专利名称：植物抗性相关基因edos1的克隆及其在植物抗病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及到一种拟南芥基因EDOSl的克隆，功能鉴定和应用。包括该基因在调控植物对病原菌的抗性应答和调节乙烯诱导的叶片衰老中的应用，同时涉及该基因在调控mRNA核质运输中的应用，以及该基因在创建抗病转基因作物品种中的应用。
背景技术：
在自然界中，植物面对着各种各样的病原菌的侵袭。这些病原菌大致可以分为两类，一类是活体营养型，需要存活的植物细胞来完成生长周期；另一类是死体营养型，需要杀死植物细胞来获取营养，完成生命周期。在漫长的进化过程中，植物演化出有效的抗病反应。其中植物激素水杨酸和乙烯，茉莉酸发挥着重要的作用，水杨酸主要在对活体营养型病菌的抗性中起着重要作用；乙烯和茉莉酸主要在对死体营养型病菌的抗性中发挥着重要作用。白粉菌是自然界中广泛存在的一种真菌，可以侵染小麦、大麦、葡萄等重要农作物，在世界范围内造成农业生产的重要损失。在我们先前的研究中，我们报道了拟南芥edrl突变体的表型和EDRl基因的功能(Frye and Innes, 1998 ；Frye et al.，2001)。EDRl 基因编码一个fcif-like 蛋白激酶，EDRl蛋白具有激酶活性。edrl突变体表现出白粉菌诱导的细胞死亡表型和对白粉病菌的显著抗性。双突变分析实验显示edrl突变体的表型能够被pad4，sid2, nprl等突变体抑制，表明edrl的表型需要水杨酸信号途径的作用。同时，与野生型相比，edrl突变体表现出更明显的乙烯诱导的叶片衰老表型。但是，目前我们对于EDRl介导细胞死亡和植物抗病反应的分子机制依然知之甚少。可以看出，EDRl是创建抗病性增强的转基因作物和作物分子设计的优秀候选基因。研究EDRl调节植物抗病反应的分子机制，寻找EDRl信号通路的其他组分，具有重要的理论价值和广阔的应用前景。
发明内容
本发明涉及到拟南芥EDOSl基因的克隆及应用，尤其涉及到EDOSl基因在mRNA核质转运中的作用，同时也涉及到该基因在调控植物对病原菌的抗性和叶片衰老中的功能与应用。本发明通过突变体筛选和图位克隆的方法，对EDOSl基因进行了分离和功能鉴定，确立了 EDOSl基因在植物对白粉病的抗性和病原菌诱导的细胞死亡中的作用，发现了EDOSl基因在乙烯诱导的叶片衰老中的作用及其分子机制，同时，确立了 EDOSl基因影响mRNA核质运输的机制。本发明为理解植物mRNA核质运输的分子机制提供了重要依据，为研究mRNA核质运输如何影响植物的抗病反应和激素的信号转导提供了新的线索，为探索植物激素水杨酸和乙烯的交叉网络提供了新的节点。在农业生产上，本发明可以应用于增强植物的抗病反应和调控作物的成熟衰老时期等方面的转基因作物的创制。为了寻找EDRl信号通路上的其它基因，我们进行了 edrl抑制子和增强子突变体的筛选。我们得到了其中一个突变体edosl，通过图位克隆，我们得到了 EDOSl基因。通过对EDOSl的功能分析，我们发现EDOSl对植物抗病反应以及植物mRNA的核质运输有着重要的调控作用。另一方面，作为真核生物，植物的RNA是在核内合成，而RNA翻译成蛋白质是在细胞质中进行，RNA的核质运输对植物的生长发育和逆境反应起着重要的调控作用，少数的几个报道已经说明了影响mRNA核质运输的突变体可以调节植物对病原菌的抗性。当然，目前对植物mRNA运输的分子机制以及mRNA运输调控植物抗病反应的具体机理的研究依然非常有限。通过对EDOSl的研究，可以帮助我们了解EDRl的信号通路。同时，通过对EDOSl的研究，我们可以深入探索mRNA核质运输对植物抗病反应的影响。更为重要的是，EDOSl本身也是作物转基因改良和作物分子设计的合适靶基因。综上所述，对EDOSl基因的克隆和功能分析有着重要的理论和现实意义，而且EDOSl基因有着广阔的应用前景。1. 一个拟南芥基因EDOSl的基因序列，全长基因组DNA序列4302bp，⑶S全长1800bp。其 CDS 序列见 SEQ ID No. 1。2. EDOSl的蛋白序列，编码599个氨基酸，大小68. 3kD。其氨基酸序列见SEQ ID
