厦霉素a和氧厦霉素的生物合成基因簇及其应用的制作方法

专利名称：厦霉素a和氧厦霉素的生物合成基因簇及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及吲哚倍半萜类抗生素厦霉素A(xiamycin A)和氧厦霉素(oxiamycin)的生物合成基因簇及其应用。
背景技术：
吲哚倍半萜是一类含有吲哚的生物碱。已报道发现的吲哚倍半萜生物碱类化合物主要来源于植物，例如来自暗罗属植物Polyalthia oliveri的polyalthenol ;来自舌甘杨(P. suaveolens)的 polyveoline 以及来自 Greenwayodendron suaveolens 的suaveolindole等,最近的一个例子是polysin和pentacyclindole。直到最近十年，真菌来源的11引哚倍半職才陆续被报道,包括sespendole和lacanindoles。Cane的基因组数据挖掘工作表明放线菌是萜类化合物的丰富来源。与此相对应，最近，一些来源于放线菌的吲 哚倍半職类化合物相继被发现，包括从一株土壤链霉菌中分离到的oridamycin A和B,从两个红树林植物内生链霉菌中分离到的厦霉素A (xiamycin A，I)，其结构式如图I所示和B，以及 indosespene (3)和 sespenine。研究发现，来自 Streptomyces sp. strain KS84 的Oridamycins A和B具有抗真菌活性，来自红树林内生菌Streptomyces sp. GT2002/1503的厦霉素A具有选择性的抗HIV活性和中等抗菌活性。近十多年来发展起来的组合生物合成技术为改造复杂天然产物提供了新的思路和方法。在阐明了自然界的生物合成途径、克隆和鉴定微生物天然产物生物合成基因簇的基础上，采用组合生物合成技术对发现的生物合成基因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等操作，不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。

发明内容
本发明的第一个目的是提供一种厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇。本发明的厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇，其特征在于，该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第2693 26792位的碱基序列所示，包含18个基因，具体为(I)负责職类骨架合成的基因，即xiaD、xiaE、xiaF、xiaN、xiaP共5个基因xiaD位于基因簇核苷酸序列第5512-6504个碱基处，长度为993个碱基对，编码4-羟基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸还原酶，330个氨基酸；xiaE位于基因簇核苷酸序列第6517-8334个碱基处，长度为1818个碱基对，编码I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶,605个氨基酸；xiaF位于基因簇核苷酸序列第8331-9482个碱基处，长度为1152个碱基对，编码4-羟基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸合酶，383个氨基酸；XiaN位于基因簇核苷酸序列第16457-17482个碱基处，长度为1026个碱基对，编码聚异戊二烯二磷酸合酶，341个氨基酸；xiaP位于基因簇核苷酸序列第19795-20802个碱基处，长度为1008个碱基对，编码聚异戊二烯合成酶，335个氨基酸；(2)氧化还原酶基因，即 xiaA、xiaB、xiaI、xiaJ、xiaK、xiaL、xiaM、xiaO 共 8 个基因XiaA位于基因簇核苷酸序列第2693-3784个碱基处，长度为1092个碱基对，编码含有Rieske 2Fe-2S (铁硫蛋白)结构域加氧酶，363个氨基酸；xiaB位于基因簇核苷酸序列第3843-4337个碱基处，长度为495个碱基对，编码黄素还原酶，164个氨基酸；
