采用cd4结合肽和辐射的疗法的制作方法

专利名称：采用cd4结合肽和辐射的疗法的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用辐射治疗临床疾病的领域。具体地说，本发明涉 及能够结合CD4的肽如抗体调节辐射治疗的用途。
背景技术：
辐射在诱导皮肤浸润性T细胞凋亡方面高度有效，并由此在患有 T细胞介导的皮肤病的患者中发挥有益作用。然而，为了足够的临床 效力，可增强(恶性)T细胞对辐射的敏感性。在淋巴瘤细胞UV暴露 后，观察到Gl期细胞累积和凋亡细胞百分率增加，其被采用Gl关卡 抑制剂2-AP的治疗增大(Takemura T等，Apoptosis. 4(4)， 245-53 (1999))。该研究还表明，Gl期p53表达水平增加与对UV辐射诱导的 细胞死亡的敏感性增加有关联。由于Gl期p53表达提升而增加放射 敏感性得到许多其它研究的支持(Cuddihy AR等，Cancer Metastasis Rev. 21(3-4), 237-57 (2004), Mcllwrath AJ等，Cancer Res. M(14)， 3718-3722 (1994), Bohnke A等，Int J Radiat Biol.艇l), 53-63 (2004)， Nagasawa M等，Oncogene.巡(23), 2889-99 (2001》。而且，已表明鳞状 细胞癌细胞通过由抗EGFR抗体C225诱导的Gl停滞对辐射敏感 (Huang SM等，Clin Cancer Res. g(6), 2166-74 (2000))。还发现Gl样静 止期的肿瘤细胞对辐射比增殖细胞更敏感(Ng CE等，Br J Cancer. f^(3), 301-307 (1987》。
业已表明，p53的上调与T细胞中的重要信号途径磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)的抑制相关(Grandage VL等，Leukemia. 1^(4), 586-94 (2005))。因为抑制性衔接分子SHIP-1是P13K抑制剂(Horn S等, Leukemia. 1^(11)， 1839-49 (2004》，所以SHIP-1的活化应因此导致p53 的上调。
Dok-l和SHIP-1是所谓的在造血细胞中表达的"抑制性衔接分 子"，其用于减弱信号转导，由此防止不适宜的细胞活化(Veillette A等, ^(2), 301-8 (1988》。Dok-l的磷酸化触发了与SHIP画1的相互作用， 这导致P13K蛋白激酶B (PKB)/Akt途径的负调节。业已表明，Dok-l 在B细胞中的过表达引起细胞周期抑制剂p2lW^"ciP1的表达增加、细 胞周期蛋白D2表达降低和抗凋亡蛋白bd-XL表达降低(Yamakawa N 等，E纖O J. 21(7)， 1684-94 (2002》。Gl/S抑制剂p21的增加和Gl细 胞周期蛋白D的降低应暗示在Dok-l活化时Gl期延长或停滞。
通过在内源SfflP-l缺陷型JurkatT细胞中恢复SHIP-1表达而人 工诱导的SHIP-1表达已表明增加通过G1期的转变时间。Gl期的这 种延伸与细胞周期抑制剂p271^1的稳定性增加相关(Horn, 2004,同 上)。SHIP活化对通过Gl期前进的抑制性影响通过研究更遍在表达 的SHIP-1同源物SfflP-2得到证实，SfflP-2还在T细胞中表达(Bruyns 等，Biol Chem.里(7-8), 969-74 (1999》。SHIP-2在成胶质细胞瘤细胞 中的过表达抑制P13K蛋白激酶B(PKB)途径，并引起在G1的细胞周 期停滞，这也与细胞周期抑制剂p27Kip的稳定性增加相关(Taylor V等, Mol Cell Biol. ,8), 6860-6871 (2000》。
多种诱导DNA损伤的疗法，包括UVB辐射、补骨脂素和UVA (PUVA)疗法、电离辐射、电子束和x射线(Kacinski等，AnnNYAcad Sci. Mi, 194-199 (2001))以及光分离置换法(photopheresis)(血液体外循 环，接触UVA和补骨脂素)(Baron等，Dermatol Ther. 1^(4)， 303-310 (2003)),适用于CTCL。
