专利名称：一种放线链霉菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域，具体涉及一种新的放线链霉菌及其应用。
背景技术：
由于我国境内的地理环境、气候条件千差万别，微生物资源相当地丰富。人们通过在各种不同纬度、海拔以及气候的地域寻找新的微生物菌种。一般地，通过菌株的形态特征、培养特征以及生理生化特征等对微生物菌种进行分类鉴别，同时还常常采用检测微生物菌种的16srDNA的序列来明确该菌种的分类地位。
通过对在全国各地采集得来的微生物菌种进行培养，在得到的代谢产物中寻找各种活性成分，并进而研究开发成各种药物(包括医药、农药、兽药等)。这种技术正在被广泛应用，如用作医用抗生素的青霉素、链霉素等，在农用、兽用方面有防治水稻纹枯病的井冈霉素、防治多种螨虫和夜蛾的阿维菌素等。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种放线链霉菌SPRI-1218。
本发明的又一个目的在于提供所述放线链霉菌的应用。
本发明的放线链霉菌SPRI-1218属链霉菌属Streptomyces caviscabies，已于2005年5月16日提交中国普通微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.1369。
本发明的放线链霉菌SPRI-1218是从我国湖南省张家界地区的土壤中分离而得的，该菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征及16SrDNA的序列和菌种分类结果如下1、菌株SPRI-1218在大多数培养基上生长良好，在高氏培养基上，菌落呈圆形，念珠状生长；基内菌丝体无横隔，不断裂，气生菌丝体分支，呈绒状，生长丰盛。孢子丝短而直，微波曲，孢子数10个以内，孢子呈短圆柱型。
2、菌株SPRI-1218的生理生化特性和碳源利用情况为明胶培养基中贴壁，环状黄褐色生长，液化良好，淀粉水解完全，H2S产生阳性，脱脂牛奶中胨化；酪素不水解、不能利用纤维；能利用的碳源为D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、蔗糖、D-果糖；不能利用L-肌醇、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、棉子糖。
3、菌株SPRI-1218细胞壁含有LL-DAP和甘氨酸，胞壁I型；全细胞糖水解含有核糖，为C型。
4、本发明所述的菌株SPRI-1218的16srDNA序列如SEQ ID NO1所示。
从形态培养特征来看，Streptomyces.flavogrisus与菌株SPRI-1218最为接近，从系统序列同源性来看有较高的相似性，但两者仍存在明显的差异，主要表现在系统发育学特性，生长特征及碳源利用等方面(表1，表2)。前者属于金色类群，而SPRI-1218从形态培养特征方面看，应属于黄色类群。因此结合形态、生理生化特征及16s rDNA分析，该菌株为Streptomyces caviscabies的一个亚种(Streptomyces caviscabies sub.mengdongnesisnSPRI-1218)。
表1、菌株SPRI-1218同S.flavogrisus的形态比较
表2、菌株SPRI-1218与S.flavogrisus的生理生化比较
本发明所述的放线链霉菌分培养方法既可为深层液体培养，也可为固体培养。为了有利于工业性的培养，宜将上述生产菌接种到培养基上，并进行通气搅拌。
对培养基中的营养源并无特殊的规定，可使培养基中含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其他营养源。其中碳源可为淀粉、糊精、葡萄糖、甘油、蔗糖、甘露醇等，氮源可为肉胨、黄豆饼粉、花生粉、酵母、肉膏、米糠、玉米浆、麦皮、铵盐、尿素、硝酸盐以及其他有机或无机含氮化合物。其他营养源可适当添加一些无机盐类，例如食盐、磷酸盐及钾、钙、锰、铁等金属盐。必要时可添加一些动、植、矿物油等作为消泡剂。
对温度、PH、时间等培养条件并无严格的限制，以适于产生菌的生产为准，并以选择化合物产量最高的条件为好。例如，培养基的PH范围可为6-8，以接近中性为好；培养温度在20-35℃，通气量以通气比1∶0.3到1比4之间(通气比指每分钟通过培养液的空气体积与培养液体积之比)。这些培养基的组份、PH、培养温度、通气条件等均应根据实际情况进行适当的调整，以获得最好的效果。
本发明所述的放线链霉菌经过发酵培养，得到的培养物可用于防治各种作物病害，主要针对因病原真菌引起的植物病害。具体来说，可防治灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜类炭疽病(Colletotrichum lagenarium)、水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)。
图1为放线链霉菌SPRI-1218 Streptomyces caviscabies CGMCC No.1369的菌株生长形态的扫描电镜照片。
具体实施例方式
下面通过具体实施例，进一步说明本发明。
本发明的放线链霉菌SPRI-1218已于2005年5月16日提交中国普通微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.1369。
以下实施例所涉及的原材料皆可通过市售得到，且涉及到的浓度均为重量浓度。
实施例1、放线链霉菌SPRI-1218的培养将放线链霉菌SPRI-1218 Streptomyces caviscabies CGMCC No.1369接种至高氏培养基平板上，于28℃培养箱中培养2周，取出观察菌体的生长形态，以电子显微镜扫描，扫描照片如图1所示。
由图1可见，在高氏培养基上，本发明的放线链霉菌SPRI-1218的菌落呈圆形，念珠状生长；基内菌丝体无横隔，不断裂，气生菌丝体分支，呈绒状，生长丰盛。孢子丝短而直，微波曲，孢子数10个以内，孢子呈短圆柱型。
实施例2、放线链霉菌SPRI-1218的发酵以葡萄糖2％、淀粉1％、黄豆饼粉2％、氯化钠0.2％、牛肉膏0.1％、磷酸氢二钾0.05％的比例制成培养基，PH调节到7.2，消毒灭菌。将放线链霉菌1218 Streptomyces caviscabiesCGMCC No.1369的菌种接种于该培养基中，在28℃±2℃下培养36-40小时。
以此培养物为种子，以5-20％的比例接种于以葡萄糖2％、淀粉1％、黄豆饼粉2.5％、氯化钠0.2％、牛肉膏0.1％、磷酸氢二钾0.05％组成的发酵培养液中，28℃±2℃通气搅拌培养90-96小时。
