一种适用于双向电泳实验的蚯蚓总蛋白的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种适用于双向电泳实验的蚯蚓总蛋白的提取方法，步骤为：取新鲜的或-80℃保存的蚯蚓用液氮研磨成蚯蚓粉末，加入蛋白提取液中，涡旋混匀，沉淀；离心，弃上清，加入二硫苏糖醇的丙酮溶液洗涤沉淀，洗涤后离心；用二硫苏糖醇溶液洗涤沉淀，离心，挥干液体；取沉淀溶解于蛋白裂解液中，涡旋混匀，冰浴静置；加入二硫苏糖醇，涡旋混匀，冰上静置；冰浴下，超声，离心，取上清-80℃分装保存；本发明的方法在操作步骤少，耗时短，简单易行的基础上，弥补了简单沉淀不能够有效去除蚯蚓样品当中的脂类、多糖和酚类等杂质的不足。此方法处理得到的双向电泳谱图中，蛋白点能够分布在一个宽泛的等电点和分子量范围内。
【专利说明】—种适用于双向电泳实验的蚯蚓总蛋白的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种适用于双向电泳实验的蚯蚓总蛋白的提取方法。
【背景技术】
[0002]蛋白样品的制备在整个蛋白质组学研究当中占据非常重要的地位，也是决定实验成败的关键因素，样品质量的好坏，直接决定了下游实验的结果。理想的蛋白样品制备方法应当是以最大限度的溶解全部蛋白质，尽量采用最少的操作步骤，尽量避免蛋白质的丢失、降解和改变，尽量降低杂质对蛋白质的污染，并具有较好的重复性。
[0003]对于蚯蚓总蛋白的提取，难度在于蚯蚓总蛋白是用整条个体进行提取，因此其体内的脂类、多糖和酚类等代谢产物或次生代谢产物，以及多种的氧化酶和蛋白酶，都会在一定程度上影响到总蛋白提取的纯度和质量。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种提取率高的适用于双向电泳实验的蚯蚓总蛋白的提取方法。
[0005]本发明的技术方案概述如下:
[0006]一种适用于双向电泳实验的蚯蚓总蛋白的提取方法，包括如下步骤:
[0007]I)取新鲜或_80°C保存的蚯蚓在预冷的研钵中用液氮研磨成蚯蚓粉末；
[0008]2)取Ig蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，涡旋2_6分钟混匀，于_20°C沉淀6_16小时；离心，弃上清，加入10-30ml质量浓度为0.3% 二硫苏糖醇的丙酮溶液洗涤沉淀，洗涤后于4°C，离心30分钟，再重复洗涤、离心操作2次；
[0009]3)用质量浓度为0.3%的二硫苏糖醇溶液洗涤沉淀，12000Xg的离心条件下，离心30分钟，弃上清，挥干沉淀中残余的液体，所述二硫苏糖醇溶液的溶剂为体积浓度为70%-90%的丙酮水溶液；
[0010]4)取0.1-0.3g步骤(3)获得的沉淀溶解于Iml蛋白裂解液中，涡旋混匀，冰浴静置5分钟；加入二硫苏糖醇使其终浓度为40-100mM，涡旋混匀，冰上静置10分钟；
[0011]5)冰浴下，以250-350W功率，2s/6s超声25_35个循环，13500 X g离心40分钟，取上清-80°C分装保存；
[0012]所述蛋白提取液用下述方法制成:取10_30g三氯乙酸和0.3g 二硫苏糖醇加丙酮至IOOml溶解；
[0013]所述蛋白裂解液用下述方法制成:取4.2g尿素、1.52g硫脲和0.2g3_[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用去离子水定容至10ml。
[0014]步骤(2)优选为:取Ig蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，涡旋4分钟混匀，于_20°C沉淀10小时；离心，弃上清，加入25ml质量浓度为0.3% 二硫苏糖醇的丙酮溶液洗涤沉淀，洗涤后于4°C，离心30分钟，再重复洗涤、离心操作I次。
[0015]优选的蛋白提取液用下述方法制成:取20g三氯乙酸和0.3g二硫苏糖醇加丙酮至IOOml溶解。
[0016]步骤(3)优选为:用质量浓度为0.3%的二硫苏糖醇溶液洗涤沉淀，12000Xg的离心条件下，离心30分钟，所述二硫苏糖醇溶液的溶剂为体积浓度为80%的丙酮水溶液；挥干液体。