PUVA对由正常或胂瘤性T淋巴细胞的皮肤浸润引起的皮肤病是 高度有效的治疗。有报道指T淋巴细胞对PUVA的细胞毒性作用的敏感性比其它皮肤居住细胞如角质细胞大50倍以上(Johnson等, Photochem Photobiol. @(5)， 566-571 (1996》。Gl DNA亚峰表明细胞死 亡通过凋亡发生，PUVA治疗明显减慢细胞周期进展，最终产生细胞 周期停滞和凋亡进入(Johnson R等，Photochem Photobiol. @(5), 566-571 (1996))。还已经表明，PUVA在辐射过的皮肤中导致DNA链 之间交联，受损的DNA将活化DNA修复机制，在表皮细胞(Hashimoto Y等，J Dermatol Sci. 1^(1), 16-24 (1995)或成纤维细胞(Ma W等，Exp Dermatol. 12(5), 629-37 (2003)中细胞停滞在细胞周期的G2期。
发明概述
本发明涉及令人惊奇的发现能够结合CD4的抗体可诱导增加 的p56^磷酸化。另外，抗CD4单克隆抗体扎木单抗(zanolimumab) 对p56^的磷酸化与p56kk酪氨酸激酶的某些底物(例如抑制性衔接分 子Dok-l和/或SHIP-1)的增加的磷酸化有关联。这些抑制性衔接分子 的活化经常导致细胞周期在Gl期延长或停滞。在Gl期停滞的细胞可 能对辐射治疗敏感(Mcllwrath， 1994,出处同上)，因此增强随后的或 并行的辐射治疗的效力。另外，抑制性衔接分子如SHIP-1的活化经 常导致P13k抑制，这经常导致p53上调，并由此可促进放疗时的T 细胞凋亡(Okkenhaug K.等，Nature reviews i 317-330 (2003))。
在一个实施方案中，本发明涉及能够结合CD4的肽，例如抗体， 以及其调节临床疾病的辐射治疗的用途。在本发明背景下，能够结合 CD4的肽还可被称为"CD4结合肽"，能够结合CD4的抗体还可被称 为"抗-CD4抗体"。在一个实施方案中，按照本发明使用的CD4结合 肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段，能够实现以下的一项或多项， 例如以下的至少2项，例如以下的至少3项，例如以下的至少4项， 例如以下的至少5项，例如以下的至少6项，例如以下的至少7项， 例如以下的至少8项，例如以下的全部
-通过p56欣诱导a-酪蛋白的磷酸化，-诱导p56kk自体磷酸化，
國诱导抑制性衔接分子Dok-l和/或SHIP-1和/或SfflP-2的磷酸化，
画诱导p5^、介导的Dok画l磷酸化，
-PKB/Akt途径的抑制，
-远离TCR的CD4隐匿，
國增加和/或上调p53表达，
-诱导细胞周期的Gl期停滞或延长， -增加CD4+细胞、优选CD4+ T细胞对辐射的敏感性。 按照本发明使用的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合 片段，能够结合CD4，并由此诱导p56^酪蛋白激酶的某些底物的磷 酸化。p56kk酪氨酸激酶的活化一般通过磷酸化导致酪氨酸激酶下游的 抑制性衔接蛋白(Dok-l)(Martelli MP等，J Biol Chem. 276(49), 45654-45661 (2001), Okabe S等，Blood. 105(D, 474-480 (2005))和/或接 触SH2结构域的5'-肌醇磷酸酶(SfflP-l)的表达增加(Lamkin TD等，J Biol Chem. 222(16), 10396-401 (1997))。 Dok曙l和SHIP國1例如在造血细 胞中表达，在该细胞中它们可用于减弱信号转导，并由此防止不适宜 的细胞活化(Veillette等，Annu Rev Immunol. 669-707 (2002))。 Dok-l和SHIP-1的磷酸化一般导致ras/ERK和AKT途径的抑制。 Dok-l的活化可触发与SHIP-1的相互作用，该相互作用可导致P13K 蛋白激酶B(PKB)/Akt途径的负调节，由此将细胞周期停滞在G1期。 