实施例3、放线链霉菌SPRI-1218的应用在实施例2所培养得到的培养物中，取适量发酵液用水稀释2-4倍，均匀喷洒在四张真叶期黄瓜苗上，直到叶片上形成水层，并且有多余的液体下滴为止。待药液干后分别在四张黄瓜叶片中央接种灰霉病病菌、瓜白粉病菌、瓜类炭疽病菌和稻瘟病菌，在20℃下保湿72小时，同时以四组清水作空白对照。检查发病情况，结果如表3。
表3、放线链霉菌SPRI-1218的发酵液对植物病害试验结果
实施例4、放线链霉菌SPRI-1218的应用在实施例2所培养得到的培养物中，取菌丝体用80％的丙酮浸泡4-5小时，过滤后取上清液，蒸馏脱去溶剂丙酮，用水稀释2-4倍后均匀喷洒在四张真叶期黄瓜苗上，直到叶片上形成水层，并且有多余的液体下滴为止。待药液干后分别在四张黄瓜叶片中央接种灰霉病病菌、瓜白粉病菌、瓜类炭疽病菌和稻瘟病菌，在20℃下保湿72小时，同时以四组清水作空白对照。检查发病情况，结果如表4。
表4、放线链霉菌SPRI-1218的菌丝体提取物对植物病害试验结果
根据实施例3和实施例4的结果表明，本发明所述的放线链霉菌SPRI-1218Streptomyces caviscabies CGMCC No.1369经过发酵培养，其发酵液和菌丝体中都含有杀菌活性物质，对因病原真菌引起的植物病害，如灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜类炭疽病(Colletotrichum lagenarium)、水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)等均有较好的防治效果，可以进一步开发为一种新型的农用杀菌剂。
序列表<110>上海市农药研究所<120>一种放线链霉菌及其应用<130>051325C<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1604<212>DNA<213>Streptomyces caviscabies<220>
<221>16srDNA<222>(1)..(1604)<400>1tcttgcatgc ctgcaggtcg actctagact cgagggatcc agatctccag tctagagttt 60gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg aacgatgaag120ccgcttcggt ggtggattag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggcaat ctgcccttca180ctctgggaca agccctggaa acggggtcta ataccggata atactcctgc ctgcatgggt240gggggttgaa agctccggcg gtgaaggatg agcccgcgac ctatcagctt gttggtgggg300taatggccta ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg ccacactggg360actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg420aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgca aacctctttc480agcagggaag aagcgcaagt gacggtacct gcagaagaag cgccggctaa ctacgtgcca540gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagagctc600gtaggcggct tgtcacgtcg gatgtgaaag cccggggctt aaccccgggt ctgcattcga660tacgggctag ctagagtgtg gtaggggaga tcggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg720
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1.一种放线链霉菌SPRI-1218，其特征在于，该微生物分类属链霉菌属(Streptomycescaviscabies)，其保藏号为CGMCC No.1369。
2.如权利要求1所述的放线链霉菌SPRI-1218，其特征在于，该菌株的种子培养条件为在28℃±2℃下培养36-40小时；培养基组成葡萄糖2％、淀粉1％、黄豆饼粉2％、氯化钠0.2％、牛肉膏0.1％、磷酸氢二钾0.05％，PH 7.2。
3.如权利要求1所述的放线链霉菌SPRI-1218，其特征在于，该菌株的发酵培养条件为在28℃±2℃下通气搅拌培养90-96小时；培养基组成葡萄糖2％、淀粉1％、黄豆饼粉2.5％、氯化钠0.2％、牛肉膏0.1％、磷酸氢二钾0.05％。
4.如权利要求1所述的放线链霉菌SPRI-1218，其特征在于，该菌株具有SEQ IDNO1所示的16SrDNA序列。
5.权利要求1-4中任一项所述放线链霉菌SPRI-1218的应用，其特征在于，用于生产防治灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜类炭疽病(Colletotrichum lagenarium)和水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)的农用杀菌剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，通过所述放线链霉菌SPRI-1218的发酵培养来生产所述农用杀菌剂。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵培养的条件为在28℃±2℃下通气搅拌培养90-96小时；培养基组成葡萄糖2％、淀粉1％、黄豆饼粉2.5％、氯化钠0.2％、牛肉膏0.1％、磷酸氢二钾0.05％。
全文摘要
本发明提供了一种放线链霉菌SPRI－1218Streptomyces caviscabies CGMCC No.1369，通过发酵培养该菌株得到的培养物可用于防治灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜类炭疽病(Colletotrichum lagenarium)和水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)等多种作物真菌性病害。
文档编号C12R1/465GK1928069SQ200510029520
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月8日 优先权日2005年9月8日
发明者陶黎明, 徐文平, 沈宙, 王磊, 顾学斌, 郭磊, 杨星, 旷文丰, 倪长春, 陆迪生, 郑佳玲, 张育雷, 庞鸿昌 申请人:上海市农药研究所