xial位于基因簇核苷酸序列第11512-12705个碱基处，长度为1194个碱基对，编码吲哚氧化酶/乙酰CoA脱氢酶，397个氨基酸；XiaJ位于基因簇核苷酸序列第12708-13097个碱基处，长度为390个碱基对，编码柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶，129个氨基酸；XiaK位于基因簇核苷酸序列第13100-14890个碱基处，长度为1791个碱基对，编码芳香环羟化酶，596个氨基酸；XiaL位于基因簇核苷酸序列第14890-15123个碱基处，长度为234个碱基对，编码铁氧化还原蛋白，77个氨基酸；XiaM位于基因簇核苷酸序列第15149-16318个碱基处，长度为1170个碱基对，编码细胞色素P450氧化酶,389个氨基酸；xiaO位于基因簇核苷酸序列第17610-19766个碱基处，长度为2157个碱基对，编码单加氧酶，718个氨基酸；(3)编码调控子和转运子的基因，即xiaC、xiaG、xiaH、xiaQ、xiaR共5个基因xiaC位于基因簇核苷酸序列第4502-5278个碱基处，长度为777个碱基对，编码IclR家族的转录调控蛋白，258个氨基酸；xiaG位于基因簇核苷酸序列第9930-10652个碱基处，长度为723个碱基对，编码LuxR家族调控蛋白，240个氨基酸；xiaH位于基因簇核苷酸序列第10645_11445个碱基处，长度为801个碱基对，编码假定的膜蛋白，266个氨基酸；xiaQ位于基因簇核苷酸序列第20897-23875个碱基处，长度为2979个碱基对，编码LuxR家族的转录调控蛋白，992个氨基酸；xiaR位于基因簇核苷酸序列第24018-26792个碱基处，长度为2775个碱基对，编码LuxR家族的转录调控蛋白，924个氨基酸。在厦霉素A生物合成基因簇的上下游基因，即orf (-2)、orf(-l)、orfl、orf2共4个基因orf (-2)位于基因簇核苷酸序列第1_1644个碱基处，长度为1644个碱基对，编码FAD (黄素腺嘌呤二核苷酸)依赖型氧化还原酶，547个氨基酸；orf (-1)位于基因簇核苷酸序列第1641-2696个碱基处，长度为1056个碱基对，编码乙醇脱氢酶，351个氨基酸；orfl位于基因簇核苷酸序列第27049-27486个碱基处，长度为438个碱基对，编码锌金属蛋白酶，编码145个氨基酸；orf2位于基因簇核苷酸序列第27845-29371个碱基处，长度为1527个碱基对，编码假定的钠耦合通透酶，编码508个氨基酸。SEQ ID NO. I的第2693位到26792位的碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。SEQ ID NO. I的第2693位到26792位的的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限 制性内切酶酶切相应的DNA或DNA体外合成技术或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO. I的第2693位到26792位中DNA序列的重组DNA载体的途径。本发明还提供了产生厦霉素A生物合成基因被中断或其他基因改造的途径，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO. I的第2693位到26792位中的核苷酸序列。本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列SEQ ID NO. I的第2693位到26792位的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与厦霉素A生物合成基因簇相似的基因。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从链霉菌SCSIO 02999基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有链霉菌SCSIO 02999基因组中邻近区域未克隆的DNA。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修饰或进行突变，包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并了解它们在宿主代谢中的功能。包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成indosespene类化合物，进一步催化合成抗生素厦霉素A。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得其他新型生物合成途径或者产生新的化合物。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因DNA片段可以通过中断厦霉素A生物合成的一个或几个步骤而得到新的厦霉素结构类似物或前体。包含DNA片段或基因可以用来提高厦霉素A或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。本发明所提供的催化合成indosespene类化合物的合成基因可用于合成厦霉素A衍生物。本发明所提供的厦霉素骨架的后修饰基因或其他酶提供了通过遗传修饰得到类似物的途径，所包含的催化吲哚倍半萜类化合物生成或后修饰的其他应用。本发明所提供的n引哚氧化酶XiaI是一个新型的环化酶,可用于催化indosespene类化合物形成吲哚倍半萜的成环反应。本发明还提供了厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇在制备厦霉素A及其类似物中的应用。本发明还提供了厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇在制备氧厦霉素及其类似物中的应用。本发明还提供了厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇在制备化合物indosespene及其类似物中的应用。
