拟南芥中抗白粉霉相关基因UBC19及其编码蛋白与应用的制作方法
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及拟南芥中抗白粉霉相关基因UBC19及其编码蛋白与应用。
背景技术：
白粉霉(Powdery mildew)属子囊菌类(ascomycete)，是一类典型的活体营养型真菌，它从活的植物体上获取营养物质完成其自身的生长并繁殖后代。白粉霉侵染寄主植物后，因其菌丝和分生孢子在侵染的植物体器官表面形成一层白粉而得名。全世界有16个属接近900种的白粉霉能够侵染包括小麦、大麦、土豆、葡萄等在内的主要农作物，每年给农业生成造成严重损失。
已知的植物对抗白粉霉相关基因及信号传导途径大多与激活水杨酸抗性途径有关。水杨酸抗性途径的激活、水杨酸的积累通常会造成细胞内活性氧的富集以及细胞死亡现象，造成植株矮小、产量降低等不良后果。因此发掘不激活水杨酸途径的新的抗性途径非常重要。
已有报道发现白粉霉(Golovinomyces orontii)可以诱导拟南芥侵染位点及附近叶肉细胞的发生内复制，便于白粉霉与植物细胞间的营养物质交流，白粉霉得以生长，当转录因子MYB3R4发生功能缺失突变后，细胞的内复制过程受阻，植株表现对白粉霉抗病性，说明其细胞倍性的改变对白粉霉正常生长是必要的。
在对拟南芥非水杨酸依赖的抗病途径中的研究过程中，我们发现了一个与细胞周期调控相关的因子，UBC19(Ubiquitin-conjugating enzyme 19，AT3G20060)不仅仅参与细胞周期从G2到M期的转变，同时也参与拟南芥对白粉霉Golovinomyces cichoracearum的抗性。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开了一种拟南芥中抗白粉霉相关基因UBC19及其编码蛋白与应用。
本发明公开了这种抗白粉霉相关蛋白，其序列是：
MATVNGYTGNTPAATTPAATGSKQSAPPTKTVDSHSVLKRLQSELMGLMMGADPGISAFPEEDNIFCWKGTITGSKDTVFEGTEYRLSLTFSNDYPFKSPKVKFETCCFHPNVDLYGNICLDILQDKWSSAYDVRTILLSIQSLLGEPNISSPLNNQAAQLWSNQEEYRKMVEKLYKPLNA(SEQ ID NO：1)。
本发明还公开了这种蛋白序列对应的核酸序列：
5’-ATGGCGACGGTTAATGGGTACACAGGGAATACTCCGGCGGCGACTACACCGGCAGCCACCGGATCAAAGCAATCTGCTCCTCCGACTAAGACCGTCGATAGCCACTCCGTTCTAAAAAGGCTGCAATCTGAACTAATGGGATTGATGATGGGAGCTGATCCGGGGATATCTGCGTTTCCAGAGGAAGACAACATATTTTGCTGGAAAGGAACAATTACAGGAAGCAAAGATACTGTGTTCGAAGGAACTGAGTACAGACTCTCACTCACTTTCTCTAACGATTATCCTTTTAAGTCTCCCAAAGTTAAGTTTGAGACATGCTGCTTCCACCCCAATGTGGATCTCTATGGCAATATTTGCTTGGACATTCTTCAGGATAAATGGTCATCTGCTTATGATGTGAGGACGATATTACTCTCAATTCAAAGCCTTCTCGGAGAACCGAACATCAGCTCACCATTGAACAATCAAGCGGCTCAGCTTTGGAGCAATCAAGAAGAGTACAGGAAGATGGTTGAGAAGCTCTACAAGCCTTTAAACGCATGA-3’(SEQ ID NO：2)。
本发明公开了一种检测和评价植物抗病性的方法，其特征是：检测蛋白序列SEQ ID NO：1或基因序列SEQ ID NO：2的表达情况，当其表达水平高于野生型5倍时，则表明植物抗病。
优选的，检测基因SEQ ID NO：2表达情况的引物是：
UBC19-L：5’-ATGGCGACGGTTAATGGGTACACA-3’(SEQ ID NO：3)；
UBC19-R：5’-CGGTCTTAGTCGGAGGAGCAGATTG-3’(SEQ ID NO：4)。
本发明公开了一种抗白粉霉相关蛋白的载体，该载体内插入有序列为SEQ ID NO：2的核酸。
