专利名称：金丝桃素提纯方法
技术领域：
本发明涉及金丝桃素制备技术，尤其是指一种金丝桃素提纯方法。
背景技术：
金丝桃素在贯叶金丝桃全草中的含量只有万分之几，市场上贯叶金丝桃提取物中 金丝桃素含量也仅有0. 3%左右。目前，对金丝桃素的研究主要集中在其提取工艺上，而对 高纯度的金丝桃素提纯工艺研究较少。现有的高纯度金丝桃素的分离过程中主要利用大孔 树脂、聚酰胺、硅胶等常规分离介质来制备金丝桃素，这种方式不仅工艺繁杂、金丝桃素纯 度低、得率不高，而且生产过程中需使用大量具有较高毒性的有机溶剂而不够环保，并且易 造成对成品的污染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种金丝桃素提纯方法，以便从贯叶金丝桃 浸膏中分离纯化高纯度金丝桃素。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案一种金丝桃素提纯方法，包括如 下步骤
准备步骤将贯叶金丝桃浸膏粉碎，并加入乙醇溶液溶解后进行超声提取获得提取液， 然后在提取液中加入明胶溶液除鞣，制得贯叶金丝桃浸膏除鞣液；
PEK微球层析步骤将PEK微球与蒸馏水混悬，转入层析柱，待PEK微球沉降完全后， 以蒸馏水平衡柱床，取适量贯叶金丝桃浸膏除鞣液湿法上样于PEK微球层析柱顶部，再用 水-乙醇溶液体系进行梯度洗脱，并收集最后一次洗脱的洗脱液，浓缩制得金丝桃素粗品； PDCX微球层析步骤将PDCX微球与丙酮溶液混悬，转入层析柱，待PDCX微球沉降完全 后，以丙酮溶液平衡柱床，取以上制得的金丝桃素粗品以丙酮溶液充分溶解后取适量湿法 上样于PDCX微球柱顶部，再用丙酮溶液进行梯度洗脱，并收集最后一次洗脱的洗脱液，浓 缩并调整PH值至2 3，低温下静置12 士0.釙后离心分取沉淀，上清液再置于低温下静置 12士0. 5h，随后再离心得沉淀，合并沉淀得金丝桃素精品；
ODS层析步骤将反相硅胶填料与色谱纯甲醇混悬，转入层析柱，待反相硅胶微球沉降 完全后，以甲醇-磷酸氢二钠缓冲液平衡柱床，取以上制得的金丝桃素精品以甲醇充分溶 解后取适量上样于层析柱顶部，以甲醇-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，分步收集洗脱液，HPLC检 测后合并相同的成分，获得金丝桃素提纯物。进一步地，准备步骤中，用于与贯叶金丝桃浸膏的粉碎物溶解的乙醇溶液为体积 百分比浓度为60%的乙醇溶液，贯叶金丝桃浸膏与乙醇溶液的配比比例为每1克贯叶金丝 桃浸膏使用6 8mL60%的乙醇溶液，且溶解后超声提取的时间为30士2分钟。进一步地，准备步骤中，加入的明胶溶液为10%明胶溶液，加入量为超声提取液的 1/5 1/4。进一步地，在加入明胶溶液后再调整溶液中乙醇的体积浓度至75% 80%，避光静置12士0. 5h后，过滤浓缩后即制得贯叶金丝桃浸膏除鞣液。进一步地，PEK微球层析步骤中，PEK微球的粒径为35 45 μ m,层析柱径高比 1:10 3. 5。进一步地，PEK微球层析步骤中，梯度洗脱时所用的试剂依次分别为1 2. 5倍柱 体积的水、1 3倍柱体积的10%乙醇溶液、1. 5 6倍柱体积的30%乙醇溶液、1. 5 4倍 柱体积的40%乙醇溶液、4 8倍柱体积的60%乙醇溶液。进一步地，PDCX微球层析步骤中，PDCX微球的粒径为25 35 μ m。进一步地，PDCX微球层析步骤中，分别用于与PDCX微球混悬、平衡柱床以及溶解 金丝桃素粗品的丙酮溶液均为30%丙酮溶液。进一步地，PDCX微球层析步骤中，梯度洗脱所用的丙酮溶液依次分别为1 2倍 柱体积的30%丙酮溶液、1 1. 