No. 2。3. EDOSl突变之后，可以抑制edrl的抗病表型和白粉菌诱导的细胞死亡表型。4. EDOSl突变之后，可以增强edrl的乙烯诱导的叶片衰老表型。5. EDOSl突变之后，mRNA在细胞核内积累。6. EDOSl基因在高等植物中广泛存在并且高度保守，可以应用到基因工程技术领域，调控作物的抗病反应和成熟时期。具体内容如下1. 一种拟南芥白粉病抗性相关基因ED0S1，其为下列核苷酸序列之一1) SEQ ID No. 1的核苷酸序列；2)与SEQ ID No. 1的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2. 一种蛋白质，其由以上1的基因EDOSl编码。3.以上2的蛋白质，其为1)由SEQ ID No. 2的氨基酸序列所示的蛋白；或2)将(1)的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与(1)相同的功能的由(1)衍生的蛋白。4.以上1的EDOSl基因的突变基因edosl，其核苷酸序列与SEQ IDNo. 1的核苷酸序列的区别在于在^79bp到^86bp的位置出现了 7bp的缺失。5.以上1的基因EDOSl或以上2或3的蛋白质用于调控植物抗白粉病抗性、白粉菌诱导产生的细胞程序性死亡、乙烯熟化或mRNA核质运输的应用，其中所述植物包括拟南芥、大麦、葡萄、小麦，优选为拟南芥突变体edrl。
6.以上5的应用，其中抑制植物白粉病抗性、抑制白粉菌诱导产生的细胞程序性死亡、促进乙烯熟化或抑制mRNA核质运输的应用通过在所述植物中抑制以上1的基因EDOSl或以上2或3的蛋白质的表达来实现，其中抑制以上1的基因EDOSl或以上2或3的蛋白质的表达可以通过使以上1的基因EDOSl发生缺失功能突变来实现；且增强植物抗白粉病抗性、促进白粉菌诱导产生的细胞程序性死亡、抑制乙烯熟化或促进mRNA核质运输的应用通过在所述植物中过量或超量表达以上1的基因EDOSl或以上2或3的蛋白质来实现。7.以上4的突变基因edosl用于抑制植物抗白粉病抗性、抑制白粉菌诱导产生的细胞程序性死亡、促进乙烯熟化和抑制mRNA核质运输的应用，其中所述植物包括拟南芥、大麦、葡萄、小麦，优选为拟南芥突变体edrl。
图1.生长5周的野生型Col-0，edrl, edosl/edrl接种白粉病菌8天后的表型(上)，和 Trypan Blue Staining 的结果(下)。图2.生长5周的野生型，edrl, edosl/edrl在IOOppm乙烯气体处理3天后的表型(上)，和叶绿素含量测量的结果(下)。图3.通过图位克隆的方法克隆EDOSl基因的略图、edosl突变的位置与基因结构和互补结果。图4.突变体的表型与Col-O表现的比较。图5.拟南芥、水稻、玉米、苜蓿等植物中EDOSl蛋白序列的比对分析。图 6. Col-O，edosl 和 edosl/edrl 中，mRNA 在细胞核内积累。
具体实施例方式实施例一 edosl能够抑制edrl突变体的抗病表型(1)材料和方法把 edrl 突变体(Frye and Innes, 1998 ；Frye et al.，2001)种子用 0. 3 %EMS (Ethyl methanesulfonate，购自 SIGMA-ALDRICH，货号 M-0880)浸泡 16 小时，用 ddH20洗12次。把种子播于土壤中，22°C，16小时光照生长7周。按20棵植株作为一个Pool收种子，共获得240个Pool。每个Pool播种200棵，22°C，9小时光照温室生长5周，寻找不出现edrl表型的个体，命名为edos系列突变体并将其中一株命名为edosl/edrl。Sf^M Col-O ( ^ g Arabidopsis Biological Resource Center), edrl, edosl/edrl突变体在土壤中，22°C，9小时光照温室生长5周后，接种白粉病菌(Golovinomycescichoracearum) (Frye and Innes, 1998) 0该白粉病菌用拟南芥的一个对该白粉病菌易感的突变体pad4 (Jirage et al. , 1999)保存。