专利名称：Vegf i型受体在血管外膜成纤维细胞上的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域。更具体地涉及VEGF I型受体在血管外膜成纤维细胞上的表达以及VEGF I型受体对血管外膜成纤维细胞迁移的作用。本发明还涉及通过抑制VEGF I型受体从而抑制血管外膜成纤维细胞迁移的的方法和组合物。
背景技术：
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一类促进血管生成、成熟的主要生长因子，其主要与两种酪氨酸激酶受体结合VEGFR-1(vascular endothelial growth factor receptor-1)也称flt-1(Fms-liketyrosine kinase)，及VEGFR-2(vascular endothelial growth factor receptor-2)也称flk-1(fetal liver kinase)。
在人类，VEGFR-2又称KDR(kinase insert domain-containing receptor)。多年来，VEGF及其受体的生物学研究主要集中于血管内皮细胞，但近年来研究发现，VEGFRs在许多非内皮细胞如肿瘤细胞，血管平滑肌细胞，单核/巨噬细胞、骨髓祖细胞、中性粒细胞等亦有表达(Luttun A，Tjwa M，Moons L，etal.Revascularization of ischemic tissues by PlGF treatment，and inhibitionof tumor angiogenesis，arthritis and atherosclerosis by anti-Flt1[J].Nature medicine.2002，8(8)831～840；Ishida A，Murray J，Saito Y，et al.Expression of vascular endothelial growth factor receptors in smoothmuscle cells[J].J Cell Physiol.2001，188(3)359～368)，且能够介导这些细胞的活化和部分生物学功能。例如，存在于单核细胞上的VEGFR-1能调节细胞化学趋化性及组织因子的释放(Clauss M.Functions of the VEGF receptor-1(FLT-1)in the vasculature[J].Trends Cardiovasc Med.1998，8241～245)；VEGF能刺激血管平滑肌细胞分泌MMP-1，-3，-9，促进血管平滑肌细胞迁移增强等(Wang H，Keiser J A.Vascular endothelial growth factor upgregulates the expressionof matrix metalloproteinases in vascular smooth muscle cells role offlt-1[J].Circ Res.1998，83832～840)。这些均提示VEGFRs在非内皮细胞中表达具有重要生物学意义。
近年来随着对血管壁各层结构研究的深入，人们逐步了解到血管外膜在血管损伤及血管病理性重塑中的重要作用。然而，人们对于那些因素或因子会影响血管外膜在血管损伤及血管病理性重塑中作用，却了解很少。
综上所述，为了尽早预防和治疗与血管病理变化有关的疾病，本领域迫切需要寻找影响血管外膜的相关因素，以便开发相应的检测方法、试剂盒，和/或治疗药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种与血管外膜成纤维细胞的迁移有关的因子及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种筛选抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物的方法，包括步骤(a)在测试组中，向血管外膜成纤维细胞的培养物中添加待筛选的候选物，培养并检测血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体的数量；并且，在对照组中，在不添加待筛选的候选物的情况下，培养血管外膜成纤维细胞并检测I型血管内皮生长因子受体的数量；(b)将步骤(a)测试组中I型血管内皮生长因子受体的数量与未添加候选物的对照组中I型血管内皮生长因子受体的数量进行比较，如果测试组的I型血管内皮生长因子受体的数量在统计学上显著低于对照组，就表明该候选物是抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(b′)检测测试组中I型血管内皮生长因子受体mRNA的数量，并与对照组中I型血管内皮生长因子受体mRNA的数量进行比较，其中测试组的I型血管内皮生长因子受体mRNA的数量在统计学上显著低于对照组，就表明该候选物是抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物。