5倍柱体积的50%丙酮溶液、3 8倍柱体积的70%丙酮溶液。进一步地，PDCX微球层析步骤中，使用盐酸将浓缩液的PH值调至2 3 ；而在 ODS层析步骤中所使用的甲醇-磷酸氢二钠缓冲液中甲醇与磷酸氢二钠的体积比比值为 87. 5/12. 5，且甲醇-磷酸氢二钠缓冲液预先以磷酸将PH值调至6. 5。本发明的有益效果如下本发明利用纳米微球材料来分离纯化金丝桃素，其中， PEK微球具有机械强度高，化学稳定性好，可耐受较宽的PH和多种有机溶剂，对金丝桃素的 吸附量较大，解吸附率高，金丝桃素回收率达到90. 0%以上；而PDCX微球化学稳定性好，可 耐受较宽的PH和多种有机溶剂，具有较高的分离度，适用于金丝桃素的精纯。相对于诸如 硅胶、大孔树脂等传统的层析填料，纳米微球材料吸附量大，金丝桃素回收率高，最终产品 中金丝桃素含量可达90%以上；此外，本发明方法步骤简便、主要使用乙醇、丙酮等低毒性 有机溶剂，且用量少，填料可重复使用，具有经济、环保的优点。
图1是本发明金丝桃素提纯方法的流程示意图。
具体实施例方式如图1所示，本发明提供一种金丝桃素提纯方法，包括如下步骤
准备步骤将从市场上购买的贯叶金丝桃浸膏粉碎后，按1:6 8的比例加入60%( V/ V，体积百分比)的乙醇溶液超声提取30min后，加入提取液体积1/5 1/4的10%(V/V，体积 百分比)明胶溶液，调乙醇浓度达75% 80%，避光静置12 士0. 5h，过滤浓缩至原体积1/5 1/4制得贯叶金丝桃浸膏除鞣液，本步骤中的贯叶金丝桃浸膏可直接从市场上购买获得，本 发明实施方式中采用的是宁波神马公司生产的贯叶金丝桃浸膏，其金丝桃素3 0. 3%。PEK微球层析步骤PEK微球为甲基丙烯酸酯型聚合物微球，粒径为35 45 μ m, PEK微球与蒸馏水混悬，转入层析柱，该层析柱的径高比为1 10 3. 5，待PEK微球沉降完 全后，以1 2倍柱体积的蒸馏水平衡柱床，取贯叶金丝桃浸膏除鞣液1 1. 25倍层析柱 体积，湿法上样于PEK微球层析柱顶部，再使用水-乙醇溶液体系进行梯度洗脱，收集最后 一次洗脱的洗脱液，浓缩制得金丝桃素粗品，即富集的总金丝桃素溶液。PDCX微球层析步骤PDCX微球为苯乙烯型聚合物微球，粒径为25 35 μ m，将PDCX微球与丙酮溶液混悬，转入层析柱，待PDCX微球沉降完全后，以1 2倍柱体积的丙酮 溶液平衡柱床，取以上制得的金丝桃素粗品以丙酮溶液溶解后湿法上样于PDCX微球柱顶 部，上样体积为1/4 1/3倍柱体积，再使用丙酮溶液进行梯度洗脱，收集最后一次洗脱的 洗脱液，浓缩至原体积1/6 1/4，以盐酸调pH值至2 3，4°C静置12 士0. 5h，离心分取沉 淀，上清液再置于4°C静置12士0. 5h，离心得沉淀，合并沉淀制得金丝桃素精品。ODS层析步骤0DS即为反相硅胶填料，通常采用十八烷基硅烷键合硅胶聚合 物，将反相硅胶填料与色谱纯甲醇混悬，转入层析柱，待反相硅胶微球沉降完全后，以 87.5/12.5 (体积比)的甲醇-磷酸氢二钠缓冲液平衡柱床，该甲醇-磷酸氢二钠缓冲液预 先以磷酸将PH值调至6. 5，取以上制得的金丝桃素精品以甲醇溶液溶解后上样，上样体积 1/4 1/3柱体积，87. 5/12. 5的甲醇-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，分步收集洗脱液，经HPLC (即高效液相色谱法)检测后合并相同的成分，获得金丝桃素提纯物。上述PEK微球层析步骤中，洗脱所采用的试剂分别依次为1 2. 5倍柱体积的 水、1 3倍柱体积的10%乙醇、1. 5 6倍柱体积的30%乙醇、1. 5 4倍柱体积的40%乙 醇、4 8倍柱体积的60%乙醇。 而在PDCX微球层析步骤中，洗脱时采用的丙酮溶液分别为1 2倍柱体积的30% 丙酮、1 1. 5倍柱体积的50%丙酮、3 8倍柱体积的70%丙酮。以下通过几个实施例来详细说明本发明的具体实施过程。实施例1