·
本发明还提供了一种编码吲哚氧化酶/乙酰CoA脱氢酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第11512 12705位碱基序列所示。本发明还提供了所述的编码吲哚氧化酶/乙酰CoA脱氢酶的基因编码的吲哚氧化酶/乙酰CoA脱氢酶。总之，本发明所提供的包含厦霉素A和氧厦霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息，可以帮助人们理解厦霉素家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。本发明的海洋来源的链霉菌(Streptomyces sp. ) SCSIO 02999,该菌于2012年4月26保藏于中国典型培养物保藏中心(0^0)，地址中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCCN0 M 2012145。


图I是厦霉素A (化合物I)和氧厦霉素(化合物2)的化学结构式。图2是推测的厦霉素A和氧厦霉素的生物合成途径。图3是阳性克隆的相互重叠区示意图，包括了阳性克隆pCSG2402，pCSG2403，PCSG2404, pCSG2405, pCSG2407, pCSG2408，粗实线表示厦霉素A生物合成基因簇，箭头所示为引物XiaD-lF/XiaD-lR和XiaN_lF/XiaN_lR扩增片段的位置。图4是厦霉素A和氧厦霉素生物合成基因簇的组织结构示意图。图5是基因遗传改造链霉菌SCSIO 02999中厦霉素A和氧厦霉素生物合成基因簇得到的突变株在AM6发酵培养基中发酵的发酵产物的高压液相分析图(A)野生型菌株链霉菌SCSI002999经发酵获得了厦霉素A (I)和氧厦霉素(2) ; (B)敲除了 orf(-l)-乙醇脱氢酶基因，获得的突变株XM31发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；(C)敲除了xiaB-黄素还原酶基因，获得的突变株XM33发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；(D)敲除了 XiaC-IclR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变株XM34发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；(E)敲除了 xiaD-4-羟基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸还原酶，获得的突变株XM35发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；(F)敲除了 xiaE-1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因，获得的突变株XM36发酵仍然能产生了化合物厦霉素A和氧厦霉素，但产量有所降低；(G)敲除了 xiaF-4-羟基-3-甲基-2- 丁烯-I-基磷酸合酶基因，获得的突变株XM37发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素，但产量有所降低；(H)敲除了 xiaG-LuxR家族调控蛋白基因，获得的突变株XM38失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；(1)敲除了 xiaH-假定的膜蛋白基因，获得的突变株XM39失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；(J)敲除了 xiaj-柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶基因，获得的突变株XM40发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；(K)敲除了 xial-吲哚氧化酶/乙酰辅酶A脱氢酶基因，获得的突变株XM41失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；(L)敲除了XiaK-芳香环羟化酶基因，获得的突变株XM42发酵不能产生化合物氧厦霉素，厦霉素A的产量大幅降低，而且产生了新化合物3 (indosespene) ; (M)敲 除了 xiaL-铁氧化还原蛋白基因，获得的突变株XM43失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；(N)敲除了 XiaM-细胞色素P450氧化酶基因，获得的突变株XM44失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；(0)敲除了xiaN-聚异戊二烯二磷酸合酶基因，获得的突变株XM45发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；(P)敲除了 xiaO-单加氧酶基因，获得的突变株XM46失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；(Q)敲除了 xiaP-聚异戊二烯合成酶基因，获得的突变株XM47失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；(R)敲除了 XiaQ-LuxR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变株XM48失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；(S)敲除了 xiaR-LuxR家族的转录调控蛋白基因，获得的突变株XM49失去了产生厦霉素A和氧厦霉素的能力；(T)敲除了 orfl-锌金属蛋白酶基因，获得的突变株XM50发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素；(U)敲除了 orf2-通透酶基因，获得的突变株XM51发酵仍然能产生化合物厦霉素A和氧厦霉素。图6是分离到的合成途经中间产物3的化学结构式。图7 (A)是优化培养条件后链霉菌SCSIO 02999及其基因遗传改造突变株XM44发酵产物的高压液相分析图(i)链霉菌SCSIO 02999野生型菌株在AM6发酵培养基中发酵7天的产物检测；(ii)链霉菌SCSIO 02999野生型菌株在AM6-4发酵培养基中发酵7天的产物检测，厦霉素A和氧厦霉素的产量有所提高；(iii)突变株XM42在AM6发酵培养基中发酵7天的产物检测；(iv)突变株XM42在AM6-4发酵培养基中发酵7天的产物检测，能检测到产生了新化合物4和5 ; (V)突变株XM44在AM6发酵培养基中发酵7天的产物检测；(vi)突变株XM44在AM6-4发酵培养基中发酵7天的产物检测，能检测到产生了新化合物6和7 ； (B)是从XM42和XM44在AM6-4发酵培养基发酵的产物中分离到的化合物4_7的化学结构式。图8是部分突变株添加二甲基亚砜(DMS0)、厦霉素A或化合物3培养后的发酵产物的高压液相分析图(A)是突变株XM41添加厦霉素A或化合物3培养后的发酵产物的高压液相分析图(i)厦霉素A标准品；(ii)氧厦霉素标准品；(iii)化合物3标准品；(iv)突变株XM41添加DMSO培养后的发酵产物；(V)突变株XM41添加化合物3培养后的发酵产物，没有产生厦霉素A和氧厦霉素，也没有产生其他新的化合物；(vi)突变株XM41添加厦霉素A培养后的发酵产物，产生了氧厦霉素；(B)是突变株XM43添加厦霉素A或化合物3培养后的发酵广物的闻压液相分析图(i)厦霉素A标准品；(ii)氧厦霉素标准品；(iii)化合物3标准品；(iv)突变株XM43添加DMSO培养后的发酵产物；(v)突变株XM43添加化合物3培养后的发酵产物，产生了厦霉素A和氧厦霉素；(vi)突变株XM43添加厦霉素A培养后的发酵产物，产生了氧厦霉素；(C)是突变株XM44添加厦霉素A或化合物3培养后的发酵产物的高压液相分析图(i)厦霉素A标准品；(ii)氧厦霉素标准品；(iii)化合物3标准品；(iv)突变株XM44添加DMSO培养后的发酵产物；(v)突变株XM44添加化合物3培养后的发酵产物，产生了厦霉素A和氧厦霉素；(vi)突变株XM44添加厦霉素A培养后的发酵产物，产生了氧厦霉素；(D)是突变株XM46添加厦霉素A或化合物3培养后的发酵产物的闻压液相分析图(i)厦霉素A标准品；(ii)氧厦霉素标准品；(iii)化合物3标准品；(iv)突变株XM46添加DMSO培养后的发酵产物；(v)突变株XM43添加化合物3培养后的发酵产物，产生了厦霉素A，但没有产生氧厦霉素；(Vi)突变株XM46添加厦霉素A培养后的发酵产物，没有产生氧厦霉素；(E)是突变株XM47添加厦霉素A或化合物3培养后 的发酵产物的高压液相分析图(i)厦霉素A标准品；(ii)氧厦霉素标准品；(iii)化合物3标准品；(iv)突变株XM47添加DMSO培养后的发酵产物；(v)突变株XM47添加化合物3培养后的发酵产物，产生了厦霉素A和氧厦霉素；(vi)突变株XM47添加厦霉素A培养后的发酵产物，产生了氧厦霉素。