在另一优选例中，所述的I型血管内皮生长因子受体是人、大鼠或小鼠的I型血管内皮生长因子受体。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(c)测定所述化合物对血管外膜成纤维细胞迁移的影响。
在另一优选例中，所述的低于对照组是比对照组少30％，较佳地少50％，更佳地少70％。
在本发明的第二方面，提供了一种筛选抑制血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF结合的抑制剂的方法，包括步骤(a)在测试组中，向血管外膜成纤维细胞的培养物中添加待筛选的候选物和VEGF，检测血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF的结合所形成的复合物数量；并且，在对照组中，在不添加待筛选的候选物和和加入VEGF的情况下，检测I型血管内皮生长因子受体与VEGF的结合所形成的复合物数量；(b)将步骤(a)测试组中所述的复合物数量与未添加候选物的对照组中所述复合物的数量进行比较，如果测试组的复合物的数量在统计学上显著低于对照组，就表明该候选物是抑制血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF结合的抑制剂。
在另一优选例中，所述的低于对照组是比对照组少30％，较佳地少50％，更佳地少70％。
本发明还涉及用上述筛选方法所获得的(a)抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物和(b)抑制血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF结合的抑制剂。
在本发明的第三方面，提供了一种I型血管内皮生长因子受体的拮抗剂的用途，它被用于制备抑制血管外膜成纤维细胞迁移的组合物。
在另一优选例中，所述的拮抗剂选自抗I型血管内皮生长因子受体的抗体、I型血管内皮生长因子受体的反义核酸。
本发明还提供了抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物的促进剂的用途，它也可用于制备抑制血管外膜成纤维细胞迁移的组合物。
本发明还提供了一种抑制血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF结合的抑制剂的用途，它也可用于制备抑制血管外膜成纤维细胞迁移的组合物。
在另一优选例中，所述的组合物还用于与血管外膜成纤维细胞迁移有关的血管病变。
图1显示了AFs细胞能分泌VEGF，且缺氧能显著刺激其分泌增加。
1A外膜成纤维细胞VEGF分泌水平。细胞培养24小时后，用ELISA方法检测VEGF浓度，数据表示为平均值±标准差(n＝3)，*p＜0.05，与对照组相比较，有显著性差异；1B缺氧(3％ O2)上调VEGF蛋白水平。外膜成纤维细胞分别在正常和缺氧条件下培养24小时后，用ELISA方法检测VEGF浓度，数据表示为平均值±标准差(n＝4)*p＜0.05，与对照组相比较，有显著性差异。
图2显示了VEGFRs mRNA在AFs细胞的表达。RT-PCR检测外膜成纤维细胞，血管平滑肌细胞，脐静脉内皮细胞中flt-1和KDR/flk的mRNA表达水平。
图3显示了在血管外膜成纤维细胞上flt-1蛋白的水平。
3A免疫印迹检测外膜成纤维细胞flt-1蛋白表达。平滑肌细胞，脐静脉内皮细胞flt-1蛋白表达水平作为阳性对照；3B免疫印迹检测表明TGF-β，bFGF，PDGF，和AngII对外膜成纤维细胞flt-1蛋白表达作用。条带从左往右依次为未处理组，TGF-β10ng/ml，bFGF10ng/ml，PDGF10ng/ml，AngII10-7M。上图为免疫印迹图，下图为图像灰度统计图(n＝4)，结果表示为平均值±标准差，*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组相比较，有显著性差异；3C免疫印迹分析低氧对外膜成纤维细胞表达flt-1作用。条带从左往右依次表示为正常条件下，低氧4小时，低氧8小时，低氧12小时。
图4显示了125I-VEGF与外膜成纤维细胞特异性结合的剂量依赖曲线。SB代表特异性结合，外膜成纤维细胞(2×105/孔)与125I-VEGF或同时加入500倍未标记的VEGF在4℃孵育16小时，洗去未结合的同位素，用含0.25％BSA的冰PBS冲洗结合125I-VEGF成纤维细胞，结合参数Kd＝0.007±0.001nM。根据饱和曲线得出受体密度为480±373/细胞。
图5显示了VEGF和VEGF I型受体的作用能显著刺激AFs细胞迁移活性增强，即VEGF通过Flt-1诱导外膜成纤维细胞迁移。将无血清培养液中的外膜成纤维细胞置于transwell上室，所示浓度的VEGF165加入下室，37℃共同孵育6小时后，去除未迁移细胞，滤膜用苏木素-伊红染色，在3个随机高倍视野下(HPF，200×)通过计数细胞核数确定迁移细胞数，数据表示为平均值±标准差(n＝4)，**P＜0.01，与对照组相比较，有显著性差异。