Dok-l在B细胞中的过表达降低细胞周期蛋白D2表达和/或增加细胞 周期抑制剂p21WAF1/chipl表达(Yamakawa， 2002,出处同上)，这二者 均导致Gl期的延长或停滞。SfflP-l的活化和表达诱导通过Gl期的 转变时间增加，并增加细胞周期抑制剂p27KiP]的稳定性(Horn， 2004， 出处同上)。SHIP-1同源物SHIP-2遍在表达，SHIP-2的过表达导致 P13K蛋白激酶B (PKB)途径的抑制，由此将细胞周期停滞在Gl期 (Taylor V， 2000，出处同上)。另外，SHIP-1的表达抑制P13K蛋白激 酶B(Horn， 2004，出处同上)，这可导致p53上调(Grandage， 2005,出处同上)。表达p53的肺瘤细胞停滞在Gl期(Bohnke, 2004，出处 同上)，另夕卜，功能性p53在辐射时促进淋巴细胞的凋亡(Cuddihy, 2004, 出处同上)。
处于Gl期的细胞经常对离子辐射更敏感(Mcllwrath， 1994,出处 同上)，而且，处于Gl-样静止期的肿瘤细胞对辐射比增殖细胞更敏感 (Ng， 1987，出处同上)。CD4结合肽如抗CD4抗体或其抗原结合片段 与CD4+ T细胞的结合因此可使细胞对辐射治疗敏感，并诱导细胞在 此治疗后凋亡。
在一个实施方案中，本发明涉及用于在接受或将接受辐射治疗的 个体中治疗恶性疾病或炎性皮肤病的CD4结合肽，例如抗CD4抗体 或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明涉及用于和辐射治疗组合治疗恶性疾 病或炎性皮肤病的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明涉及用于调节临床疾病的辐射治疗的 CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明涉及CD4结合肽(例如抗CD4抗体或 其抗原结合片段)在制备用于在接受或将接受辐射治疗的个体中治疗 恶性疾病或炎性皮肤病的药物组合物中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及CD4结合肽(例如抗CD4抗体或 其抗原结合片段)在制备用于和辐射治疗组合治疗恶性疾病或炎性皮 肤病的药物组合物中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及能够结合CD4的CD4结合肽(例 如抗CD4抗体或其抗原结合片段)在制备用于调节临床疾病的辐射治 疗的药物组合物中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗恶性疾病或炎性皮月夫病的方 法，其包括给予其需要的患者治疗有效量的CD4结合肽，例如抗CD4 抗体或其抗原结合片段，并对所述患者进行辐射治疗。
在一个实施方案中，本发明涉及调节临床疾病的辐射治疗的方法，其包括给予其需要的患者治疗有效量的CD4结合肽，例如抗CD4 抗体或其抗原结合片段，并对所述患者进行辐射治疗。
在一个实施方案中，本发明涉及含CD4结合肽(例如抗CD4抗体 或其抗原结合片段)和补骨脂素连同一种或多种药学上可接受的赋形 剂用作药物的药盒组件。
在一个实施方案中，本发明涉及含CD4结合肽(例如抗CD4抗体 或其抗原结合片段)和补骨脂素连同药学上可接受的赋形剂用作治疗 恶性疾病或炎性皮肤病的药物的药盒组件。
在一个实施方案中，本发明涉及含CD4结合肽(例如抗CD4抗体 或其抗原结合片段)和补骨脂素连同药学上可接受的赋形剂用作与辐 射治疗组合治疗恶性疾病或炎性皮肤病的药物的药盒组件。
在一个实施方案中，本发明涉及CD4结合肽(例如抗CD4抗体或 其抗原结合片段)和补骨脂素在制备用于治疗恶性疾病或炎性皮肤病 的药盒组件中的用途。所述药盒组件可包含多剂量形式或单位剂量形 式的CD4结合肽。同样，所述药盒组件可包含多剂量形式或单位剂量 形式的补骨脂素。下文描述了适宜的单位剂量。