[0017]步骤(4)优选为:取0.1-0.3g步骤(3)获得的沉淀溶解于Iml蛋白裂解液中，涡旋混匀，冰浴静置5分钟；加入二硫苏糖醇使其终浓度为65mM，涡旋混匀，冰上静置10分钟。
[0018]步骤(5)优选为:冰浴下，以300W功率，2s/6s超声30个循环，13500Xg离心40分钟，取上清-80 0C分装保存。
[0019]优点:
[0020]本发明的方法在操作步骤少，耗时短，简单易行的基础上，弥补了单一溶剂沉淀不能够有效地去除蚯蚓样品当中的脂类、多糖和酚类等杂质的不足。此方法处理得到的双向电泳谱图中，蛋白点能够分布在一个宽泛的等电点和分子量范围内。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1为实施例1提取的蚯蚓总蛋白的电泳图。
[0022]图2为实施例2提取的蚯蚓总蛋白的电泳图。
[0023]图3为实施例3提取的蚯蚓总蛋白的电泳图。
[0024]图4为对比例I提取的蚯蚓总蛋白的电泳图。
【具体实施方式】
[0025]以下案例便于更好地理解本发明，实施案例中的实验方法，如无特殊说明均为常规操作。下属实施案例中所用的试剂材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施案例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0026]尿素:美国Sigma公司分装，货号:U0631。硫脲:美国Sigma公司分装，货号:T7578。3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐:购自美国Sigma公司，货号:C9426。二硫苏糖醇，购自美国Sigma公司，货号:D9163。三氯乙酸,购自美国Sigma公司，货号:T9159。Bio-Lyte载体两性电解质，购自美国Bio-Rad公司，货号:163-1113。试验所用赤子爱胜(Eisenia fetida)蚯蚓，购自天津贾立明蚯蚓养殖有限公司。
[0027]实施例1
[0028]一、一种适用于双向电泳实验的蚯蚓总蛋白的提取方法，包括如下步骤:
[0029](I) 3次平行试验，取新鲜具有成熟环带的健康的赤子爱胜蚯蚓(每条蚯蚓重量300-600mg)在预冷的研钵中用液氮研磨成粉末；
[0030](2)取Ig蚯蝴粉末加入20ml蛋白提取液中，(蛋白提取液制备:取20g三氯乙酸和
0.3g 二硫苏糖醇加丙酮至IOOml溶解)，涡旋4分钟混匀，于_20°C沉淀10小时；12000Xg离心30min，弃上清，加入20ml质量浓度为0.3%二硫苏糖醇的丙酮溶液洗涤沉淀，洗涤后于40C，离心30分钟，再重复洗涤、离心操作2次；
[0031](3)用质量浓度为0.3%的二硫苏糖醇溶液洗涤沉淀，12000Xg的离心条件下，离心30分钟，弃上清，挥干沉淀中残余的液体，所述二硫苏糖醇溶液的溶剂为体积浓度为80%的丙酮水溶液；[0032](4)取0.1g步骤(3)获得的沉淀溶解于Iml蛋白裂解液中，涡旋混匀，冰浴静置5分钟；加入二硫苏糖醇使其终浓度为65mM，涡旋混匀，冰上静置10分钟；
[0033](5)冰浴下，以300W功率，2s/6s超声30个循环，13500Xg离心40分钟，取上清-80°C分装保存。
[0034]蛋白裂解液用下述方法制成:取4.2g尿素、1.52g硫脲和0.2g3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用去离子水定容至10ml。
[0035]二、提取效果鉴定
[0036]1、蛋白浓度测定
[0037]使用经典的Bradford法，即考马斯亮蓝G-250定量法对上述制备的上清液中蛋白质的浓度进行测定。测得蛋白浓度为9.23mg/ml。
[0038]2、等电聚焦电泳
[0039](I)取出-20°C存放的IPG胶条(购自美国Bio-Rad公司)，于室温放置lOmin。