本发明公开了一种构建抗病植株的方法，其特征是：将序列为SEQ ID NO：2核酸转入植物并使其高表达。
本发明公开了一种抗白粉霉相关蛋白的基因检测试剂盒，其特征是：含有检测基因序列SEQ ID NO：2的引物。
优选的，检测基因序列SEQ ID NO：2的引物序列是：
UBC19-L：5’-ATGGCGACGGTTAATGGGTACACA-3’(SEQ ID NO：3)；
UBC19-R：5’-CGGTCTTAGTCGGAGGAGCAGATTG-3’(SEQ ID NO：4)。
本发明的有益效果是：当序列为SEQ ID NO：1的蛋白或序列为SEQ ID NO：2的基因表达量高时，植株会表现出对白粉霉的抗性。因此，其可用于监测评估拟南芥对白粉霉的抗性，也可利用该蛋白或基因减少白粉霉对植株的损害，在农业保护上具有重要的价值。
附图说明
图1显示UBC19功能缺失后拟南芥对白粉霉敏感。A中为正常生长4周大的植株。标尺为1厘米。B中台盼蓝染色为接种5天后的结果，黑色标尺代表0.5毫米。C中为接种5天后孢子计数。使用One-Way ANOVA(单因素方差分析)法，使用LSD分组法进行多重比较检验。所有转基因植物均为Col野生型背景。
图2显示UBC19过表达株系无生长缺陷但对白粉霉有抗性。A中上图为正常生长4周大的植株。图中白色标尺为1厘米。下图为接种5天之后台盼蓝染色结果。图中黑色标尺为0.5毫米。B中为接种5天后孢子计数。使用One-Way ANOVA(单因素方差分析)法，使用LSD分组法进行多重比较检验。所有转基因植物均为Col野生型背景，UBC19分别带有HA，MYC和GFP标签。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实验例1拟南芥中抗白粉霉相关基因UBC19及其编码蛋白与应用
以拟南芥Col-0为材料，在对抗白粉霉突变体pmr5(Mutations in PMR5result in powdery mildew resistance and altered cell wall composition Plant Journal.2004Dec；40(6):968-78)进行研究的过程中，发现了一个互做蛋白UBC19(At3g20060)。其ORF全长为546bp，编码181个氨基酸，其蛋白序列是：
MATVNGYTGNTPAATTPAATGSKQSAPPTKTVDSHSVLKRLQSELMGLMMGADPGISAFPEEDNIFCWKGTITGSKDTVFEGTEYRLSLTFSNDYPFKSPKVKFETCCFHPNVDLYGNICLDILQDKWSSAYDVRTILLSIQSLLGEPNISSPLNNQAAQLWSNQEEYRKMVEKLYKPLNA(SEQ ID NO：1)。
利用引物：
Forward 5’-ATGGCGACGGTTAATGGGTACAC-3’(SEQ ID NO：3)；
reverse 5’-TCATGCGTTTAAAGGCTTGTAGAG-3’(SEQ ID NO：5)以野生型拟南芥cDNA为模板扩增，获得PCR产物测序：
5’-ATGGCGACGGTTAATGGGTACACAGGGAATACTCCGGCGGCGACTACACCGGCAGCCACCGGATCAAAGCAATCTGCTCCTCCGACTAAGACCGTCGATAGCCACTCCGTTCTAAAAAGGCTGCAATCTGAACTAATGGGATTGATGATGGGAGCTGATCCGGGGATATCTGCGTTTCCAGAGGAAGACAACATATTTTGCTGGAAAGGAACAATTACAGGAAGCAAAGATACTGTGTTCGAAGGAACTGAGTACAGACTCTCACTCACTTTCTCTAACGATTATCCTTTTAAGTCTCCCAAAGTTAAGTTTGAGACATGCTGCTTCCACCCCAATGTGGATCTCTATGGCAATATTTGCTTGGACATTCTTCAGGATAAATGGTCATCTGCTTATGATGTGAGGACGATATTACTCTCAATTCAAAGCCTTCTCGGAGAACCGAACATCAGCTCACCATTGAACAATCAAGCGGCTCAGCTTTGGAGCAATCAAGAAGAGTACAGGAAGATGGTTGAGAAGCTCTACAAGCCTTTAAACGCATGA-3’(SEQ ID NO：2).