在一个实施方案中，本发明涉及CD4结合肽(例如抗CD4抗体或 其抗原结合片段)和补骨脂素在制备用于和辐射组合治疗恶性疾病或 炎性皮肤病的药盒组件中的用途。所述药盒组件可包含多剂量形式或 单位剂量形式的CD4结合肽。同样，所述药盒组件可包含多剂量形式 或单位剂量形式的补骨脂素。下文描述了适宜的单位剂量。
附图简述


图1显示了得自W097/13852的6G5的VH和VL序列。 图2图示了由CD4+ T细胞制备的细胞裂解物的蛋白质印迹结果， 所述CD4+ T细胞用CD3单克隆抗体和扎木单抗刺激。使CD4+ T细 胞与HuMax-CD4温育，然后用固定在乳胶珠上的CD3单克隆抗体 (OKT3)刺激。在双^f分细胞裂解物样品中的蛋白通过7-15%梯度凝胶SDS-PAGE分离，并通过电泳转移到印迹膜上。 一张膜与磷酸酪氨酸 特异性抗体温育，剥离，然后用TCR;和LAT特异性抗体再探测(图 2A)。另一张膜与磷酸化形式的特定蛋白的抗体温育，剥离，然后用 ZAP-70(2B)、 Erkl/2、 p38和AKT抗体再探测(2C)。印迹下的数字表 示相对于在没有HuMax-CD4时于CD3刺激2分钟后观察到的值对加 样标准化的密度测定值。此处显示的实验结果代表4个独立实验。
图3图解了与扎木单抗或人免疫球蛋白阴性对照温育的CD4+ T 细胞的结果。细胞裂解物是CD4-沉淀的(A)、 SH2-沉淀的(B、 D)或用 作全裂解物(C)。图3A:对两种CD4-沉淀物进行激酶测定(上方的两 张图)。印迹用p56kk抗体(顶图)、p56kk底物ot-酪蛋白(第二张图)、Y-394 磷酸化p56lck (第三张图)、p56lck (第四张图)或CD4 (底图)探测。印迹 下的数字代表对p56狄加样标准化的密度测定值。图3B:将采用SH2-沉淀物的印迹与Dok-l (顶图)或GST (底图)的抗体温育。印迹下的数 字代表对GST加样标准化的密度测定值。图3C:通过SDS-PAGE分 离全细胞裂解物中的蛋白，并印迹。将膜与磷酸化SHIP-1(顶图)或不 考虑磷酸化状态的SHIP-1 (底图)的抗体温育。印迹下的数字代表对 SHIP-1加样标准化的密度测定值。图3D:在接触扎木单抗之前，将 细胞与Src激酶抑制剂PP2或虎刺素(DAM)预温育。将印迹与Dok-l (顶图)或GST (底图)的抗体温育。印迹下的数字代表对GST加样标准 化的密度测定值。此处显示的实验结果代表4个独立实验。
发明详述
本发明提供CD4结合肽(例如抗CD4抗体或其抗原结合片段)或 含所述CD4结合肽的药盒组件用于改善恶性疾病或炎性皮肤病的治 疗的方法和用途，包括使用与辐射和/或补骨脂素组合的CD4结合肽。
在一个实施方案中，本发明涉及用于在接受或将接受辐射治疗的 个体中治疗恶性疾病或炎性皮肤病的CD4结合肽，例如抗CD4抗体 或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明涉及用于和辐射治疗组合治疗恶性疾
病或炎性皮肤病的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段。 在一个实施方案中，本发明涉及CD4结合肽(例如抗CD4抗体或
其抗原结合片段)在制备用于在接受或将接受辐射治疗的个体中治疗
恶性疾病或炎性皮肤病的药物组合物中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及CD4结合肽(例如抗CD4抗体或
其抗原结合片段)在制备用于和辐射治疗组合治疗恶性疾病或炎性皮
肤病的药物组合物中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗恶性疾病或炎性皮肤病的方
法，其包括给予其需要的患者治疗有效量的CD4结合肽，例如抗CD4
抗体或其抗原结合片段，并对所述患者进行辐射治疗。
在一个实施方案中，本发明涉及含CD4结合肽(例如抗CD4抗体 或其抗原结合片段)、补骨脂素连同药学上可接受的赋形剂用作药物的 药盒组件。
在一个实施方案中，本发明涉及含CD4结合肽(例如抗CD4抗体 或其抗原结合片段)和补骨脂素连同药学上可接受的赋形剂用作治疗 恶性疾病或炎性皮肤病的药物的药盒组件。
