一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法
【技术领域】
[0001] 本项发明属于植物基因工程领域，尤其设及一种用于筛选水稻祀向基因编辑植株 的方法。
【背景技术】
[0002] 在现代生物学研究中，基因组编辑（Genomicediting,G巧技术是人们了解和改良 基因功能的重要技术手段。基因组编辑技术的发展先后经历了锋指核酸酶狂incfinger nucleases,ZFNs)技术、转录激活因子样效应物核酸酶（Transcriptionactivatorlike effectornucleases,TALENs)技术、和规律成簇间隔短回文重复blusteredregularly interspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR)/Cas(CRISPR-assoicated)技术。运些 人工核酸酶都可W在DNA祀位点产生DNA双链断裂值oublestrandbreaks,DSBs)，然后 利用生物本身拥有的非同源末端连接或同源重组两种不同的修复机制对DSBs进行修复， 实现对基因组的定点编辑。
[0003] 其中，CRISPR/Cas系统是近两年来刚刚兴起但表现为最有应用前景的一项基因组 编辑（Genomicediting,GE)技术，它具有操作简便、效率高等特点，已在拟南芥、烟草、水 稻、高梁等植物中成功实现祀向诱变（参见：NucleicAcidsRes，2013,41(20):el88;rfet Biotech, 2013, 31 (8) :688 - 691 ;化tBiotech, 2013, 31 (8) :691 - 693)。其原理是利用祀点 特异性的RNA将化s9核酸酶引导到基因组上的具体祀点，从而对特定基因位点进行切割导 致突变。利用CRISPR/tas技术进行基因编辑有特异性、祀向性、可遗传性等优势。
[0004] 因为植物和动物的细胞构造不同，植物有细胞壁，不能通过显微注射的方法获得 基因编辑植株，需要农杆菌介导。W水稻为例，由CRISPR/Cas技术获得基因编辑的植株步 骤是：设计两条单链OligO序列，退火形成双链DNA;将双链DNA连接到载体中，转化农杆 菌；农杆菌侵染水稻愈伤组织；愈伤组织分化长成待测植株。
[00化]CRISPR技术可W在目标区段内引起不同类型的基因突变，多数为化P插入和小片 段缺失W及一个或多个碱基SNP(参见PNAS，2014, 111(12) :4632-4637)。在利用CRISPR/ Cas技术编辑产生的水稻突变群体中，有不同比例的单株出现不同状态的突变，如：嵌合 体、杂合型、双等位基因突变、纯合型，不同类型突变植株的情况不同，因此需要采用特定的 方法对单株进行鉴别。
[0006]目前，对单株进行鉴别的方法，主要包括有：祀位点直接PCR后TA克隆测序和基于 可W识别错配双链的错配内切酶检测法。克隆测序的方法是将祀序列PCR扩增后，把PCR 产物克隆到T载体中然后进行sanger测序，经测序后可W确切知道运条祀序列上的碱基 变化。克隆测序法灵敏度高，但是相比之下价格贵，时间长，一般的做法是把筛选出的阳性 植株进行测序验证。错配酶法的原理是祀序列经化s/gRNA切割后由于缺乏修复模板，将 主要W非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将祀序列PCR 扩增后经变性、退火，将形成错配，错配酶（主要是T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪 切（参见：化tGenet, 1995, 9:177-183 ;化 1:ure, 2007, 449:621-624!QirrOpinStruct Biol, 2008, 18:86-95)dPCR产物经酶切后跑琼脂糖凝胶电泳，看是否有切割条带，若出现切 割条带，则代表该植株被成功编辑。若没有出现切割条带，则代表该植株未被成功编辑。运 种方法比克隆测序的方法快速，花费少，但是灵敏度不如克隆测序法，且有假阳性的情况产 生。因此，对于CRISPR祀向编辑群体中的突变，目前仍缺乏一种准确率高、成本低廉、快速、 高通量的单株鉴别方法。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于筛选水稻祀向基因编辑植株的方法， 该方法快速、准确率高、且成本低廉。
[0008] 一种用于筛选水稻祀向基因编辑植株的方法，包括：
[0009] (1)W未经编辑的水稻植株为对照植株，W经祀向基因编辑获得的水稻植株为待 测植株，分别提取待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA;
[0010] 似根据与所述祀向基因编辑的祀位点相邻的基因组序列来设计特异性引物，W 所提取的基因组DNA为DNA模板，加入所述特异性引物和巧光染料，PCR扩增所提取的基因 组DNA中包含编辑位点的DNA片段，所述DNA片段长度为200~50化P;
[0011] (3)PCR扩增完毕后直接进行高分辨率烙解曲线化i曲ResolutionMelting,HRM) 分析，W对照植株所对应的高分辨率烙解曲线为基准线，比较待测植株所对应的高分辨率 烙解曲线与对照植株所对应的高分辨率烙解曲线的最大巧光差异AF，若IAFl<0.05,视 为待测植株与对照植株的结果相同，判定该待测植株未成功进行编辑；若IAFl>0.05， 视为待测植株与对照植株的结果不同，判定该待测植株编辑成功。