图6显示了VEGF对AFs细胞DNA合成的影响。外膜成纤维细胞置于含10％小牛血清培养液的24孔板中培养至亚融合状态，细胞静止48小时后加入三氯乙酸，然后按照所示浓度加入VEGF刺激18小时，5％小牛血清作为阳性对照，加入3H-TdR进一步孵育6小时。通过液闪计数仪计数放射活性(n＝4)，纵轴表示增殖百分率，数据表示为平均值±标准差(n＝5)，*P＜0.01，与对照组相比较，有显著性差异。
具体实施例方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次发现了血管外膜成纤维细胞存在VEGF 1型受体的表达，TGF-β、bFGF、PDGF、AngII、低氧等均能刺激其表达增高。这种VEGF I型受体能特异地与VEGF结合，并具有高亲和性。此外，该受体能有效介导血管外膜成纤维细胞的迁移活性。这提示，VEGF I型受体介导了血管外膜成纤维细胞参与血管的病理变化。在此基础上完成了本发明。
具体而言，本发明的试验结果证明，ELISA检测培养的AFs中VEGF分泌及低氧(3％O2)对其分泌的影响。采用RT-PCR，蛋白免疫印迹杂交法检测是否AFs存在flt-1，flk-1表达。以蛋白免疫印迹杂交方法观察TGF-β，PDGF，bFGF，AngII，低氧等对VEGFRs表达的影响。通过125I-VEGF165放射性受体配基结合实验探测AFs细胞上的VEGF受体数目及其与VEGF的亲合力。利用Transwell技术观察不同浓度VEGF对AFs迁移的影响。运用3H-TdR掺入实验观察不同浓度VEGF对AF的DNA合成的作用。
结果表明AFs能分泌VEGF，且在低氧刺激下其分泌增加。AFs细胞培养上清液中24小时VEGF分泌量为55.98+20.86pg/ml，(n＝4，p＜0.05)，3％O2低氧刺激24小时后，VEGF含量与刺激前相比增加约2倍左右，差异具有统计学意义(n＝3，P＜0.05)。逆转录PCR结果显示以HUVECs做阳性对照，AFs、VSMCs均表达flt-1；AFs无flk-1表达，VSMCs只有微弱的flk-1表达。蛋白免疫印迹实验结果进一步证实AF细胞存在flt-1蛋白表达。TGF-β(n＝4，P＜0.01)，bFGF，PDGF，AngII(n＝4，P＜0.05)，低氧(3％ O2)(n＝3，P＜0.05)均可刺激AFs flt-1表达增高。
此外，受体-配基结合的饱和曲线表示随125I-VEGF量增高，125I-VEGF与AFs细胞呈可饱和性结合。解离常数(kd)为0.007±0.001nM，据其最大结合容量推算AF上细胞数量为约480±373个/细胞。125I-VEGF与AF细胞的结合为一可饱和，高亲和性，特异的结合反应。VEGF能显著刺激AFs细胞迁移活性增强，在5ng/ml时作用最强(P＜0.01，n＝4)，10ng/mL时其促迁移作用下降。进一步研究VEGF对AFs细胞DNA合成的影响。以5％小牛血清做阳性对照。发现小牛血清能有效刺激AFs细胞增殖(n＝6，P＜0.01)，但VEGF对细胞增殖无显著作用(n＝6，P＞0.05)。这些实验表明VEGF对AFs的主要效应是促细胞迁移。
如本文所用，术语“VEGFR-1”和“flk-1”可互换使用，都指I型血管内皮生长因子。
如本文所用，术语“VEGFR-2”和“KDR”可互换使用，都指II型血管内皮生长因子。
基于本发明的新发现，VEGF I型受体有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)筛选抑制血管外膜成纤维细胞迁移的物质，筛选抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物，以及筛选抑制血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF结合的抑制剂。
这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够有效治疗与血管外膜成纤维细胞迁移有关的血管病变的药物。
在本发明中，使用常规的检测方法，利用血管外膜成纤维细胞上的VEGF I型受体，可筛选出与影响血管外膜成纤维细胞上VEGF I型受体数量或功能(如与VEGF结合的有关物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
