专利名称：成骨细胞扩增生物反应器系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的系统，具体是一种成骨细胞扩增生物反应器系统。
背景技术：
骨组织工程用于骨缺损等的修复重建，较传统的方法有显著的优点(1)不受供体来源的限制；(2)避免了异体组织移植中免疫排斥反应；(3)人工生物材料的形状、大小可根据不同组织和实际需要而设计和塑形，不受供体形状的限制；其最终目的在于提供一种来源广泛、应用简便、疗效确定的理想的生物活性骨组织。成骨细胞是形成组织工程化骨组织的基本要素之一，成骨细胞体外扩增培养是组织工程学在骨缺损研究中的一个重要方面。自20世纪60年代，Van Wezel等尝试采用微载体法悬浮培养动物贴壁细胞获得成功以后，利用微载体在生物反应器中扩增动植物细胞就成为最常用、有效的方法。Freed等人在搅拌生物反应器中培养软骨细胞，Katinger等首次应用气升式生物反应器进行动物细胞的悬浮培养，此外还有中空纤维管反应器、流化床反应器、固定床反应器、堆积床反应器等，但是这些反应器在培养的过程中目的细胞将不可避免地受到较大的剪切力影响，同时其营养物质传递过程和模拟人体体内环境等方面都不尽如人意。
经对现有技术文献的检索发现，Gregory N.Bancroft等人在《TissueEngineering》2003，9(3)549-554上发表的“Design of a Flow PerfusionBioreactor System for Bone Tissue-Engineering Applications”(设计一种流动灌注式生物反应器系统用于骨组织工程，《组织工程》)一文中，提出了体外扩增成骨细胞的灌注生物反应器系统，该系统主要由储液罐、蠕动泵、支架(scaffold)、灌注室和培养箱构成，当成骨细胞接种到支架上并贴壁后，开始由蠕动泵从储液罐中不断泵入培养基到灌注室中，使细胞在支架上扩增。该装置不能灵活调节灌注的方式(循环或单向)，不利于节约培养基，无法以最少量的培养基供给获得最多的细胞量。此外，此装置采用的是培养基从上往下的灌注法，而非采用逆向方式，不利于培养基的充分混合均匀，也不易在灌注最初充分排空气泡，而且此装置还不易于培养基取样。总而言之，该系统在设计上存在局限性，装置设计不经济，培养基流入方式设计欠合理，且无法在培养细胞的同时随时取出培养基分析其成分，预测细胞的生长状态。此系统对于扩增成骨细胞来说并不简便、高效和易行。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种简易、高效的成骨细胞扩增生物反应器系统，使其既能采用循环灌注方式，也能采用单向灌注方式，有利于培养基的充分利用；采用的培养基逆向流入方式使培养基混合更为均匀，且不易产生气泡；同时便捷的取样设计使对细胞生长状态的监控更为简易。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括细胞培养箱、储液罐、第一微孔滤膜过滤器、蠕动泵、第一四通管、密封盖、灌注室、支架、第二四通管、第三四通管、第一止流夹、第二止流夹、第三止流夹、废液罐、第二微孔滤膜过滤器，连接方式为储液罐通过硅胶管与第一四通管相连，蠕动泵在连接储液罐与第一四通管的硅胶管中间，灌注室通过硅胶管与第一四通管和第二四通管相连，密封盖盖在灌注室之上，支架置于灌注室中，储液罐通过硅胶管与第三四通管相连，第一止流夹在连接储液罐与第三四通管的硅胶管上，第三四通管通过硅胶管与废液罐相连，第三止流夹在连接第三四通管与废液罐的硅胶管上，第三四通管还连有一段硅胶管，此硅胶管上设有第二止流夹，储液罐与第一微孔滤膜过滤器通过硅胶管相连，废液罐与第二微孔滤膜过滤器通过硅胶管相连，以上部件均置于细胞培养箱中。
所述的储液罐顶上设有通气口、入液口、出液口。
所述的储液罐，其出液口通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第一四通管相连，其入液口通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第三四通管相连。
所述的储液罐，其通气口与第一微孔滤膜过滤器通过硅胶管相连。
所述的废液罐顶上设有通气口和入液口。
所述的废液罐，其入液口通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第三四通管相连。
所述的废液罐，其通气口与第二微孔滤膜过滤器通过硅胶管相连。
所述的第一微孔滤膜过滤器和第二微孔滤膜过滤器，为0.2μm微孔滤膜过滤器。