图9是吲哚氧化酶XiaI的体内生物转化，(A)XiaI生物转化化合物3的高压液相分析图(i)厦霉素A标准品；(ii)化合物3标准品；(iii)携带pET28a质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在含有50 ii M卡那霉素，0. ImM IPTG和60 y M化合物3的LB培养基中培养4小时的HPLC检测结果；(iv)携带pCSG2604质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在含有50 y M卡那霉素，0. ImMIPTG和60 ii M化合物3的LB培养基中培养4小时的HPLC检测结果，化合物3已经部分转化为化合物8和厦霉素A ; (V)携带pCSG2604质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在含有50 u M卡那霉素，0. ImM IPTG和60 y M化合物3的LB培养基中培养24小时的HPLC检测结果，化合物3已经完全转化为厦霉素A，同时化合物8也消失了 ；“ ”表示大肠杆菌宿主发酵生成的物质；(B)反应中间产物8的化学结构式；(C) XiaI催化反应的示意图；(D) XiaI生物转化化合物6和7的高压液相分析图(i)携带pET28a质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在含有50 ii M卡那霉素，0. ImM IPTG和60 y M化合物6的LB培养基中培养24小时的HPLC检测结果；(ii)携带pCSG2604质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在含有50 y M卡那霉素，0. ImMIPTG和60 ii M化合物6的LB培养基中培养24小时的HPLC检测结果，化合物6已经部分转化为化合物9携带pET28a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50 y M卡那霉素，0. ImMIPTG和60 ii M化合物7的LB培养基中培养24小时的HPLC检测结果；(iv)携带pCSG2604质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在含有50 ii M卡那霉素，0. ImM IPTG和60 y M化合物7的LB培养基中培养24小时的HPLC检测结果，化合物7已经部分转化为化合物10。图10是吲哚氧化酶XiaI的体外生化鉴定，(A)纯化蛋白XiaI的蛋白电泳分析；(B)XiaI反应的高压液相分析图(i)厦霉素A标准品；(ii)化合物3标准品；(iii)XiaI的标准反应体系包括400 u M化合物3，ImM黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，2mM NADH, 5 u MXiaI，50mM Tris-HCl (pH 8. 0)，28°C反应4小时，化合物3部分反应生成化合物8和厦霉素A ;(iv)标准反应体系中的NADH换成NADPH，化合物3部分能反应生成厦霉素A，但是催化效率明显低于标准体系；(V)标准反应体系中的XiaI换成经过10分钟沸水浴处理的XiaI,化合物3不能反应生成厦霉素A，说明加热会导致XiaI失活；(vi)标准反应体系缺少FAD，化合物3部分不能反应生成厦霉素A ； (vii)标准反应体系缺少NADH，化合物3部分不能反应生成厦霉素A ; (viii)反应体系包括400 ii M化合物3，ImM黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，5uM XiaI,50mM Tris-HCl (pH 8.0) ; (ix)标准反应体系中的FAD换成FMN，化合物3部分反应生成化合物8和厦霉素A ; (X)标准反应体系中的FAD换成FMN，XiaI换成经过10分钟沸水浴处理的Xial，化合物3不能反应生成厦霉素A 表示酶反应中的杂质。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。I.链霉菌SCSIO 02999基因组序列扫描及厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇序列分析和功能分析 通过对链霉菌(Streptomyces sp. ) SCSIO 02999进行全基因组扫描和注释,在其中找到了 29kb的厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇，包含了 22个开放阅读框(openreading frames, ORFs)(表I )。