(a)VEGF I型受体的拮抗剂或(b)抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物，以及(c)抑制血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF结合的抑制剂，可以施用于个体时，以抑制血管外膜成纤维细胞的迁移，进而改善与血管外膜成纤维细胞迁移有关的血管病理变化。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、或皮下给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的(a)VEGF I型受体的拮抗剂或(b)抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物，或(c)抑制血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF结合的抑制剂，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。
本发明还涉及定量和定位检测血管外膜成纤维细胞上VEGF I型受体数量的方法。这些检测结果可用于辅助判断血管外膜成纤维细胞的迁移能力和水平。
一种检测血管外膜成纤维细胞VEGF I型受体数量的方法是利用VEGF I型受体的特异性标记物进行检测，它包括将含血管外膜成纤维细胞的样品与抗VEGF I型受体的特异性抗体接触；观察所形成抗体复合物的数目。
本发明的主要优点在于首次证实了血管外膜成纤维细胞上VEGF I型受体与血管外膜成纤维细胞迁移之间的相关性，从而为抑制血管外膜成纤维细胞迁移提供了新途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例11.材料与方法1.1细胞培养采用文献报道的组织贴块法(Zhu DL，Herembert T，Marche P.Increasedproliferation of adventitial fibroblasts from spontaneously hypertensiverat aorta[J].J Hypertens.1991，91161～1168.)进行血管外膜成纤维细胞(AF)，及血管平滑肌细胞(VSMC)原代培养。取清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重180-200克)，断头处死，常规体表消毒，开胸游离取出胸主动脉，置于DMEM培养液(高糖，GIBCO公司)中，使用直镊分离结缔组织和血迹，纵向剪开血管，用弯镊轻柔剥除内膜，剥离中膜和外膜，分别将中膜和外膜剪成1mm2大小的组织块，置于不同培养皿中加入含10％胎牛血清(GIBCO公司)的DMEM培养液进行贴壁培养。待细胞长至亚融合状态，用0.25％ Trypsin-EDTA(GIBCO公司)消化、传代，实验使用4-6代细胞。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由上海市内分泌研究所惠赠，置于含低血清生长添加剂(LSGS)的M200培养液(Cascade公司)中培养，实验使用3-5代细胞。
1.2 AFs细胞培养上清液中VEGF的分泌将AFs细胞接种于直径为6cm的培养皿中长至亚融合状态时，吸弃细胞的含血清培养上清，以PBS洗涤2次，予无血清DMEM静止48h后，共分两组，一组予2ml空白DMEM于普通Co2培养箱分别培养2小时或培养24小时，另一组予2ml含0.4％胎牛血清的DMEM于低氧培养箱(HERAEUS)分别培养12小时或24小时，对照则相对应予2ml含0.4％胎牛血清的DMEM于普通培养箱培养12小时或24小时，分别收集细胞上清液。低温冷冻干燥后用400ul蒸馏水复溶后待测。
使用ELISA试剂盒(晶美生物工程(北京)有限公司)测定细胞培养上清中VEGF含量。方法参照试剂盒说明。具体操作为取100ul标准品及样品加入已包被抗VEGF单抗的96孔酶标板上，充分混匀置37℃90分钟，常规洗板，加入生物素化的一抗置37℃1小时，洗板后加入酶标二抗37℃30分钟，然后加入酶底物反应15分钟终止，在450nm处测吸光度。根据标准曲线计算相应VEGF含量。
1.3逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测AFs的VEGFRs mRNA表达细胞总RNA抽提后，根据测得的OD值，取血管外膜成纤维细胞(AFs)、平滑肌细胞(VSMCs)、人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的RNA 1μg，加入EP管中，再加入随机引物1μl，用DEPC-H2O补足体积至4μl，65℃水浴5分钟后，迅速放入冰中，加样5×缓冲液4μl；dNTPs(10mM)1.25μl；逆转录酶(M-MLV，200U/ul)1μl，用DEPC水补足至总体积为25μl，再将EP管放入37℃水浴60分钟，95℃煮5分钟，4℃放置5分钟，结束后置逆转录产物于-20℃保存。