接菌时将生长有大量白粉孢子的pad4的植株轻轻地刮在待接白粉的植物叶片上，接菌后，将接完菌的植物先用保鲜膜覆盖M小时，后移去保鲜膜，继续生长7天，进行抗病表型鉴定。对典型的叶片照相，并且对有代表性的叶片进行Trypan Blue Staining，标记白粉菌的菌丝生长和叶片的细胞死亡斑点。(2)结果与分析接种白粉菌8天后，野生型植株上生长出大量的白粉菌(图1左上)；edrl突变体植株上只有非常微弱的白粉菌生长，并且有可见的细胞坏死的斑点(图1中上)；edosl/edrl突变体的表型类似于野生型，即有明显的白粉菌的生长，而没有明显的细胞死亡的斑点(图1右上)。Trypan Blue Staining的结果更清楚地显示了野生型，edrl，edosl/edrl对白粉菌的反应。野生型植株的叶片上可以看到大量的菌丝(图1左下)；edrl植株上几乎没有可见的菌丝，却有清晰地深蓝色的坏死斑点(图1中下)；edosl/edrl的表型与野生型类似(图1右下)。实施例二 edosl可以增强edrl的乙烯诱导的叶片衰老表型1.在乙烯诱导下，edosl/edrl突变体表现出更严重地叶片黄化表型(1)材料与方法拟南芥植株Col-0，edrl和edosl/edrl在土壤中，22°C，9小时光照的温室生长5周后，转移到一个透明地封闭玻璃容器中，再注入乙烯气体，浓度为lOOpprn。72小时后，观察表型。同时，分别称取0.2克叶片，用纯乙醇萃取其中的叶绿素，再测量其中的叶绿素含量。同时，检测未处理的植株作为对照。(2)结果与分析未用乙烯处理的植株都没有明显地黄化表型(图2a，b，c)。乙烯处理后，野生型Col-O的叶片出现了黄化(图2d) ；edrl突变体表现出更严重地黄化表型(图加)；edosl/edrl突变体显示出极其严重的黄化衰老表型(图2f)。从叶绿素含量测定的实验中也可以看出，没有处理时，所有植株的叶绿素含量类似；而在乙烯气体处理后，与野生型Col-O相比，edrl的叶绿素含量明显降低；而与edrl相比，edosl/edrl的叶绿素含量急剧减少(图2下图)。实施例三ED0S1基因的图位克隆及互补(1)材料及方法为克隆ED0S1基因，我们把edosl/edrl突变体与Lansberg生态型植株(购自Arabidopsis Biological Resource Center)杂交，获得的 Fl 代自交产生 F2 代。从 F2 代植株中选择与edosl/edrl突变体表型相似的80个单株，用粗定位标记(http //signal,salk. edu/genome/SSLP_info/SSLPsordered. html)进行基因型鉴定(Konieczny andAusubel，1993)。粗定位的结果表明ED0S1定位在5号染色体的前端。随后，我们设计了精细定位的标记，对4000棵左右的F2植株进行基因型鉴定，把ED0S1定位到五号染色体前端的BAC，F17I14中的一个301Λ左右的区域(图3a)。对该区域内所有基因进行测序，通过测序，我们在基因AT5G09860中发现了一段7bp的缺失(图北)。为了验证edosl的表型是有这个突变位点造成的，我们从野生型Col_0的基因组DNA中扩增到一个5. 7kb的基因AT5G09860片段，包括800bp的启动子区、4. 3kb的基因组DNA，200bp 的相邻序列。扩增弓I物是 LeftPrimer 5' -cagagcaaatcgaattacgtaacca-3‘；Right Primer 5' -ggagatcggtggtgtttatgga-3，。退火温度 56°C，延伸 6min，35 个循环。用 Kpn I 禾Π Hind III 酶切后，连接到 pCAMBIA1300 载体(GenBank 序列号 AF234296，(Heoet al.，1999))上。使用热激法把质粒转化到农杆菌GV3101 (Hajdukiewicz et al.，1994 ；Sambrook et al.，1989)中，鉴定正确后转化edosl/edrl植株，得到TO代的种子。