根据生物信息学分析，其中xiaD、E、F、N和P五个基因可能参与xiamycineA的職类骨架的合成,xiaA、B、I、J、K、L、M和0八个基因编码氧化还原酶,xiaC、G、H、Q和R则是五个编码调控子和转运子的基因。厦霉素A的生物合成途径初步确定如下(图2) XiaD, XiaE和XiaF与非甲羟戊酸途径中的羟甲基丁烯焦磷酸还原酶(IspH)、1_脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)和4-羟基-3-甲基丁 -2-烯基磷酸合酶(IspG)具有很高的一致性，而编码非甲羟戊酸途径中的另外几个酶则可以在xia基因簇外的基因组序列中找到，据此推测XiaD、E和F以及一些在xia基因簇外的酶通过非甲羟戊酸途径提供IPP和 DMAPP, XiaN 催化 IPP 和 DMAPP 缩合形成法尼基焦憐酸(farnesyl-diphosphate, FPP),而XiaP则负责将FPP装载到吲哚环上，形成3-法尼基吲哚。随后，3-法尼基吲哚可能通过一个分子内的环化和随后水解触发的环化机制形成preindosespene。其中xiaA、B、L编码的XiaA、B、L蛋白可能组成Rieske [2Fe_2S]型非血红素铁氧化酶家族，与具有环氧酶功能的细胞色素P450氧化酶XiaM共同参与分子内环化过程，而柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶XiaJ催化水解并触发环化形成preindosespene。细胞色素P450氧化酶XiaM还能选择性催化氧化preindosespene的24位碳上的甲基变成羧基,生成中间产物indosespene (3)。口引哚氧化酶XiaI催化indosespene反应生成xiamycine A。氧厦霉素则可能是由XiaI和另外两个酶XiaK和XiaO共同催化indosespene产生。表I :厦霉素A和氧厦霉素生物合成基因簇的基因及其功能分析基因~~同源蛋白6推测功能
orf(-2)5470x3 (ACP19698, 74/88)FAD (黄素腺嘌呤二核If酸)依赖型氧化还原酶
orf(-l)351SACTE_6109 (AEN13888,72/81)乙醇脱氢酶
XiaA363S CLAY_0024 (EFG05100, 58/72)含有 Rieske2Fe-2S (铁硫蛋白)结构域加娬_
xiaB164Strvi_6224 (AEM85702,76/84)黄素还原酶
xiaC258Trd_0252 (ACM04610,35/49)IclR 家族的转录调控蛋 A
xiaD330Kfla—4244 (ADB33280，72/79)4-羟基-3-甲基-2-T烯S-傷磷酸还原酶
XiaE605Caci_6415 (ACU75269, 63/73)I-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸介_
xiaF383IspG(ZP_08876217, 90/95)4-P^S-3-丨f 基-2-j—烯基-焦磷酸合酶
xiaG240Micau_3829 (ADL47353,55/70)LuxR 家族调控蛋白
xiaH266OrflS (BAD07391,39/59)假定的膜蛋白
xial397Qrf5 (AAY54299,39/55)吲哚氧化_/乙酰 CoA 脱氢酶
XiaJ129Swit_5231 (ABQ71340, 37/53)柠檬烯-I，2-环氧化物水解酶
XiaK596RHAl_ro00538 (ABG92374,52/65)芳香环羟化酶
XiaL77SACE 2838 (CAM02117, 59/68)铁氧化还原蚩 A
XiaM389Mjls_0508 (ABN96320,47/61)细胞色素 P450 氧化藝
xiaN341HopB (BAC69362,52/63)聚异戊二烯二磷酸
xiaO718SSFG_00177 (EFE64923,52/64)单加氣酶
xiaP335SSNG—07282 (EFL20030, 44/59)聚异戊二烯合成
xiaQ992PlmR5 (AEW92815,41/50)LuxR 家族的转录调控蛋白
xiaR924PlmR4 (AAQ84140,33/44)LuxR 家族的转录调控蛋內
orfl145bcere00I9_23140 (EEL34460,35/47)锌金属蛋白酶