PCR引物合成，由上海赛百盛公司合成，序列如下(1)flt-1，上游5’-CAAGGGACTCTACACTTGTC-3’下游5’-CCGAATAGCGAGCAGATTTC-3’(2)flk-1上游5’-GCCAATGAAGGGGAACTGAAGAC-3’下游5’-TCTGAC TGCTGGTGATGCTGTC-3’。Flt-1、flk-1的PCR反应条件分别为94℃ 45秒，56℃ 40秒，72℃ 45秒，30个循环；94℃ 45秒，66℃ 40秒，72℃ 45秒，35个循环；最后72℃延伸10分钟。取8ul扩增产物加2ul上样缓冲液混匀后，在1.2％的琼脂糖凝胶上，100V电泳15分钟，紫外灯下观察结果。将电泳好的样品在紫外线下拍摄成像。PCR产物经测序认定。
1.4蛋白免疫印迹法测定细胞flt-1蛋白的表达AFs接种于直径6cm培养皿中培养至亚融合状态后，予无血清DMEM培养液静止48小时后，分两组。一组分别给予空白DMEM或含10ng/mL TGF-β，bFGF，PDGF，10-7MAngII的DMEM培养液刺激24小时后备用。另一组则予含0.4％胎牛血清的DMEM，以在普通Co2培养箱培养为对照，在低氧培养箱中分别培养4小时，8小时，12小时，24小时。细胞总蛋白抽提后，用Bredford方法测定蛋白浓度。选用Bio-Rad公司的小型垂直平板电泳装置根据不同分子量大小分别对flt-1，flk-1，β-actin选用6％，6％，10％浓度的分离胶。积层胶浓度均为4％。蛋白上样量为10ug～20ug，电泳后转膜，封闭，标一抗(flt-1，flk-2均为Santa Cruz，1∶500)4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温下振摇1小时，显影观察X光片出现的条带，经扫描仪转化为图片文件。
1.5.125I-VEGF165放射性受体配基结合实验大鼠血管外膜成纤维细胞以约1.4×105接种于12孔板上，待生长至亚融合状态，用含0.25％BSA的冰磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，分两组，一组是总结合组，分别加入不同量的125I-VEGF165(PerkinElme)，另一组则是非特异结合组，在加入不同量125I-VEGF165同时加入大量的非标记VEGF165(PeproTech，约为125I-VEGF量的500倍左右)，两组均在4℃孵育16小时，含0.25％BSA冰DMEM洗3遍，细胞裂解液(1％TritonX-100，10％Glycerol，20mMTris-Hcl，PH7.5)裂解30分钟后，转入放免管用γ-counter测量。总结合组与非特异结合组平行操作，双管平行测定。总结合减去非特异结合为特异结合(specific binding，SB)。
1.6.3H-TdR掺入实验检测在VEGF刺激下AFs增殖活性改变细胞长至亚融合状态，以0.25％ Trypsin-EDTA消化成细胞悬液，细胞计数，以5×104细胞/孔的密度将细胞接种于24孔板中，待细胞长至亚融合状态，无血清DMEM静止48小时，分别做如下处理以5％新生牛血清(newborn calf serum，NCS)作阳性对照，将含不同浓度VEGF(0、2、5、10ng/ml)的无血清DMEM依次加入24孔板。继续孵育，在孵育18小时后，加入3H-TdR(购自中国科学院上海应用物理研究所)1μCi/孔，继续孵育6小时，收集细胞，测定3H放射活性。
1.7.细胞迁移采用transwell技术(Corning，Inc)研究VEGF对AFs迁移活性的影响。首先，在Transwell下室中加入含不同浓度VEGF(0、1、5、10ng/mL)的DMEM 600ul，或阳性对照5％新生牛血清的DMEM 600ul，然后将Transwell上室(其滤膜孔径为8μm)置于下室之上，上室中加入2×105细胞悬液。将Transwell置入37℃，5％Co2培养箱孵育6小时，取出上室，以棉签轻轻拭去上室滤膜内表面残存细胞，吸弃下室中的培养液，将上室仍放在下室上，PBS洗涤5分钟×3次，95％的冰乙醇固定15分钟，PBS洗涤5分钟×3次，苏木素染色2-5min，水洗，伊红染色3-5min，充分水洗。显微镜下观察计数。每张滤膜随机取4个视野(×200)，对迁移细胞计数，取均值作为一次实验数据。
2.统计分析计量数据以均数±标准差表示。应用SAS6.04版统计软件进行统计处理。两组间差异用t检验，多组间比较用方差分析。P＜0.05表示差异具有显著性，P＜0.01表示差异具有高度显著性。
3.结果3.1. AFs细胞能分泌VEGF，且缺氧能显著刺激其分泌增加ELISA结果显示(图1)，AFs细胞培养上清液中VEGF含量分别为24小时分泌量为55.98+20.86pg/ml，(n＝4，p＜0.05)，3％O2低氧刺激24小时后，VEGF含量与刺激前相比增加约2倍左右，差异具有统计学意义(n＝3，P＜0.05)。
3.2. VEGFRs mRNA在AFs细胞的表达逆转录PCR结果(图2)显示以HUVEC做阳性对照，AF、VSMC均表达flt-1；AFs无flk-1表达，VSMC只有微弱的flk-1表达。
3.3. flt-1蛋白水平的分析蛋白免疫印迹实验结果(图3)进一步证实AF细胞存在flt-1蛋白表达。TGF-β，bFGF，PDGF，AngII，低氧(3％ O2)均可刺激AFs flt-1表达增高。