实验例2生物材料与处理：
本实验采用的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)采用Columbia(Col-0)生态型。白粉霉为Golovinomyces cichoracearum。
首先让白粉霉在4周大小健康的Col植株上生长7-10天，作为菌源，此时菌的活力最强。
大量接菌的方法(用于表型观察，染色镜检等):
1)将生长状态良好的白粉霉，通过磨擦直接均匀抖落在4周大小的植株上；
2)接菌10天后取叶片进行表型鉴定和染色观察。
定量接菌的方法(用于定量孢子的生长):
1)定量接菌所用的接菌箱为一个长、宽、高分别为100cm、100cm、120cm的方形纸箱(如果植物少可将长宽适当的减小，高不变)，在其正上方用一根可伸缩直径为10cm的两端开口的圆管(使用时尽量让入口靠近纸箱)联通外部，去掉底部纸板；
2)将待接菌的植物放置在接菌箱里，并在4个角处各放置一片载玻片；
3)用电吹风把生长在作为菌源的白粉从圆管处吹入纸箱；
4)静置30min，使孢子均匀从高处落下，然后放回培养箱；
5)镜检载玻片，观察接菌的密度和均匀程度；
6)5天后取样进行台盼蓝染色和孢子计数。
实验例3台盼蓝染色及白粉霉的定量分析
台盼蓝染色
1)拟南芥接种白粉霉8天后，将叶片剪下放入EP管中，加入台盼蓝染液，使染液完全没过叶片，沸水煮2min。
2)室温放置30min，倒掉染色液，然后用清水漂洗叶片2次。
3)加入水合氯醛脱色液，脱色12hr，清水漂洗3次后，50％甘油保存。
白粉霉的定量分析
染色后的叶片压片，腹面向上，体式镜观察。每个样品统计不低于12个conidiophores分别产生的spores，进行3个生物学重复。
实验例4ubc19突变体的获得
通过CRISPR-cas9技术，选取UBC19基因编码区设计了两个特异靶点：
Target 1:5’-AGGCTGCAATCTGAACTAAT-3’(SEQ ID NO：6)，
Target 2:5’-GTACACAGGGAATACTCCGG-3’(SEQ ID NO：7)，分别连接到pYLgRNA-AtU3b和pYLgRNA-AtU6-1载体上，然后用边切(Bsa I，type II restriction enzyme)边连(T4DNA ligase)法，将这两段靶点序列共同连接到带有潮霉素抗性的pCRISPR/Cas9-DH载体，转化大肠杆菌DH5a后筛选得到阳性克隆，提取质粒DNA转化农杆菌GV3101，鉴定阳性农杆菌克隆后，再通过农杆菌侵染Col-0，利用潮霉素平板筛选阳性转化子植株，并根据两个靶点位置上下游约200bp左右的基因组序列，设计两端引物，以转化子植株基因组DNA为模板进行PCR扩增，其PCR产物直接送测序以鉴定靶点序列附近的区域是否发生了碱基的缺失突变。
实验例5UBC19过表达植株的获得
为了构建UBC19的过表达植物表达载体，我们根据拟南芥UBC19的基因组序列设计了引物，以野生型植株的基因组DNA为模版，进行高保真PCR反应，将获得的基因组序列DNA进行Kpn I和Xma I双酶切反应，回收其中包含有UBC19基因序列的目的条带。同时提取分别带有HA，MYC和GFP标签的pSuper 1300载体的质粒DNA进行Kpn I和Xma I双酶切反应，回收大约12kb左右目的条带。将表达载体的酶切回收产物与含有UBC19基因序列的酶切产物进行T4连接反应，其连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，通过酶切分析与测序检验，获得阳性克隆。分别将带有不同标签的过表达载体通过农杆菌介导的方法，蘸花法转化野生型拟南芥Col，然后在潮霉素平板上筛选转化阳性植株。利用UBC19基因内部的一段序列所设计的引物和位于表达载体上的引物，可以检测转基因植株是否为阳性。转基因株系中UBC19基因在超强Super启动子的作用下获得超表达，其过表达水平通过荧光定量PCR的方法检测。含有不同标签(HA，MYC和GFP)的转基因株系提取总蛋白后用相应的抗体通过western blot手段检测UBC19蛋白的表达。
实验例6UBC19系列功能缺失突变体对白粉霉敏感
为了研究UBC19基因在抗病反应中的功能，我们对ubc19突变体进行了定量的抗病表型鉴定。在接种白粉霉之前，ubc19突变体生长正常，同野生型Col相比并无明显生长缺陷表型及发育缺陷(图1A)。我们发现接种白粉霉10天后，ubc19突变体叶片上长满厚厚的一层白粉霉，菌丝生长量明显多于野生型(图1B)。孢子生长定量结果进一步证明，ubc19对白粉霉具有明显增强的感病性(图1C)。表明UBC19对于拟南芥白粉霉抗性具有重要作用。
实验例7过表达UBC19可提高拟南芥对白粉霉的抗性
利用引物：
UBC19-L：5’-ATGGCGACGGTTAATGGGTACACA-3’(SEQ ID NO：3)；