orp508SGM_0166 (EGG49826, 86/91)_假定的钠耦合通透酶_a氨基酸数目；b括号中包含了同源蛋白的GeneBank登录号，及与之对应的一致性/ 相似性(identity/similarity)。2.厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇的克隆、分析及边界的确定根据基因组序列注释和生物信息学分析，以参与厦霉素A骨架合成的羟甲基丁烯基焦磷酸还原酶基因xiaD和异戊二烯二磷酸合酶基因xiaN的序列设计PCR筛选引物，从链霉菌SCSIO 02999的基因组文库2400个克隆中筛选，获得了 8个阳性克隆，其中的4个用两对引物能够同时筛选获得。这些阳性克隆经酶切分析表明其中两个cosmid包含了整个厦霉素A和氧厦霉素生物合成基因簇，其他4个cosmid包含部分基因簇(图3)。生物信息学分析表明，orf (-2)基因编码FAD依赖的氧化还原酶，orf(-l)基因编码乙醇脱氢酶，据报道这两个酶均参与macrolactam的合成，与厦霉素A的生物合成无关。通过建立链霉菌SCSIO 02999的遗传操作体系，构建了 orf (-1)基因灭活的突变株XM31，该突变株经发酵仍旧能够生产厦霉素A和氧厦霉素，产量与野生型相当，从而确证了 orf(-l)不参与厦霉素的生物合成。由于未能获得与orf (-1)相邻的含有Rieske 2Fe_2S (铁硫蛋白)结构域的加氧酶基因XiaA的灭活突变株XM32，难以确定该基因是否参与厦霉素的生物合成，因此厦霉素生物合成基因簇的左边界还不是十分确定。灭活编码短链脱氢酶的基因orfl和编码钠耦合通透酶的基因orf2，获得突变株XM50和XM51，两突变株仍能生产厦霉素A，产量与野生型相当，排除了 orfl基因参与厦霉素A生物合成的可能性。同时，灭活在orfl基因上游的编码Lux家族转录调节因子的xiaQ和xiaR基因，获得的突变株XM48和XM49不能生产厦霉素A和氧厦霉素，说明xiaQ和xiaR可能是厦霉素A和氧厦霉素生物合成的负调控因子，与厦霉素A和氧厦霉素合成相关。这些结果表明orfl是厦霉素A和氧厦霉素生物合成基因簇的右边界(图4)。因此，厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇的边界的上游初步确定为xiaA,下游为xiaR (图4),该厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第2693 26792位的碱基序列所示。。3.厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇中各基因的功能分析在克隆、分析了完整的厦霉素和氧厦霉素的生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白可能的功能的基础上，本发明对厦霉素A和氧厦霉素的生物合成机制进行了探讨，采用PCR-targeting技术针对20个生物合成基因，进行了灭活突变(检测引物参见表2，灭活弓丨物参见表3 )，获得了 XM31，XM33-XM51等20个突变株。表2 :构建突变株所需的检测引物名称和序列
权利要求
1.一种厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I的第2693 26792位的碱基序列所示。
2.权利要求I所述的厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇在制备厦霉素A及其类似物中的应用。
3.权利要求I所述的厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇在制备氧厦霉素及其类似物中的应用。
4.权利要求I所述的厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇在制备化合物indosespene及其类似物中的应用。
5.一种编码吲哚氧化酶/乙酰CoA脱氢酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I的第11512 12705位碱基序列所示。
6.权利要求5所述的编码吲哚氧化酶/乙酰CoA脱氢酶的基因编码的吲哚氧化酶/乙酰CoA脱氢酶。
全文摘要
本发明公开了一种厦霉素A和氧厦霉素的生物合成基因簇及其应用。该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第2693~26792位的碱基序列所示，包含18个基因，具体为负责萜类骨架合成的基因，即xiaD、xiaE、xiaF、xiaN、xiaP共5个基因；氧化还原酶基因，即xiaA、xiaB、xiaI、xiaJ、xiaK、xiaL、xiaM、xiaO共8个基因；编码调控子和转运子的基因，即xiaC、xiaG、xiaH、xiaQ、xiaR共5个基因。本发明所提供的包含厦霉素A和和氧厦霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解厦霉素家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
文档编号C12N15/53GK102732534SQ20121014666
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者张偲, 张光涛, 张庆波, 张海波, 张长生, 朱义广, 李慧贤, 李苏梅, 田新朋, 鞠建华 申请人:中国科学院南海海洋研究所