步骤(1)称取IOOg贯叶金丝桃浸膏粉碎，以60%的乙醇600mL溶解后超声提取30min， 加入10%明胶溶液120mL，调乙醇浓度达80%，静置10h，浓缩过滤得贯叶金丝桃浸膏除鞣液 350mLo步骤(2) :PEK微球层析将PEK微球与蒸馏水混悬，重力沉降法装成规格为 01cmX IOcm层析柱，待PEK微球沉降完全后，以15mL蒸馏水平衡柱床，取(1)制得的贯叶金 丝桃除鞣液8mL，上样，分别以水，10%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、60%乙醇以流速1. 5mL/min 依次洗脱16mL、24mL、48mL、20mL、56mL，收集60%乙醇洗脱液，浓缩得金丝桃素粗品，HPLC测
得金丝桃素含量为3. m。步骤(3):PDCX微球层析将PDCX微球与30%丙酮溶液混悬，重力沉降法装成规格 01cmX IOcm层析柱，待PDCX微球沉降完全后，15mL30%丙酮溶液平衡柱床，取以上制得的金 丝桃素粗品30mg，2mL50%丙酮溶液溶解后湿法上样于PDCX微球柱顶部，以30%丙酮溶液、 50%丙酮溶液、70%丙酮溶液以流速1. 5mL/min依次洗脱16mL、12mL、24mL，收集70%丙酮溶 液洗脱液，浓缩，盐酸调PH2 3，4°C静置12士0. 5h，离心分取沉淀，上清液再置于4°C静置 12士0.证，离心分取沉淀，合并沉淀，低温冻干，制得金丝桃素精品。HPLC测得金丝桃素含量 为 33. 0%。步骤(4) =ODS层析0DS填料甲醇混悬，重力沉降法装成规格01cmX IOcm层析柱， 待ODS微球沉降完全后，将(3)所得样品以甲醇溶液溶解之后上样，87. 5/12. 5 (体积比)的 甲醇-磷酸氢二钠缓冲液溶液洗脱，1. 5mL/min流速，分部收集洗脱液，HPLC检测合并相同 部分，金丝桃素含量达91.6%。实施例2
步骤(1)称取IOOg贯叶金丝桃浸膏粉碎，以60%的乙醇溶液SOOmL溶解后超声提取30min，加入10%明胶溶液200mL，调乙醇浓度达80%，静置10h，浓缩过滤得贯叶金丝桃浸膏 除鞣液450mL。步骤(2) :PEK微球层析将PEK微球与蒸馏水混悬，重力沉降法装成规格为 01cmX IOcm层析柱，待PEK微球沉降完全后，15mL蒸馏水平衡柱床，取步骤(1)制得的贯叶 金丝桃除鞣液6mL，上样，分别以水，10%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、60%乙醇以流速1. 5mL/ min依次洗脱12mL、20mL、40mL、16mL、42mL，收集60%乙醇洗脱液，浓缩得金丝桃素粗品， HPLC测得金丝桃素含量为3. 1%。步骤(3):PDCX微球层析将PDCX微球以30%丙酮溶液混悬，重力沉降法装成规格 01cmX IOcm层析柱，待PDCX微球沉降完全后，15mL30%丙酮溶液平衡柱床，取以上制得的金 丝桃素粗品20mg，2mL50%丙酮溶液溶解后湿法上样于PDCX微球柱顶部，以30%丙酮溶液、 50%丙酮溶液、70%丙酮溶液以流速1. 5mL/min依次洗脱12mL、8mL、18mL，收集70%丙酮溶 液洗脱液，浓缩，盐酸调PH2 3，4°C静置12士0. 5h，离心分取沉淀，上清液再置于4°C静置 12士0.证，离心分取沉淀，合并沉淀，低温冻干，制得金丝桃素精品。HPLC测得金丝桃素含量 为 33. 0%。步骤(4) =ODS层析0DS填料甲醇混悬，重力沉降法装成规格01cmX IOcm层析柱， 待ODS微球沉降完全后，将步骤(3)所得样品以甲醇溶液溶解之后上样，以87. 5/12. 5 (体 积比)的甲醇-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，1.5mL/min流速，分部收集洗脱液，HPLC检测合并 相同部分，金丝桃素含量达91. 6%。 实施例3