3.4.125I-VEGF受体-配基结合分析受体结合实验饱和曲线(图4)示随125I-VEGF量增高，125I-VEGF与AFs细胞呈可饱和性结合。解离常数(kd)为0.007±0.001nM，据其最大结合容量推算AFs上VEGF受体密度为约480±373个/cell。
结果表明，125I-VEGF与AF细胞的结合为一可饱和，高亲和特异的结合反应。
3.5. VEGF能有效刺激AFs迁移，但对其细胞增殖无明显作用AFs表达flt-1，且可以与VEGF有效结合，并具有高亲和性。然而flt-1主要介导细胞哪些生物学活性呢？为了探讨这种表达的生物学功能，本实施例主要研究了VEGF对AFs细胞迁移和增殖的影响，并采用transwell技术检测VEGF165对AFs迁移的作用。
结果如图5所示VEGF能显著刺激AFs细胞迁移活性增强，在5ng/ml时作用最强(P＜0.01)。10ng/ml时其促迁移作用下降。
VEGF对AFs细胞DNA合成的影响如图6所示。以5％小牛血清做阳性对照。发现小牛血清能有效刺激AFs细胞增殖(n＝5，P＜0.01)，但VEGF对细胞增殖无显著作用(n＝5，P＞0.05)。
这些实验表明VEGF对AFs的主要效应是促细胞迁移。
讨论虽然flt-1是最早发现的VEGF受体、与VEGF亲和力较flk-1高，但由于它只有弱的酪氨酸激酶活性，且内皮细胞上flt-1数量较flk-1低，VEGF的许多生物学功能主要通过flk-1介导，因此多年来flt-1被认为只存在修饰辅助功能(Karkkainen MJ，Petrova TV.Vascular endothelial growth factor receptorsin the regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis[J].Oncogene.2000，19(49)5598～5605)。虽然flt-1在血管内皮细胞中功能不占主要地位，但近年来，大量研究表明其在非内皮细胞的表达对于许多心血管疾病有着重要的生物学意义和临床意义。抗-flt-1处理的ApoE-/-(apolipoprotein-E-deficient)高脂模型小鼠在主动脉根部早期和中期的斑块大小较对照组减少了约50％，进展期的粥样斑块增长减少了约25％。此外，flt-1还参与血管损伤后新生内膜的形成。有许多学者证明VEGF能促进VSMCs迁移活性增强。而VSMCs的激活、迁移与血管损伤后重塑密切相关。大鼠颈动脉球囊损伤7天后在新生内膜处存在高度表达flt-1 mRNA和蛋白的VSMCs细胞。这种细胞只局限于新生内膜处，血管更深层的平滑肌细胞并不存在高表达的flt-1。并且在损伤过程中没有探测到flk-1的表达(Couper LL，Bryant SR，Eldrup-Jorgensen J，et al.Vascular endothelial growth factorincreases the mitogenic response to fibroblast growth factor-2 in vascularsmooth muscle cells in vivo via expression of fms-like tyrosine kinase-1[J].Circ Res 1997，81(6)932～939)。
血管壁还有一重要结构-血管外膜层。近十余年来，越来越多实验证明血管外膜不仅仅是一支持组织，而是血管功能调节，血管重塑的“积极参与者”。外膜中存在的交感及副交感神经末梢释放的神经递质如去甲肾上腺素、神经肽Y，P物质，乙酰胆碱、一氧化氮可作用于中膜平滑肌细胞调节血管舒缩(PaganoPJ，Clark JK，Cifuentes-Pagano ME，et al.Localization of a constitutively active，phagocyte-like NADPH oxidase in rabbit aortic adventitiaenhancement byangiotensin II[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(26)14483～14488.)。在高血压压力应激下，血管外膜成纤维细胞内NADPH氧化酶活性增强，外膜中超氧阴离子产生增加，一氧化氮灭活增加，血管舒张功能减退，血管收缩，进一步引起血压升高(Rey FE，Pagano PJ.The reactive adventitiafibroblast oxidase invascular function[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol.2002，22(12)1962～1971；Das M，Dempsey EC，Bouchey D，et al.Chronic hypoxia induces exaggeratedgrowth responses in pulmonary artery adventitial fibroblastspotential contributionof specific protein kinase c isozymes[J].Am J Respir Cell Mol Biol.2000，22(1)15～25)。