所述的灌注室，其入口和出口分别通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第一四通管和第二四通管相连。
第一微孔滤膜过滤器和第二微孔滤膜过滤器在确保储液罐和废液罐内气体压力保持恒定的同时不会带来外源污染；对CO2和O2高通透性的硅胶管协同第一微孔滤膜过滤器、第二微孔滤膜过滤器使得培养基能与外界进行充分的气体交换，确保培养基中各气体成分的比例不会波动太大，给细胞提供一个适宜的5％CO2和95％空气的生长环境；第四三通管连接有硅胶管，使我们能在需要的时候随时取出培养基进行分析；第四三通管分别与储液罐的入液口和废液罐的入液口相连，在培养基能维持细胞生长的情况下采用循环灌注方式，要全部换液时则采用单向灌注方式，并更换储液罐就能实现；培养基流入灌注室中时采用逆向方式，这是一种更温和的流入方式，且有利于营养成分的扩散，并能防止气泡的生成。
本发明工作时，在无菌环境下把接种有成骨细胞的支架放置入灌注室，拧紧密封盖，关闭第二止流夹和第三止流夹，开启第一止流夹，然后开启蠕动泵以适宜的、极缓慢的速度将储液罐中的培养基从灌注室的入口泵入灌注室，从灌注室的出口流出后经对CO2和O2高通透性的硅胶管返回储液罐；定期检测培养基成分时，可暂时关闭第一止流夹和第三止流夹，开启第二止流夹，收集流出的培养基，进行生化分析；当发现培养基成分不适合细胞生长时，可关闭第一止流夹和第二止流夹，开启第三止流夹，使培养基全部流入废液罐中，同时快速更换载有新鲜培养基的储液罐，当旧培养基排完后关闭第二止流夹和第三止流夹，开启第一止流夹，重新进行循环式灌注，直至细胞扩增完毕。
与现有技术相比，本发明的有益效果是为成骨细胞的贴壁生长提供了一种与体内环境相似的三维生长环境，使其能稳定高效的扩增，此装置简单且易于构件。此装置采用对CO2和O2高通透性的硅胶管使得培养基中气体能与细胞培养箱中的气体进行实时交换，保持恒定的气体环境。此装置中培养基流入灌注室时采用逆向方式，这是一种更温和的流入方式，且有利于营养成分的扩散，并防止了气泡的生成。使用多个四通管，使整个反应器中管路的构件更简便易行，能随时取样，随时改变培养基的灌注方式，以适应细胞培养的需要。这些设计都为成骨细胞的扩增提供了最为有利的条件。
图1为本发明结构示意图具体实施方式
如图1所示，本发明包括细胞培养箱1、储液罐2、第一微孔滤膜过滤器3、蠕动泵7、第一四通管8、密封盖9、灌注室12、支架13、第二四通管14、第三四通管15、第一止流夹16、第二止流夹17、第三止流夹18、废液罐19、第二微孔滤膜过滤器22。
储液罐2通过硅胶管与第一四通管8相连，蠕动泵7在连接储液罐2与第一四通管8的硅胶管中间，灌注室12通过硅胶管与第一四通管8和第二四通管14相连，密封盖9盖在灌注室12之上，支架13置于灌注室12中，储液罐2通过硅胶管与第三四通管15相连，第一止流夹16在连接储液罐2与第三四通管15的硅胶管上，第三四通管15通过硅胶管与废液罐19相连，第三止流夹18在连接第三四通管15与废液罐19的硅胶管上，第三四通管15还连有一段硅胶管，此硅胶管上设有第二止流夹17，储液罐2与第一微孔滤膜过滤器3通过硅胶管相连，废液罐19与第二微孔滤膜过滤器22通过硅胶管相连，以上部件均置于细胞培养箱1中。
所述的储液罐2顶上设有通气口4、入液口6、出液口5。
所述的储液罐2，其出液口5通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第一四通管8相连，其入液口6通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第三四通管15相连。
所述的储液罐2，其通气口4与第一微孔滤膜过滤器3通过硅胶管相连。
所述的废液罐19顶上设有通气口21和入液口20。
所述的废液罐19，其入液口20通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第三四通管15相连。
所述的废液罐19，其通气口21与第二微孔滤膜过滤器22通过硅胶管相连。
所述的第一微孔滤膜过滤器3和第二微孔滤膜过滤器22，为0.2μm微孔滤膜过滤器。
所述的灌注室12，其入口10和出口11分别通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第一四通管8和第二四通管14相连。