步骤(1)称取IOOOg贯叶金丝桃浸膏粉碎，以60%的乙醇溶液6000mL溶解后超声提 取30min，加入10%明胶溶液1200mL，调乙醇浓度达75%，静置10h，过滤浓缩得贯叶金丝桃 浸膏除鞣液2500mL。步骤(2) :PEK微球层析将PEK微球与蒸馏水混悬，重力沉降法装成规格为 05cmX18cm层析柱，待PEK微球沉降完全后，以700mL蒸馏水平衡柱床，取步骤(1)制得的 贯叶金丝桃浸膏除鞣液350mL，上样，水，10%乙醇溶液、30%乙醇溶液、40%乙醇溶液、60%乙 醇溶液以流速10mL/min依次洗脱525mL、700mL、875mL、525mL、1400mL，取60%乙醇溶液洗 脱液，浓缩至无醇味后，浓盐酸调PH2 3，4°C静置12士0. 5h，离心分取沉淀，上清液再置于 4°C静置12士0.证，离心分取沉淀，合并两次沉淀，低温冻干，得金丝桃素粗品，HPLC测得金 丝桃素含量为3. 0%。步骤(3) =PDCX微球层析将PDCX微球与30%丙酮溶液混悬，重力沉降法装成规 格05cmX 18cm层析柱，待PDCX微球沉降完全后，以700mL的30%丙酮平衡柱床，取步骤(2) 制得的金丝桃素粗品1. 2g，80mL50%丙酮溶解后上样，30%丙酮、50%丙酮、70%丙酮以IOmL/ min流速依次洗脱350mL、350mL、2800mL，70%丙酮洗脱液浓缩至200mL，浓盐酸调pH2 3， 4°C静置12士0. 5h，离心分取沉淀，上清液再置于4°C静置12士0. 5h，离心分取沉淀，合并沉 淀，低温冻干，制得金丝桃素精品，HPLC测得金丝桃素含量为32. 6%。步骤(4):0DS层析0DS填料色谱纯甲醇混悬，重力沉降法装成规格01cmX IOcm层 析柱，待ODS微球沉降完全后，将步骤(3)所得样品以甲醇溶液溶解之后上样，以87. 5/12. 5 (体积比)的甲醇-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，1.5mL/min流速，分部收集洗脱液，HPLC检测合并相同部分，HPLC检测合并相同部分，金丝桃素含量达90. 3%。
权利要求
1.一种金丝桃素提纯方法，其特征在于，包括如下步骤准备步骤将贯叶金丝桃浸膏粉碎，并加入乙醇溶液溶解后进行超声提取获得提取液， 然后在提取液中加入明胶溶液除鞣，制得贯叶金丝桃浸膏除鞣液；PEK微球层析步骤将PEK微球与蒸馏水混悬，转入层析柱，待PEK微球沉降完全后， 以蒸馏水平衡柱床，取适量贯叶金丝桃浸膏除鞣液湿法上样于PEK微球层析柱顶部，再用 水-乙醇溶液体系进行梯度洗脱，并收集最后一次洗脱的洗脱液，浓缩制得金丝桃素粗品；PDCX微球层析步骤将PDCX微球与丙酮溶液混悬，转入层析柱，待PDCX微球沉降完全 后，以丙酮溶液平衡柱床，取以上制得的金丝桃素粗品以丙酮溶液充分溶解后取适量湿法 上样于PDCX微球柱顶部，再用丙酮溶液进行梯度洗脱，并收集最后一次洗脱的洗脱液，浓 缩并调整PH值至2 3，低温下静置12 士0.釙后离心分取沉淀，上清液再置于低温下静置 12士0. 5h，随后再离心得沉淀，合并沉淀得金丝桃素精品；ODS层析步骤将反相硅胶填料与色谱纯甲醇混悬，转入层析柱，待反相硅胶微球沉降 完全后，以甲醇-磷酸氢二钠缓冲液平衡柱床，取以上制得的金丝桃素精品以甲醇充分溶 解后取适量上样于层析柱顶部，以甲醇-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，分步收集洗脱液，HPLC检 测后合并相同的成分，获得金丝桃素提纯物。