在球囊血管损伤模型上，外膜成纤维细胞早于中膜和内膜细胞而首先被激活，细胞表型发生转化，分泌多种生长因子，外膜细胞增殖加快，迁移至中膜和内膜下，参与新生内膜的形成(Sartore S，Chiavegato A，Faggin E，et al.Contribution of adventitial fibroblasts to neointima formation and vascularremodeling-From innocent bystander to active participant[J].Circ Res，2001，891111～1121；Wilcox J N，Nakahara E O，Jakob V J，et al.Perivascularresponse after angioplasty which may contribute to postangioplasty restenosis[J].Ann NY Acad Sci，2001，94768～90；Couffinhal T，Dufourcq P，Jaspard B，et al.Kinetics of adventitial repair in the rat carotid model[J].Coron Artery Dis，2001，12(8)635～648；Maeng M，Olesen PG，Emmertsen NC，et al.Time course ofvascular remodeling，formation of neointima and formation of neoadventitia afterangioplasty in a porcine model[J].Coron Artery Dis.2001，12(4)285～293.)。但究竟哪些活性因子参与启动和维持这些功能调节及重塑效应，其作用机制如何，目前尚不十分清楚。
本发明证实了AFs能分泌VEGF且在缺氧条件下分泌量显著增高，以及从mRNA水平和蛋白水平均证实了AFs存在VEGF 1型受体的表达，但即使是Western blot所探测到的flt-1蛋白水平的表达，亦无法就此论定该蛋白分子具有受体的空间结构和活性。只有严格构型和构象的受体分子才能特异性地与其配基VEGF结合。因此设计了受体的放射性配基结合实验。结果显示125I-VEGF与血管外膜成纤维细胞的结合是一可饱和，高亲和的特异结合反应。
为了研究AFs细胞上的flt-1是否与血管局部的病理改变有关。选取了TGF-β，bFGF，PDGF，AngII，低氧等刺激因素。这些因素的作用与高血压、血管损伤后重塑、动脉粥样硬化等血管病变密切相关。本发明的研究表明，这些因素的作用均能刺激AFs的flt-1表达增高，且TGF-β作用尤为显著，而文献报导TGF-β能够通过影响血管细胞的增殖及外膜成纤维细胞表型转化等机制参与血管重塑。从而提示flt-1可能也参与了这一机制。
此外，本发明人还进一步研究了flt-1所介导的AFs的功能。观察到VEGF能有效刺激AFs迁移，但不能诱导其增殖增强。
目前所获得的结果提示，在血管病理情况下，血管环境改变以及血管局部活性物质的增高促使AFs分泌VEGF增高以及flt-1表达增高，在VEGF刺激下血管外膜成纤维细胞激活，迁移活性增强，这可能也是动脉粥样硬化、血管重塑等病变的机制之一。
实施例2筛选抑制VEGF I型受体在血管外膜成纤维细胞上表达的抑制剂培养血管外膜成纤维细胞的方法同实施例1，不同点在于在测试组的培养基添加0.05M的待测试物质，而对照组的培养基中不添加待测试物质。然后用实施例1.5中所述的蛋白免疫印迹法测定血管外膜成纤维细胞上flt-1蛋白(即VEGF I型受体)的表达，同时用用实施例1.4中所述的方法测定血管外膜成纤维细胞中VEGFI型受体的mRNA水平。
与对照组的VEGF I型受体数量(取重复3次试验的平均值)相比，如果测试组的VEGF I型受体数量(取重复3次试验的平均值)低于30％，则认为该测试化合物是较有效的抑制VEGF I型受体在血管外膜成纤维细胞上表达的抑制剂。如果测试组的VEGF I型受体数量(取重复3次试验的平均值)低于50％，则认为该测试化合物是很有效的抑制VEGF I型受体在血管外膜成纤维细胞上表达的抑制剂。