在一个实施方案中，本发明涉及含CD4结合肽(例如抗CD4抗体 或其抗原结合片段)和补骨脂素连同药学上可接受的赋形剂用作和辐 射治疗组合治疗恶性疾病或炎性皮肤病的药物的药盒组件。
在一个实施方案中，本发明涉及CD4结合肽(例如抗CD4抗体或 其抗原结合片段)和补骨脂素在制备用于治疗恶性疾病或炎性皮肤病 的药盒组件中的用途。所述药盒组件可包含多剂量形式或单位剂量形 式的CD4结合肽。同样，所述药盒组件可包含多剂量形式或单位剂量 形式的补骨脂素。下文描述了适宜的单位剂量。
在一个实施方案中，本发明涉及CD4结合肽(例如抗CD4抗体或 其抗原结合片段)和补骨脂素在制备用于和辐射组合治疗恶性疾病或 炎性皮月夫病的药盒组件中的用途。所述药盒组件可包含多剂量形式或单位剂量形式的CD4结合肽。同样，所述药盒组件可包含多剂量形式
或单位剂量形式的补骨脂素。下文描述了适宜的单位剂量。
在一个实施方案中，本发明的化合物用于治疗难以治疗的疾病。 在一个实施方案中，本发明化合物用于治疗癌症或炎性皮肤病，其中 所述疾病抗另一种治疗方法。
关于本文描述的CD4结合肽的术语肽包括能够结合CD4的任何 适宜的肽，并可与术语多肽和蛋白同义使用，除非案中另有说明或相 抵触；只要读者认识到含相应氨基酸聚合物的每种类型的分子均可伴 有显著差异，并由此构成本发明的单个实施方案(例如，由多条肽链组 成的肽，例如抗体，与例如单链抗体、肽免疫粘附素或单链免疫原性 肽显著不同)。因此，术语肽在本文一般应理解为指任何适宜大小和组 成(就蛋白分子中氨基酸的数量和相关链的数量而言)的任何适宜的 肽。而且，在本文描述的本发明方法和组合物范围内的肽可包含非天 然的和/或非L型氨基酸残基，除非案中另有说明或相抵触。
如在本文中进一步的论述，除非案中另有说明或相抵触，否则术 语肽(以及如作为术语多肽和/或蛋白的单个实施方案讨论)还包括衍化 的肽分子。简而言之，在本发明背景下，衍生物是这样的肽其中肽 的一个或多个氨基酸残基已被化学修饰(例如经由烷基化、酰化、酯形 成或酰胺形成)或与一个或多个非氨基酸有机和/或无机芳香族或分子 取代基(例如聚乙二醇(PEG)基团、亲脂取代基(其任选地可通过间隔基 或基团如(3-丙氨酸、，氨基丁酸(GABA)、 L/D-谷氨酸、琥珀酸等连接 至该肽的氨基酸序列)、荧光团、生物素、放射性核素等)结合，并另 外或或者可包含非必需的、非天然的和/或非L型氨基酸残基，除非案 中另有说明或相抵触(但是，又应当认识到，这些衍生物本身并自然而 然地可被看作是本发明的独立特征，将这些分子包含在肽的含义中是 为了便于描述本发明，而不是暗示原初肽和这些衍生物之间的任何程 度的等同)。这些氨基酸残基的非限制性实例包括例如2-氨基己二酸、 3-氨基己二酸、f3-丙氨酸、P-氨基丙酸、2-氛基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基已酸、2-氨基庚酸、2-氛基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、 2,4-二氨基丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氛基丙酸、N-乙 基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯 氨酸、4-羟基-脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-曱基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨 酸、鸟氨酸和斯塔提尼卣化氨基酸。
CD4结合肽指在细胞和/或生理条件下特异性结合一部分CD4的 任何肽，结合的时间量足以诱导、促进、增强和/或调节与CD4相关 的生理作用；允许通过ELISA、蛋白质印迹或本文描述的和/或本领域 已知的其它类似的适宜蛋白结合技术检测；和/或在相关的时间段(例 如至少约15分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、 至少约2小时、至少约4小时、至少约6小时、至少约12小时、约 1-24小时、约1-36小时、约1-48小时、约1-72小时、约1周或更长) 后可检测地与其结合。