2.如权利要求1所述的金丝桃素提纯方法，其特征在于准备步骤中，用于与贯叶金丝 桃浸膏的粉碎物溶解的乙醇溶液为体积百分比浓度为60%的乙醇溶液，贯叶金丝桃浸膏与 乙醇溶液的配比比例为每1克贯叶金丝桃浸膏使用6 8mL60%的乙醇溶液，且溶解后超 声提取的时间为30士2分钟。
3.如权利要求1所述的金丝桃素提纯方法，其特征在于准备步骤中，加入的明胶溶液 为10%明胶溶液，加入量为超声提取液的1/5 1/4。
4.如权利要求1或3所述的金丝桃素提纯方法，其特征在于在加入明胶溶液后再调 整溶液中乙醇的体积浓度至75% 80%，避光静置12士0.证后，过滤浓缩后即制得贯叶金丝 桃浸膏除鞣液。
5.如权利要求1所述的金丝桃素提纯方法，其特征在于PEK微球层析步骤中，PEK微 球的粒径为35 45 μ m，层析柱径高比1:10 3. 5。
6.如权利要求1或5所述的金丝桃素提纯方法，其特征在于PEK微球层析步骤中，梯 度洗脱时所用的试剂依次分别为1 2. 5倍柱体积的水、1 3倍柱体积的10%乙醇溶液、 1. 5 6倍柱体积的30%乙醇溶液、1. 5 4倍柱体积的40%乙醇溶液、4 8倍柱体积的 60%乙醇溶液。
7.如权利要求1所述的金丝桃素提纯方法，其特征在于PDCX微球层析步骤中，PDCX 微球的粒径为25 35 μ m。
8.如权利要求1所述的金丝桃素提纯方法，其特征在于PDCX微球层析步骤中，分别用 于与PDCX微球混悬、平衡柱床以及溶解金丝桃素粗品的丙酮溶液均为30%丙酮溶液。
9.如权利要求1所述的金丝桃素提纯方法，其特征在于PDCX微球层析步骤中，梯度洗 脱所用的丙酮溶液依次分别为1 2倍柱体积的30%丙酮溶液、1 1. 5倍柱体积的50% 丙酮溶液、3 8倍柱体积的70%丙酮溶液。
10.如权利要求1所述的金丝桃素提纯方法，其特征在于PDCX微球层析步骤中，使用 盐酸将浓缩液的PH值调至2 3 ；而在ODS层析步骤中所使用的甲醇-磷酸氢二钠缓冲液中甲醇与磷酸氢二钠的体积比比值为87. 5/12. 5，且甲醇-磷酸氢二钠缓冲液预先以磷酸 将PH值调至6. 5。
全文摘要
一种金丝桃素提纯方法，包括将贯叶金丝桃浸膏粉碎，与乙醇溶液溶解后超声提取，加明胶溶液除鞣得贯叶金丝桃浸膏除鞣液；将PEK微球与蒸馏水混悬，转入层析柱，取贯叶金丝桃浸膏除鞣液湿法上样，用水-乙醇溶液体系梯度洗脱，浓缩洗脱液得金丝桃素粗品；将PDCX微球与丙酮溶液混悬，转入层析柱，取金丝桃素粗品以丙酮溶液充分溶解后湿法上样，用丙酮溶液梯度洗脱，处理洗脱液得金丝桃素精品；将反相硅胶填料与色谱纯甲醇混悬，转入层析柱，取金丝桃素精品以甲醇充分溶解后上样，以甲醇-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，HPLC检测洗脱液后合并相同成分，得金丝桃素提纯物。本发明利用PEK微球、PDCX微球等纳米微球材料分离纯化金丝桃素，产品金丝桃素含量在90%以上。
文档编号C07C50/36GK102079696SQ20111000813
公开日2011年6月1日 申请日期2011年1月15日 优先权日2011年1月15日
发明者张俊松, 王晓利, 王金林 申请人:深圳职业技术学院