一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法与流程

本发明涉及基因工程
技术领域：
，具体地，涉及一种利用crispr/cas9在哺乳动物细胞中实现大片段dna定点整合的方法。
背景技术：
：哺乳动物细胞基因组中进行大片段外源基因的定点整合，通常采用的是双交换同源重组的方法，该技术的实施步骤为通过构建包含目的基因两侧的两个同源臂的打靶供体，利用两个同源臂与目的基因进行双交换同源重组，从而将目的基因替换成两个同源臂之间的外源dna片段来实现的。但是该技术存在如下不足：双交换同源重组的效率往往较低，一般为10-6；采用该技术实现定点整合的外源dna片段相对较小，一般为2kb以下。具体原因可能是因为两个同源臂的物理距离越大越不利于在目的基因两侧同时进行同源重组交换的发生导致。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种在哺乳动物细胞中实现大片段dna定点整合的方法。本发明能实现约6kb大片段在哺乳动物细胞中的定点整合。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：一种利用crispr/cas9在哺乳动物细胞中实现大片段dna定点定向整合的方法，包括如下步骤：(1)靶向ccr5基因的crispr/cas9打靶系统的构建：打靶系统由cas9/sgrna表达载体和打靶供体组成，所述打靶供体包括启动子、荧光标记基因、中间含有grna靶序列的与目的基因的同源序列的设计；(2)crispr/cas9打靶系统共转染哺乳动物细胞，转染后分选稳定表达荧光的细胞，进行单细胞克隆培养；(3)单细胞克隆pcr鉴定检测定点整合效率，获得高效定点定向整合的哺乳动物细胞。优选地，所述靶向ccr5基因的crispr/cas9靶向位点序列如seqidno：1所示。更优选地，所述靶向ccr5基因的grna正、负链序列分别如seqidno：2所示和seqidno：3所示。作为优选实施方式，一种利用crispr/cas9在哺乳动物细胞中实现大片段dna定点定向整合的方法，包括如下步骤：(1)构建靶向ccr5基因的打靶系统，打靶系统包括seqidno：4所示的px330-ccr5质粒和seqidno：6所示的pegfp-ccr5-hr打靶供体；(2)将px330-ccr5质粒、pegfp-ccr5-hr打靶供体共转染hek293t细胞，转染后利用流式分选稳定表达egfp荧光的细胞，进行单细胞克隆培养；(3)单细胞克隆进行pcr鉴定检测定点整合效率，获得定点定向整合的hek293t细胞。其中，px330-ccr5质粒即为cas9/sgrna表达载体。优选地，所述转染时，按照每孔hek293t细胞150ngpx330-ccr5质粒、100ngccr5-egfp-donor质粒(pegfp-ccr5-hr)、1μllipofectamine3000、1μlp3000tm和50μlopti-mem培养基配方添加进行转染。优选地，当hek293t细胞的汇合度至90％左右时，转染效率高。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明首次采用单交换同源重组的原理将大片段外源dna定点整合进哺乳动物细胞的基因组中，相较于传统的双交换同源重组策略，单交换可以较为高效的将大片段载体定点插入基因组。本发明通过构建靶向ccr5基因的打靶供体，通过crispr/cas9介导的一个打靶供体的定点定向整合，实现了1个6kb以上大片段dna在哺乳动物细胞中的定点定向整合。附图说明图1为px330载体的结构示意图。图2为pegfp-n1质粒结构示意图。图3为pegfp-ccr5-hr质粒结构示意图。图4为grna位点设计以及打靶效率检测；(a)grna在ccr5基因上的位置示意图；(b)野生型和突变型的dna序列以及各突变型的发生频率。图5为单交换介导单种打靶供体定点整合至hek293t细胞ccr5基因；(a)通过单交换或者非同源末端连接介导的单个打靶供体正向定点插入示意图；(b)通过非同源末端连接介导的单个打靶供体反向定点插入示意图；(c)pcr检测crispr/cas9介导的单个打靶供体的定点插入方式均为正向插入，而非反向插入；(d)野生型和突变型的dna序列以及各突变型的发生频率。图6为crispr/cas9介导单交换整合效率鉴定；(a)单细胞克隆荧光图；(b)单细胞克隆pcr检测crispr/cas9介导单个打靶供体整合效率。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例11、ccr5基因靶位点选择：根据ccr5基因序列以及grna基本设计原则，并借助软件分析(http://crispr.mit.edu/)，设计靶向人ccr5基因的grna，具体序列见表1。表1.靶向ccr5基因的grna序列信息名称序列(5’to3’)crispr/cas9靶向位点catcctgataaactgcaaa2、hek293t细胞培养与转染：hek293t细胞培养使用10％胎牛血清的dmem高糖培养基，细胞以约1×105个/ml的密度接种于24孔细胞培养板中，待用。待细胞汇合度至90％左右时可用于转染，转染时按照每孔细胞150ngpx330-ccr5质粒、100ngccr5-egfp-donor质粒(pegfp-ccr5-hr)、1μllipofectamine3000、1μlp3000tm和50μlopti-mem培养基配方添加转染，同时设置单转ccr5-egfp-donor质粒处理组和空白对照组。其中，所述px330-ccr5质粒、ccr5-egfp-donor质粒的构建方法如下。px330-ccr5质粒的构建步骤：合成ccr5-grna的正负序列，见下表2。表2为ccr5-grna的正负序列primer名称序列(5'to3')ccr5-sgrnafcaccgcatcctgataaactgcaaaccr5-sgrnaraaactttgcagtttatcaggatgc通过bbs1酶切位点克隆进px330载体(见图1)，获得px330-ccr5质粒(序列如seqidno：4所示)。