用含120mg/L潮霉素的MS培养基(4.33g MS盐/L，1 %蔗糖，0. 8%琼脂，pH = 5. 8)筛选TO代的种子，得到Tl转基因植株。用乙烯气体处理，进行表型鉴定，鉴定转基因植株是否能否互补edosl/edrl的表型。(2)结果及分析通过对该基因的cDNA进行测序后，我们发现缺失位点的剪接发生了变化，突变体的cDNA出现了一段Ilbp的插入(图3c)。对突变后的cDNA进行编码蛋白序列的预测，当插入Ilbp的片段后，编码序列在突变位点出现了两个连续的终止密码子，导致了突变体中，突变的EDOSl编码一个截短的蛋白(图3d)。EDOSl基因是一个具有多个外显子的基因(图:3e)。生长 4 周后，Tl 代互补植株(AT5G09860 in edosl/edrl)的表型与 edosl/edrl不同，而与edrl非常相似(图3f)，说明基因AT5G09860的转入可以互补edosl/edrl的表型，以及edosl/edrl的表型正是由于AT5G09860中第十四个外显子末端的7bp缺失，即在2879bp到^86bp位置的7bp缺失造成的。因此ED0S1基因即为基因AT5G09860。实施例四edosl单突变的表型edosl单突变植株的表型(1)材料和方法为获得edosl单突变体，我们用edosl/edrl与Col-O杂交，在F2代植株中寻找不带有edrl背景的植株。检测edrl背景用的是Derived CleavedAmplifiedPolymorphic Sequences (dCAPS)法(Neff et al.，2002)o 弓| 物为 LP 5，-AGGCTGAAAGGACAGATTCTTCATG-3，；RP :5，-TGTTGAGGAATTGTTCTCCAACTGA-3，。酶切所用的酶是HaeIII (购自大连TAKARA公司)。野生型Col-O和edosl突变体播种于土壤中。22°C，9小时光照生长5周后，注射接种丁香假单孢杆菌(Pseudomonas syringae) (Chisholm et al. ,2006 ；Weigel andGlazebrook, 2002)，浓度为OD6tltl = 5 X 10_4。3小时和72小时后，用打孔器取下叶片，用ddH20洗净，磨碎叶片样本，按梯度稀释，分别涂平板，3天后计数。野生型Col-O，edrl, edosl/edrl和edosl突变体播种于土壤中。22°C，9小时光照生长5周后，放到一个封闭地透明容器中，注入IOOppm乙烯气体。72小时后，取0. 2g叶片，用纯乙醇萃取叶绿素，再测量叶绿素含量。同时，检测未处理的植株作为对照。(2)结果与分析从图4的上图可以看出，注射接种丁香假单孢杆菌3小时后的叶片样本中，edosl和Col-O的叶片中病菌的生长没有明显差异。在72小时后，edosl突变体中，病菌的生长略高于Col-0。从图4的下图中可以看出，在乙烯气体处理72小时后，与Col-O和edrl相比，edosl单突变体和edosl/edrl双突变体的叶绿素含量都显著降低。而在未处理地对照中，Col-0, edrl, edosl/edrl, edosl的叶绿素含量非常接近。以上结果说明，与野生型Col-O相比，edosl单突变体对病原菌的抗性有小幅度地降低；同时，edosl单突变体对乙烯诱导的叶片衰老敏感度大幅提高。实施例五ED0S1的氨基酸序列在高等植物中高度保守ED0S1编码的蛋白序列高度保守。与水稻(Oryza sativa，NP_001048715)，杨树(Populus trichocarpa, XP_002299188),蓖麻(Ricinuscommunis, XP_002529986),葡萄(Vitis vinifera，XP_002^3874)，玉米(Zeamays, NP_001159168)中的同源基因的氨基酸序列比对，可以发现其序列的相似性达到80%以上。这个结果暗示了 ED0S1有着非常重要的功能，也表明在这些有经济价值的植物中，EDOSl非常可能也与植物抗病和衰老密切相关，也说明了把EDOSl基因应用到植物基因工程中的巨大可能性。如图5所示。