本发明固定安装好后，在无菌环境下把接种有成骨细胞的支架13放置入灌注室12，拧紧密封盖9，关闭第二止流夹17和第三止流夹18，开启第一止流夹16，然后开启蠕动泵7以适宜的、极缓慢的速度将储液罐2中的培养基从灌注室12的入口10泵入灌注室12，从灌注室12的出口11流出后经对CO2和O2高通透性的硅胶管返回储液罐2；定期检测培养基成分时，可暂时关闭第一止流夹16和第三止流夹18，开启第二止流夹17，收集流出的培养基，进行生化分析；当发现培养基成分不适合细胞生长时，可关闭第一止流夹16和第二止流夹17，开启第三止流夹18，使培养基全部流入废液罐19中，同时快速更换载有新鲜培养基的储液罐2，当旧培养基排完后关闭第二止流夹17和第三止流夹18，开启第一止流夹16，重新进行循环式灌注，直至细胞扩增完毕。
权利要求
1.一种成骨细胞扩增生物反应器系统，包括细胞培养箱(1)、储液罐(2)、第一微孔滤膜过滤器(3)、蠕动泵(7)、密封盖(9)、灌注室(12)、支架(13)和第二微孔滤膜过滤器(22)，其特征在于，还包括第一四通管(8)、第二四通管(14)、第三四通管(15)、第一止流夹(16)、第二止流夹(17)、第三止流夹(18)和废液罐(19)，储液罐(2)通过硅胶管与第一四通管(8)相连，蠕动泵(7)在连接储液罐(2)与第一四通管(8)的硅胶管中间，灌注室(12)通过硅胶管与第一四通管(8)和第二四通管(14)相连，密封盖(9)盖在灌注室(12)之上，支架(13)置于灌注室(12)中，储液罐(2)通过硅胶管与第三四通管(15)相连，第一止流夹(16)在连接储液罐(2)与第三四通管(15)的硅胶管上，第三四通管(15)通过硅胶管与废液罐(19)相连，第三止流夹(18)在连接第三四通管(15)与废液罐(19)的硅胶管上，第三四通管(15)还连有一段硅胶管，此硅胶管上设有第二止流夹(17)，储液罐(2)与第一微孔滤膜过滤器(3)通过硅胶管相连，废液罐(19)与第二微孔滤膜过滤器(22)通过硅胶管相连，以上部件均置于细胞培养箱(1)中。
2.根据权利要求1所述的成骨细胞扩增生物反应器系统，其特征是，所述的储液罐(2)顶上设有通气口(4)、入液口(6)、出液口(5)。
3.根据权利要求1或者2所述的成骨细胞扩增生物反应器系统，其特征是，所述的储液罐(2)，其出液口(5)通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第一四通管(8)相连，其入液口(6)通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第三四通管(15)相连。
4.根据权利要求1或者2所述的成骨细胞扩增生物反应器系统，其特征是，所述的储液罐(2)，其通气口(4)与第一微孔滤膜过滤器(3)通过硅胶管相连。
5.根据权利要求1所述的成骨细胞扩增生物反应器系统，其特征是，所述的废液罐(19)顶上设有通气口(21)和入液口(20)。
6.根据权利要求1或者5所述的成骨细胞扩增生物反应器系统，其特征是，所述的废液罐(19)，其入液口(20)通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第三四通管(15)相连。
7.根据权利要求1或者5所述的成骨细胞扩增生物反应器系统，其特征是，所述的废液罐(19)，其通气口(21)与第二微孔滤膜过滤器(22)通过硅胶管相连。
8.根据权利要求1所述的成骨细胞扩增生物反应器系统，其特征是，所述的第一微孔滤膜过滤器(3)和第二微孔滤膜过滤器(22)，为0.2μm微孔滤膜过滤器。
9.根据权利要求1所述的成骨细胞扩增生物反应器系统，其特征是，所述的灌注室(12)，其入口(10)和出口(11)分别通过对CO2和O2高通透性的硅胶管与第一四通管(8)和第二四通管(14)相连。
全文摘要
一种生物工程技术领域的成骨细胞扩增生物反应器系统，储液罐通过硅胶管与第一四通管相连，蠕动泵在连接储液罐与第一四通管的硅胶管中间，灌注室通过硅胶管与第一四通管和第二四通管相连，密封盖盖在灌注室之上，支架置于灌注室中，储液罐通过硅胶管与第三四通管相连，第一止流夹在连接储液罐与第三四通管的硅胶管上，第三四通管通过硅胶管与废液罐相连，第三止流夹在连接第三四通管与废液罐的硅胶管上，第三四通管还连有一段硅胶管，此硅胶管上设有第二止流夹，储液罐与第一微孔滤膜过滤器通过硅胶管相连，废液罐与第二微孔滤膜过滤器通过硅胶管相连，以上部件均置于细胞培养箱中。本发明简便易行，能随时取样，随时改变培养基的灌注方式。
文档编号C12M3/00GK1743450SQ20051002965
公开日2006年3月8日 申请日期2005年9月15日 优先权日2005年9月15日
发明者董良, 齐瀚实, 陈彦田, 沈阳, 孙海英 申请人:上海交通大学