UBC19-R：5’-CGGTCTTAGTCGGAGGAGCAGATTG-3’(SEQ ID NO：4)对UBC19基因的表达量进行分析。结果表明在野生型Col过表达UBC19基因时会明显增强拟南芥对白粉霉的抗性，不管是带HA，还是带GFP或MYC标签的转基因植株均表现一致，且不会产生生长缺陷表型，进一步说明了UBC19对拟南芥白粉霉抗性有重要作用(图2)。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 拟南芥中抗白粉霉相关基因UBC19及其编码蛋白与应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> UBC19
<400> 1
Met Ala Thr Val Asn Gly Tyr Thr Gly Asn Thr Pro Ala Ala Thr Thr
1 5 10 15
Pro Ala Ala Thr Gly Ser Lys Gln Ser Ala Pro Pro Thr Lys Thr Val
20 25 30
Asp Ser His Ser Val Leu Lys Arg Leu Gln Ser Glu Leu Met Gly Leu
35 40 45
Met Met Gly Ala Asp Pro Gly Ile Ser Ala Phe Pro Glu Glu Asp Asn
50 55 60
Ile Phe Cys Trp Lys Gly Thr Ile Thr Gly Ser Lys Asp Thr Val Phe
65 70 75 80
Glu Gly Thr Glu Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Phe Ser Asn Asp Tyr Pro
85 90 95
Phe Lys Ser Pro Lys Val Lys Phe Glu Thr Cys Cys Phe His Pro Asn
100 105 110
Val Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Cys Leu Asp Ile Leu Gln Asp Lys Trp
115 120 125
Ser Ser Ala Tyr Asp Val Arg Thr Ile Leu Leu Ser Ile Gln Ser Leu
130 135 140
Leu Gly Glu Pro Asn Ile Ser Ser Pro Leu Asn Asn Gln Ala Ala Gln
145 150 155 160
Leu Trp Ser Asn Gln Glu Glu Tyr Arg Lys Met Val Glu Lys Leu Tyr
165 170 175
Lys Pro Leu Asn Ala
180
<210> 2
<211> 546
<212> DNA
<213> UBC19
<400> 2
atggcgacgg ttaatgggta cacagggaat actccggcgg cgactacacc ggcagccacc 60
ggatcaaagc aatctgctcc tccgactaag accgtcgata gccactccgt tctaaaaagg 120
ctgcaatctg aactaatggg attgatgatg ggagctgatc cggggatatc tgcgtttcca 180
gaggaagaca acatattttg ctggaaagga acaattacag gaagcaaaga tactgtgttc 240
gaaggaactg agtacagact ctcactcact ttctctaacg attatccttt taagtctccc 300
aaagttaagt ttgagacatg ctgcttccac cccaatgtgg atctctatgg caatatttgc 360
ttggacattc ttcaggataa atggtcatct gcttatgatg tgaggacgat attactctca 420
attcaaagcc ttctcggaga accgaacatc agctcaccat tgaacaatca agcggctcag 480
ctttggagca atcaagaaga gtacaggaag atggttgaga agctctacaa gcctttaaac 540
gcatga 546
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggcgacgg ttaatgggta caca 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggtcttagt cggaggagca gattg 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcatgcgttt aaaggcttgt agag 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aggctgcaat ctgaactaat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtacacaggg aatactccgg 20
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