[0012] 本发明方法中，所述祀向基因编辑是指CRISPR/Cas编辑。
[0013] 本发明方法中，提取所述水稻植株（包括待测植株与对照植株）DNA时，可W采用 水稻的叶片、根等组织。对水稻植株（包括待测植株与对照植株）DNA的提取方法也没有特 殊要求，可W为CTAB法、SDS提取法、TPS提取法等，也可W直接采用商用试剂盒，例如：博 日的植物基因组DNA提取试剂盒、天根的植物DNA提取试剂盒等，进行DNA的提取。
[0014] 本发明方法中，所述DNA模板可W为直接提取的单株待测植株的基因组DNA，也可 W是摩尔比为1:1的待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA的混合。
[0015] 本发明方法中，所述DNA片段中GC含量过高时，采用GCbufferPCR扩增。
[0016] 本发明方法中，所述DNA片段优选为200~4(K)bp。
[0017] 在本发明的一些实施方案中，所述的祀向基因编辑是对水稻L0C_0s03巧5240基 因的CRISPR祀向编辑，所述水稻L0C_0s03巧5240基因的序列如SEQIDNO: 1所示，其中第 453~471位为编辑位点；此时，所述特异性引物的序列优选如下：
[0018] 上游引物BlF:5, -GCACCGCGTCGGCCTCATGT-3,（SEQIDN0:4)
[0019]下游引物BlR:5'-CCTGCTTAAACTCCTGGGCTTCCAC-3'（SEQIDN0:5) W20] 或者，
[0021] 上游引物B2F:5' -TCACCGAGCACGACGTGACCTT-3'（沈QIDN0:6)
[0022] 下游引物B2R:5, -CACGCTGAGGGAGACCTCGAACA-3'（SEQIDN0:7)
[0023]优选所述PCR扩增的反应体系如下srhgiO. 2yL;2XGCbuffer，5yL;2. 5mix dNTP，1.6yL;10yM的上游引物，0.2yL;10yM的下游引物，0.2yL;10XEvaGreen, IJiL;50ng/JiL的DM,IJiL;无菌水I. 3JiL;矿物油 10-20JiL。
[0024] 优选所述PCR扩增的反应程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，55-65°C退火 30s，72°C延伸30s，共40个循环；72°C延伸7min。
[00巧]在本发明的另一些实施方案中，所述的祀向基因编辑是对水稻大斑基因L0C_ 0sl2gl6720的CRISPR祀向编辑，所述水稻大斑基因L0C_0sl2gl6720的序列如沈QIDN0:8 所示，其中第764~785位为编辑位点；此时，所述特异性引物的序列如下：
[0026]上游引物T2F:5, -CGGTGGTGATCTCCAAGCC-3'（SEQIDN0:11)
[0027]下游引物T2R:5' -GGGAAGAAGTCGCCGATGGT-3'（SEQIDN0:12)
[0028]优选所述PCR扩增的反应体系如下 ^aq, 0. 2yL;2XGCbuffer, 5yL;2. 5mix dNTP，1.6yL;10yM的上游引物，0.2yL;10yM的下游引物，0.2yL;10XEvaGreen， IyL;50ng/yL的DM,IyL;无菌水I. 3yL;矿物油 10-20yL。
[0029] 优选所述PCR扩增的反应程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s， 72°C延伸30s，共40个循环；72°C延伸7min。
[0030] 本发明方法中，对包含祀向编辑的祀位点的一段核巧酸序列设计特异性引物对， 进行PCR扩增后采用HRM检测，由于CRISPR/Cas祀向编辑是针对特定的位点进行突变， CRISPR/Cas祀向编辑成功的植株的DNA只在特定的祀位点上进行突变，而正常植株和未成 功编辑的植株则不会产生DNA的差异，从而实现基因分型。采用本发明方法进行筛选的结 果经测序验证，准确率高，假阳性低，表明本发明的筛选方法有效、结果准确。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有W下有益的技术效果： 阳0巧 （1)本发明的筛选方法中，HRM检测不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异 性探针，在PCR之后可直接用HRM检测，即可完成对样品突变的分析，省去了琼脂糖电泳等 步骤，该方法具有操作简便快速的优点。 阳03引 似本发明的筛选方法中，CRISPR祀向编辑产生的各种突变类型均能与未编辑成 功的植株有效区分开来，假阳性较低，并且，经由测序验证其准确率高，该方法有效、结果准 确。
[0034] (3)本发明的筛选方法中，HRM引物易于高通量操作。PCR扩增产物可W在仪器上 如Li曲tScanner上直接分型，完成对突变体植株的鉴定，因此较其他方法更加适用于高通 量分析。
[0035] (4)本发明的筛选方法中，一次可W同时检测96个样品，比克隆测序和错配酶检 测都要节约成本，该方法具有成本低廉的优势。
[0036] (5)利用本发明的方法辅助育种，方便、准确，节约成本，能大大提高植株筛选效 率。
【附图说明】
[0037] 图Ia~Ie分别为实施例1中双等位突变的待测植株样本、嵌合体的待测植株样 本