CD4结合肽是特异性结合CD4的肽。按照本发明使用的CD4结 合肽可通过本领域已知的任何肽制备方法制备，例如合成生产或重组 生产。
CD4结合抗体或抗CD4抗体或其功能等同物可为本领域已知的 任何形式的抗体，例如来源于哺乳动物的天然抗体或合成抗体，例如 单链抗体、双功能抗体、单价抗体或含抗体片段的杂种，它们能够特 异性结合CD4，例如人CD4。而且，所述抗体可为单克隆抗体或人工 多克隆抗体的混合物。
设想用于本发明的抗体因此可为多种形式中的任一种，包括天然 抗体、完整免疫球蛋白、抗体片段(例如Fv、 Fab、 Fab'、 F(ab')2和类 似片段)、包括可变结构域互补决定区(CDR)的单链抗体、双功能抗体 和;波归入本文使用的广义术语"抗体，，的所有形式。抗体还可以为在 本文使用的广义术语"抗体"内的鼠、嵌合、人源化或人抗体。
本文使用的术语"天然抗体"适用于结构类似于天然存在的抗体结构的抗体。按照本发明使用的天然抗体属于叫做免疫球蛋白的血浆 蛋白家族，其基本结构单元免疫球蛋白折叠或结构域以多种形式用于 免疫系统和其它生物识别系统的众多分子。典型的免疫球蛋白具有4 条多肽链，包含^f皮称为可变区的抗原结合区以及针对每种抗体(亚)型 的被称为恒定区的非可变区。
本文使用的天然抗体和免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿的异 四聚化糖蛋白，由两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链组成。通常， 每条轻链都通过一个或多个共价二硫键连接至重链，而二硫键的数量 在不同免疫球蛋白同种型的重链之间是可变的。每条重链和轻链还具 有有规则间隔的链内二硫4定。每条重链都在一个末端具有可变结构域 (Vh),后接众多恒定结构域。每条轻链都在一个末端具有可变结构域 (Vl)，而在其另一个末端具有恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链 的第一个恒定结构域配对，而轻链可变结构域与重链的可变结构域配 对。 一般认为特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界 面(Novotny J, & Haber E. Proc Natl Acad Sci USA. 82(14):4592-6， 1985)。
根据它们的重链恒定结构域的氩基酸序列，可将免疫^求蛋白指定 为不同类型。有至少5种主要的免疫球蛋白类别IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和IgM，其中的几个可再分为亚类(同种型)，例如IgGl、 IgG2、 IgG3 和lgG4; IgAl和IgA2。编码不同类免疫球蛋白的重链恒定基因节段 分别叫做a、 5、 ￡、 y和fi。抗体的轻链可基于它们的恒定结构域的氨 基序列而被指定为两种明显不同的型之一，叫做k和X。不同类免疫球 蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
在抗体可变结构域范围内术语"可变的"指可变结构域的某些部 分在抗体之间的序列方面广泛不同的事实。可变结构域用于结合，并 决定了每个特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是均匀 地分布在抗体的整个可变结构域中。其集中在3个节段中，这些节段 叫做互补决定区(CDR),也称为高可变区，两个在轻链可变结构域中，一个在重链可变结构域中。
可变结构域的更高度保守的部分叫做构架(FR)。天然重链和轻链 的可变结构域各包含4个FR区，大部分采用f3-折叠构型，通过3个 CDR连接，它们形成环形连4妻，在某些情况下形成部分的(3-折叠结构。 各条链中的CDR通过FR区紧密保持在一起，来自其它链的CDR有 助于形成抗体的抗原结合位点。恒定结构域不直接参与抗体与抗原结 合，但表现出多种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性作 用。
