本发明涉及植物超氧化物歧化酶的提取领域，具体的说是涉及一种植物超氧化物歧化酶提取的新方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是一种酸性的金属酶，在生物体内能够催化自由基发生歧化反应，并且能够消除机体内超氧阴离子自由基(O2-)保护机体的细胞过快衰老。到目前为止，人们已经从包括细菌、真菌、藻类、植物和动物等多种生物体内分离出SOD。自上世纪三十年代首次从牛的红血球中分离得到SOD，人们曾一直致力于从动物肝脏和血液中提取并分离SOD，并已取得了显著的成果，在医学等众多方面都有应用。但是由于动物血液中提取得到的SOD容易被病毒感染，且动物的饲养过程中易受到饲料、疾病等的因素影响。
植物中的SOD多属植物天然蛋白，不仅可以避免发生病毒交叉感染，而且不含有对人体有害的物质。含有SOD的植物的来源广泛，一般价格都比较低廉，目前大多研究是从大蒜、玉米、番茄、猕猴桃等日常蔬菜、瓜果中提取SOD。天然的超氧化物歧化酶存在稳定性差、活性易损失等问题，而目前研究报道的植物SOD提取工艺中，大多是利用热变性原理，这一处理会使酶蛋白分子发生亚基的解聚、变性或其他方面的构象变化，导致酶活性的下降或丧失，产品稳定性差、活性难保存；而且生产过程中需要使用大量的有机溶剂，提取程序复杂，使得产品的成本较高，生产周期较长，产率不高，因此，植物SOD的生产还只停留在实验室阶段，尚未实现工业化生产。
技术实现要素：
本专利提供了一种植物超氧化物歧化酶提取的新方法。通过样品预处理、粗酶液的制备、脱色和激活、有机溶剂除杂、丙酮沉淀SOD和冷冻干燥等处理过程。
本发明采用的技术方案：一种植物超氧化物歧化酶提取的新方法，其特征在于按下述步骤操作：
称取一定质量的植物鲜果或鲜叶，加入生理盐水冷冻后用打浆机打浆，加入保护剂和溶膜剂置于冰箱中一定时间，冷冻离心，上清液即为原材料的预处理酶液，预处理的酶液先过截留分子量为10万 Dal后过1万 Dal的膜，所得浓缩液加入适量激活剂、木质活性炭和活性白土脱色离心后，置于冰箱冷冻一定时间，加入混合有机溶剂进行除杂，经丙酮沉淀后获得活性在1300~1800 U/mg的超氧化物歧化酶产品。
所述植物鲜果或鲜叶原料预处理酶液的制备具体步骤如下：将鲜果或鲜叶洗干净，准确称取一定质量的原料，加入1.5~2倍体积的生理盐水、0.1倍的聚乙二醇保护剂和0.05倍的曲拉通溶膜剂，冷冻至有冰晶，然后用打浆机打浆，放入冰箱中1小时，冷冻离心，所得上清液即为预处理酶液。
所述膜过滤的具体操作步骤如下：将预处理酶液先用截留分子量为10万的膜过滤，透过液再经截留分子量为1万的膜过滤，浓缩至1/5时得到超氧化物歧化酶粗提液。
所述加入适量激活剂、木质活性炭和活性白土脱色的具体操作步骤如下：每100 mL超氧化物歧化酶粗提液中加入2.5 g木质活性炭、1.25 g活性白土和适量激活剂，置于120 rpm/min的摇床上进行摇荡脱色。
所述除杂处理的具体操作步骤如下：将权利要求4所述脱色后的粗提液离心，加入粗提液体积1/3倍的混合有机溶剂，混合有机溶剂由乙醇：氯仿质量比为5:3混合而成，充分混匀，冷冻离心，将清液和氯仿分离，向得到的清液中加入其总体积0.6倍的丙酮，冷冻离心，除去杂蛋白。
所述丙酮沉淀的具体操作步骤如下：将权利要求5所述上清液放在冰箱中冷冻，然后加入其1.2倍体积的冷丙酮溶液，离心后将其沉淀在冷冻干燥器中冷冻干燥，得粉末状超氧化物歧化酶产品。
本发明具有以下优点：
（1）加入保护剂、溶膜剂和激活剂，可延长SOD的半衰期、破膜及使SOD酶蛋白处于活性状态。
（2）采用膜过滤浓缩法获得SOD粗品，首先用10万膜过滤，去除了多糖和大分子量的蛋白质，为后续除杂减轻了压力。后经1万膜过滤，去除了单糖、小分子的有机酸和维生素C，有效避免了维生素C对微量连苯三酚测定SOD活性时的影响，同时SOD酶液大大浓缩，降低了溶剂的使用量，有效节约了经济成本。
（3）加入活性白土和木质活性炭，以除去色素，有助于SOD活性的提高。
