和修改。因此，运意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有运些变化和修改。
【主权项】
1. 一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2 所示。2. -种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 、模板DNA的提取； 2) 、用SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示引物，以1)所提取的DNA为模板进行PCR扩 增； 3) 、将2)中PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳； 4) 、对3)中的电泳结果进行分析。3. 如权利要求2所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，在步骤1)中，所述 模板DNA从鸡血凝块或鸡抗凝血中提取。4. 如权利要求2所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，在步骤2)中，所述 PCR扩增反应体系为：5. 如权利要求4所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，所述正向引物和 反向引物的浓度为8~12 μ M。6. 如权利要求4所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，所述DNA模板在 PCR反应体系中的浓度为2. 5ng/ μ 1以上。7. 如权利要求4所述的鸡快慢羽表型的鉴别方法，其特征在于，所述2 X Es mix是2倍 浓缩的PCR扩增预混和溶液，含有Taq DNA聚合酶、Mg' dNTPs和缓冲液。8. 如权利要求4~7任一项所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，所述 PCR扩增反应体系的相应反应程序中，退火温度为60°C，反应循环次数为23~35个循环。9. 如权利要求2所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，在步骤3)中，所述 琼脂糖凝胶电泳所采用的琼脂糖为1~1. 2%的琼脂糖凝胶；电泳的电压为130~150V恒 压，电泳时间为20~25分钟。10. 如权利要求2所述的鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，其特征在于，在步骤4)中，对 结果的分析方法为，扩增出1305bp目的条带的模板对应的为慢羽鸡；未扩增出该片段的模 板对应的为快羽鸡。
【专利摘要】本发明涉及分子遗传学领域，具体而言，涉及一种鸡快慢羽表型的分子鉴定引物，该引物的正向引物为1305s：5’CCTCCTTGCCAAACCTTA3’；反向引物为1305a：5’ATCAGCCAGATCCGTCAG3’。该引物特异性好，扩增效率高，可用于鸡快慢羽表型的分子鉴定。本发明还提供了一种鸡快慢羽表型的分子鉴定方法，该方法与上述引物配合进行实验，操作简便，可行性高，可以解决快慢羽鉴定中存在的鉴定标准不够明确、鉴定结果准确率不高、雌雄配套系建系时间长、鉴定时间有限制的问题。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105154571
【申请号】CN201510680524
【发明人】李兰会, 张秀玲, 李祥龙, 臧素敏, 张乐超, 刘春杨, 周荣艳
【申请人】河北农业大学, 河北科技师范学院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月19日