[0040](2)将实施例1步骤一制备的上清液，加入0.3g的二硫苏糖醇和2.5yL的Bio-1yte,以及I μ L的溴酚蓝，配制成蛋白含量为Img的体积为300 μ L的上样液。
[0041](3)沿聚焦 盘边缘线性连续加入上样液，之后用镊子除去IPG胶条上的保护层。
[0042](4)将IPG胶条胶面向下缓慢覆盖在上样液上方，避免产生气泡。
[0043](5) 30min后，在胶条上覆盖2_3mL矿物油。
[0044](6)对好正负极，盖上盖子，按照表1设置等电聚焦程序并进行等电聚焦电泳。
[0045]表117cm胶条等电聚焦程序设置
[0046]
【权利要求】
1.一种适用于双向电泳实验的蚯蚓总蛋白的提取方法，其特征是包括如下步骤: 1)取新鲜或-80°C保存的蚯蚓在预冷的研钵中用液氮研磨成蚯蚓粉末； 2)取Ig蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，涡旋2-6分钟混匀，于_20°C沉淀6_16小时；离心，弃上清，加入10-30ml质量浓度为0.3% 二硫苏糖醇的丙酮溶液洗涤沉淀，洗涤后于4°C，离心30分钟，再重复洗涤、离心操作2次； 3)用质量浓度为0.3%的二硫苏糖醇溶液洗涤沉淀，12000 X g的离心条件下，离心30分钟，弃上清，挥干沉淀中残余的液体，所述二硫苏糖醇溶液的溶剂为体积浓度为70%-90%的丙酮水溶液； 4)取0.1-0.3g步骤(3)获得的沉淀溶解于Iml蛋白裂解液中，涡旋混匀，冰浴静置5分钟；加入二硫苏糖醇使其终浓度为40-100mM，涡旋混匀，冰上静置10分钟； 5)冰浴下，以250-350W功率，2s/6s超声25-35个循环，13500Xg离心40分钟，取上清-80°C分装保存； 所述蛋白提取液用下述方法制成:取10_30g三氯乙酸和0.3g 二硫苏糖醇加丙酮至IOOml溶解； 所述蛋白裂解液用下述方法制成:取4.2g尿素、1.52g硫脲和0.2g3-[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用去离子水定容至10ml。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤(2)为:取Ig蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，涡旋4分钟混匀，于_20°C沉淀10小时；离心，弃上清，加入20ml质量浓度为0.3% 二硫苏糖醇的丙酮溶液洗涤沉淀，洗涤后于4°C，离心30分钟，再重复洗涤、离心操作I次。
3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于所述蛋白提取液用下述方法制成:取20g三氯乙酸和0.3g 二硫苏糖醇加丙酮至IOOml溶解。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤(3)为:用质量浓度为0.3%的二硫苏糖醇溶液洗涤沉淀，12000 Xg的离心条件下，离心30分钟，所述二硫苏糖醇溶液的溶剂为体积浓度为80%的丙酮水溶液；挥干液体。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤(4)为:取0.1g步骤(3)获得的沉淀溶解于Iml蛋白裂解液中，涡旋混匀，冰浴静置5分钟；加入二硫苏糖醇使其终浓度为65mM，涡旋混匀，冰上静置10分钟。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤(5)为:冰浴下，以300W功率，2s/6s超声30个循环，13500 Xg离心40分钟，取上清_80°C分装保存。
【文档编号】G01N1/34GK103728171SQ201310730874
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】赵化冰, 郭锦, 杨震, 佟巍, 胡骁, 张丽, 高宏生, 王毅铮, 张国辉, 周启星 申请人:中国人民武装警察部队后勤学院