(4) 该工艺去除了超氧化物歧化酶传统工艺中的热变处理过程。
附图说明
图1 本发明工艺流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但它并不是对本发明的限定。
实施例1：
从神州草中提取超氧化物歧化酶，具体按下述步骤操作：
1、准确称取1000 g神州草，放入小桶中，然后加入2000 mL生理盐水，100 mL保护剂（千分之3浓度的聚乙二醇）和10 mL溶膜剂（曲拉通），用打浆机打浆，放入冰箱中冷冻至有冰晶。
2、将含有冰晶的神州草浆进行冷冻离心，将上清液约2100 mL放入冰箱中冷冻1小时后，先过截留分子量为十万的膜过滤设备，透过液进入截留分子量为一万的膜过滤设备，浓缩至200 mL用于SOD的提取。
3、神州草浓缩液200 mL中加入5g木质活性炭和2.5g活性白土放入三角瓶中，同时加入0.2 mL激活剂（饱和氯化铜溶液）放在120 rpm/min的摇床上振荡1小时进行脱色。
4、将激活脱色后的浆液离心，约180 mL清液加入混合有机溶剂55 mL（乙醇：氯仿=5:3），充分混匀，冷冻1小时，离心，将清液和氯仿相分离。
5、向清液235 mL中加入150 mL的丙酮，冷冻1小时，离心，除去杂蛋白。
6、将上清液放在冰箱中冷冻20 min，然后再加入130 mL丙酮溶液，充分摇匀后冷冻1小时。
7、离心后将其沉淀在冷冻干燥器中冷冻干燥得约0.12克SOD产品，检测其活性为1380 U/mg。
实施例2：
从野生猕猴桃中提取超氧化物歧化酶，具体按下述步骤操作：
1、准确称取1000 g野生猕猴桃果，放入小桶中，然后加入2000mL生理盐水，100 mL保护剂（千分之3浓度的聚乙二醇）和10 mL溶膜剂（曲拉通），用打浆机打浆，冷冻至有冰晶。放入冰箱中一小时。
2、将含有冰晶的野生猕猴桃果浆进行冷冻离心，将上清液约2600 mL放入冰箱中冷冻1小时后，先过截留分子量为十万的膜过滤设备，透过液进入截留分子量为一万的膜过滤设备，浓缩至200 mL用于SOD的提取。
3、野生猕猴桃果浓缩液200 mL中加入5g木质活性炭和2.5g活性白土放入三角瓶中，同时加入0.2 mL激活剂（饱和氯化铜溶液）放在120 rpm/min的摇床上振荡1小时进行脱色。
4、将激活脱色后的浆液离心，约180 mL清液加入混合有机溶剂55 mL（乙醇：氯仿=5:3），充分混匀，冷冻1小时，离心，将清液和氯仿相分离。
5、向清液235 mL中加入150 mL的丙酮，冷冻1小时，离心，除去杂蛋白。
6、将上清液放在冰箱中冷冻20 min，然后再加入130 mL丙酮溶液，充分摇匀后冷冻1小时。
7、离心后将其沉淀在冷冻干燥器中冷冻干燥得约0.25克SOD产品，检测其活性为1670 U/mg。
实施例3：
从沙棘果中提取超氧化物歧化酶，具体按下述步骤操作：
1、准确称取1000 g沙棘果，放入小桶中，然后加入2000mL生理盐水，100 mL保护剂（千分之3浓度的聚乙二醇）和10 mL溶膜剂（曲拉通），用打浆机打浆，冷冻至有冰晶。放入冰箱中一小时。
2、将含有冰晶的沙棘果浆进行冷冻离心，将上清液约2400 mL放入冰箱中冷冻1小时后，先过截留分子量为十万的膜过滤设备，透过液进入截留分子量为一万的膜过滤设备，浓缩至200 mL用于SOD的提取。
3、沙棘果浓缩液200 mL中加入5g木质活性炭和2.5g活性白土放入三角瓶中，同时加入0.2 mL激活剂（饱和氯化铜溶液）放在120 rpm/min的摇床上振荡1小时进行脱色。
4、将激活脱色后的浆液离心，约180 mL清液加入混合有机溶剂55 mL（乙醇：氯仿=5:3），充分混匀，冷冻1小时，离心，将清液和氯仿相分离。
5、向235 mL清液中加入150 mL的丙酮，冷冻1小时，离心，除去杂蛋白。
6、将上清液放在冰箱中冷冻20 min，然后再加入130 mL丙酮溶液，充分摇匀后冷冻1小时。
7、离心后将其沉淀在冷冻干燥器中冷冻干燥，得约0.11克SOD产品，检测其活性为1310 U/mg。