实施例3筛选抑制血管外膜成纤维细胞迁移的化合物对于实施例2中筛选出的抑制VEGF I型受体表达数量的促进剂，进一步用实施例1.7中所述的方法测定其对血管外膜成纤维细胞迁移的影响，具体方法如下采用transwell技术(Corning，Inc)研究VEGF对AFs迁移活性的影响。首先，在Transwell下室中加入含不同浓度VEGF(0、1、5、10ng/mL)的DMEM 600ul，或阳性对照5％新生牛血清的DMEM 600ul，然后将Transwell上室(其滤膜孔径为8μm)置于下室之上，上室中加入2×105细胞悬液。将Transwell置入37℃，5％CO2培养箱孵育6小时，取出上室，以棉签轻轻拭去上室滤膜内表面残存细胞，吸弃下室中的培养液，将上室仍放在下室上，PBS洗涤5分钟×3次，95％的冰乙醇固定15分钟，PBS洗涤5分钟×3次，苏木素染色2-5min，水洗，伊红染色3-5min，充分水洗。显微镜下观察计数。每张滤膜随机取4个视野(×200)，对迁移细胞计数，取均值作为一次实验数据。
结果表明，实施例2中初步筛选获得的2种抑制剂都可以抑制血管外膜成纤维细胞的迁移。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种筛选抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物的方法，其特征在于，包括步骤(a)在测试组中，向血管外膜成纤维细胞的培养物中添加待筛选的候选物，培养并检测血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体的数量；并且，在对照组中，在不添加待筛选的候选物的情况下，培养血管外膜成纤维细胞并检测I型血管内皮生长因子受体的数量；(b)将步骤(a)测试组中I型血管内皮生长因子受体的数量与未添加候选物的对照组中I型血管内皮生长因子受体的数量进行比较，如果测试组的I型血管内皮生长因子受体的数量在统计学上显著低于对照组，就表明该候选物是抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(b′)检测测试组中I型血管内皮生长因子受体mRNA的数量，并与对照组中I型血管内皮生长因子受体mRNA的数量进行比较，其中测试组的I型血管内皮生长因子受体mRNA的数量在统计学上显著低于对照组，就表明该候选物是抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的I型血管内皮生长因子受体是人的I型血管内皮生长因子受体。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤(c)测定所述化合物对血管外膜成纤维细胞迁移的影响。
5.一种筛选抑制血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF结合的抑制剂的方法，其特征在于，包括步骤(a)在测试组中，向血管外膜成纤维细胞的培养物中添加待筛选的候选物和VEGF，检测血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF的结合所形成的复合物数量；并且，在对照组中，在不添加待筛选的候选物和和加入VEGF的情况下，检测I型血管内皮生长因子受体与VEGF的结合所形成的复合物数量；(b)将步骤(a)测试组中所述的复合物数量与未添加候选物的对照组中所述复合物的数量进行比较，如果测试组的复合物的数量在统计学上显著低于对照组，就表明该候选物是抑制血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF结合的抑制剂。
6.一种I型血管内皮生长因子受体的拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备抑制血管外膜成纤维细胞迁移的组合物。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂选自抗I型血管内皮生长因子受体的抗体、I型血管内皮生长因子受体的反义核酸。
8.一种抑制I型血管内皮生长因子受体在血管外膜成纤维细胞上表达的化合物的促进剂的用途，其特征在于，用于制备抑制血管外膜成纤维细胞迁移的组合物。
9.一种抑制血管外膜成纤维细胞上I型血管内皮生长因子受体与VEGF结合的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备抑制血管外膜成纤维细胞迁移的组合物。
10.如权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于与血管外膜成纤维细胞迁移有关的血管病变。
全文摘要
本发明公开了VEGF I型受体在血管外膜成纤维细胞上的表达以及VEGF I型受体对血管外膜成纤维细胞迁移的作用。本发明还公开了通过抑制VEGF I型受体的表达或VEGF I型受体与VEGF的结合从而抑制血管外膜成纤维细胞迁移的的方法和组合物。
文档编号C12Q1/02GK1928112SQ200510029530
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月9日 优先权日2005年9月9日
发明者高平进, 朱鼎良, 葛晓莉, 张怡, 周晓鸥 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 上海市高血压研究所