ccr5-egfp-donor质粒(pegfp-ccr5-hr)的构建：合成长度为1640bp如seqidno：5所示的dna片段，通过asei酶切位点克隆进pegfp-n1载体(见图2)，获得pegfp-ccr5-hr质粒。pegfp-ccr5-hr质粒的序列seqidno：6所示，结构图见图3。3、细胞分选：转染后3天，将部分贴壁的hek293t细胞用胰酶消化，1600rpm离心5min，去除上清，添加pbs重悬细胞，经50μm尼龙膜过滤到流式管中，流式细胞分选仪分选出荧光阳性细胞，接收至1.5ml离心管中，以备后续打靶效率鉴定。转染后20天，将荧光阳性细胞分选至1.5ml离心管和96孔培养皿，分别进行后续定点整合鉴定以及单细胞克隆培养整合效率检测。4、测序分析：pcr扩增包含grna识别位点的ccr5基因片段，将目的片段克隆至t载，转化后挑选若干个单克隆菌落，进行测序分析。5、结果：(1)crispr/cas9打靶效率鉴定：本技术设计了一条针对人ccr5基因的grna(图4.a)，并且通过t-a克隆确定该crispr/cas9系统的打靶效率，结果表明挑选的10个单克隆菌落中，5个ccr5-sgrna位点发生突变，打靶效率约为50％左右(图4.b)。(2)检测单个打靶供体通过单交换机制实现定点整合的情况：我们首先设计了与ccr5基因组有同源序列且带有荧光标记基因的打靶供体，该同源序列分为左同源臂(lha)和右同源臂(rha)，在两段同源臂衔接处设计了grna的打靶序列位点，即crispr/cas9可在基因组该位置及所构载体上同时产生双链断裂缺口(dsb)。根据单交换原理，打靶供体可被完整插入基因组序列中，打靶供体的插入分为正向插入(图5.a)和反向插入(图5.b)，正向插入才能确保grna同靶序列完整。具体操作为：将crispr/cas9与带有egfp标记基因的打靶供体转染hek293t细胞，通过观察转染后不同时间段的荧光变化，结合流式分析数据，我们发现在转染后20天左右，荧光率维持在一个比较稳定的状态，表明该阶段绿色荧光细胞为打靶供体稳定整合细胞。流式分选稳定荧光表达的细胞后，提取基因组进行pcr鉴定，验证该打靶供体是否定点稳定整合进目的基因。我们分别在发生定点整合后的序列5端和3端设计了一对pcr引物，5端pcr扩增引物上游位于ccr5基因组上，下游位于所构打靶供体上，跨越左右同源臂，3端pcr扩增引物上游位于所构打靶供体上，下游位于ccr5基因组上，跨越左右同源臂，结果表明同时转染crispr/cas9与打靶供体的基因组能够扩增出目的片段，表明发生了单交换，也就是打靶供体的定点整合，同时整合插入的类型为正向插入而非反向插入，而空白对照组与只转染打靶供体的基因组均不能扩增出该目的条带(图5.c)。进一步t-a克隆测序分析，结果表明crispr/cas9介导单交换定点整合后，其打靶位点多存在一定程度的破坏，可能会阻碍进一步的多个打靶供体的整合(图5.d)。(3)针对crispr/cas9介导的单个打靶供体的整合，我们进一步通过单细胞克隆培养确定其整合效率。将流式分选后的egfp阳性细胞分选至96孔细胞培养皿进行单细胞克隆培养，培养至7天左右，可观察到明显的带荧光的单细胞克隆细胞群(图6.a)。培养至20天左右，可提取相应单细胞克隆基因组进行pcr鉴定，pcr扩增结果表明，crispr/cas9介导单个打靶供体的整合效率为10％左右(图6.b)。sequencelisting<110>中山大学<120>一种利用crispr/cas9在哺乳动物细胞中实现大片段dna定点整合的方法<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>靶向ccr5基因的crispr/cas9靶向位点<400>1catcctgataaactgcaaa19<210>2<211>24<212>dna<213>ccr5-sgrnaf<400>2caccgcatcctgataaactgcaaa24<210>3<211>24<212>dna<213>ccr5-sgrnar<400>3aaactttgcagtttatcaggatgc24<210>4<211>8507<212>dna<213>px330-ccr5质粒<400>4gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagag60ataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtaga120aagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcat180atgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaagga240cgaaacacccatcctgataaactgcaaagttttagagctagaaatagcaagttaaaataa300ggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttagagc360tagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttttagcgcgtgcgccaattctgcaga420caaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccg480cccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgt540caatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatg600ccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgc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