实施例六在edosl/edrl突变体中，mRNA在细胞核内积累(1)材料与方法拟南芥植株Col-0，edrl和edosl/edrl在MS培养基上生长2周后，选取长度小于5mm 的叶片用 50% 固定液(120Mm NaCl, 7mM Na2HP04, 3mMNaH2P04, 2. 7mM KC1,0. 1% Tween20,80mM EGTA,5% formaldehyde, and 10% DMSO)固定。固定完成后用 50% 乙醇，50%甘露醇交替洗脱3次。把叶片加入到杂交缓冲液(购自Sigma-Aldrich，货号H-7033)中，加入5’-荧光素标记的oligo dT，杂交过夜。再用超纯水洗脱后，用激光共聚焦显微镜观察。激发光的波长为488nm。(2)结果与分析可以看出，野生型Col-O与edrl的细胞中都只有很微弱的细胞核内荧光信号(图6a，b)。而在edosl/edrl突变体中，有明显地细胞核内信号，表明mRNA在细胞核内积累(图6c)。这个结果也说明ED0S1在mRNA核质运输中起着重要的调控作用。参考文献Chisholm, S. , Coaker , G. , Day, B. , and Staskawi cz , B. 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Weigel, D.，and Glazebrook, J. (2002). Arabidopsis :a laboratorymanual (ColdSpring Harbor Laboratory Pr).
权利要求
1.一种拟南芥白粉病抗性相关基因ED0S1，其为下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No. 1的核苷酸序列；2)与SEQID No. 1的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2.一种蛋白质，其由权利要求1的基因EDOSl编码。
3.权利要求2的蛋白质，其为1)由SEQID No. 2的氨基酸序列所示的蛋白；或2)将(1)的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与(1)相同的功能的由(1)衍生的蛋白。
4.权利要求1的EDOSl基因的突变基因edosl，其核苷酸序列与SEQIDNo. 1的核苷酸序列的区别在于在^79bp到^86bp的位置出现了 7bp的缺失。
5.权利要求1的基因EDOSl或权利要求2或3的蛋白质用于调控植物抗白粉病抗性、白粉菌诱导产生的细胞程序性死亡、乙烯熟化或mRNA核质运输的应用，其中所述植物包括拟南芥、大麦、葡萄、小麦，优选为拟南芥突变体edrl。
6.权利要求5的应用，其中抑制植物抗白粉病抗性、抑制白粉菌诱导产生的细胞程序性死亡、促进乙烯熟化或抑制mRNA核质运输的应用通过在所述植物中抑制权利要求1的基因EDOSl或权利要求2或3的蛋白质的表达来实现，其中抑制权利要求1的基因EDOSl或权利要求2或3的蛋白质的表达可以通过使权利要求1的基因EDOSl发生缺失功能突变来实现；且增强植物抗白粉病抗性、促进白粉菌诱导产生的细胞程序性死亡、抑制乙烯熟化或促进mRNA核质运输的应用通过在所述植物中过量或超量表达权利要求1的基因EDOSl或权利要求2或3的蛋白质来实现。
7.权利要求4的突变基因edosl用于抑制植物白粉病抗性、抑制白粉菌诱导产生的细胞程序性死亡、促进乙烯熟化和抑制mRNA核质运输的应用，其中所述植物包括拟南芥、大麦、葡萄、小麦，优选为拟南芥突变体edrl。
全文摘要
本发明涉及一种拟南芥白粉病抗性相关基因EDOS1的分离克隆、功能验证及应用。本发明还涉及所述EDOS1基因的突变基因、所述EDOS1基因编码的蛋白及其应用。
文档编号C07K14/415GK102586267SQ20111000726
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者唐定中, 潘怀荣 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所