术语"抗体片段"指全长抗体的一部分， 一般来说指抗原结合区 或可变区。抗体片段的实例包括Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段。抗体 的木瓜蛋白酶消化产生两个叫做Fab片段的相同抗原结合片段，它们 各自具有单个抗原结合位点，以及通常针对其容易结晶的能力而所说 的"Fc"片段。胃蛋白酶处理产生具有两个能够交联抗原的抗原结合 片段的F(ab')2片段，以及残余的其它片段(其被称为pFc')。其余的片 段可包括双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的 多特异性抗体。
术语"抗体片段，，在本文可与术语"抗原结合片段，，互换使用。 抗体片段保留了某些结合其抗原的能力。某些类型的抗体片段如 下定义
(1) Fab是含抗体分子的单价抗原结合片段的片段。Fab片段可 通过用酶木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生完整轻链和一条 重链的一部分而产生。
(2) Fab'是可如下获得的抗体分子片段用胃蛋白酶处理完整抗 体，接着还原，以产生完整轻链和一部分重链。每个抗体 分子获得两个Fab'片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处在 于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来 自抗体铰链区的 一个或多个半胱氨酸。
(3) (Fab')2是可通过用酶胃蛋白酶处理完整抗体获得的抗体片段，无需随后的还原。
(4) F(ab')2是通过两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二 聚体。
Fv是包含完整抗原识别和结合位点的'J、抗体片段。该区域由 一条 重链和一条轻链可变结构域的紧密、非共价結合的二聚体(Vh-V^二聚 体)组成。就是在此构型中每个可变结构域的3个CDR相互作用，限 定了 Vh-Vl二聚体表面上的抗原結合位点。总之，6个CDR赋予了对 抗体的抗原结合特异性。然而，即便是单个可变结构域(或仅含3个对 抗原特异性的CDR的一半Fv)也可具有识别和结合抗原的能力，但亲 和力经常比完整结合位点低。即使是单个CDR，特别地是CDR3结构 域，最特别地是重链的CDR3结构域，对抗原识别也可能是足够的(参 见例如Deng和Notkins, 2000, Clin. Exp. Immunol. 119:69-76)。因此， 包含在本发明中的是抗体的抗原结合片段可包含单个可变结构域乃 至单个CDR，例如CDR3，如一个或多个拷贝的重链CDR3。
单链抗体("SCA")定义为包含通过适宜的多肽接头连接为遗传融 合的单链分子的轻链可变区、重链可变区的遗传工程过的分子。这些 单链抗体也被称为"单链Fv"或"sFv，，抗体片段。 一般来说，Fv多肽还 包含VH和VL结构域之间的多肽接头，该接头能够使sFv形成用于 抗原结合的期望结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun，载于"The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" 113, 269-315, Rosenburg和 Moore编辑，Springer-Verlag, NY, 1994 。
按照本发明使用的抗体还可为双功能抗体。"双功能抗体"指具有 两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同 一多肽链(VH-VL)中 包含连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太 短以至于不允许在相同链的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域 与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双功能抗体 更全面地描述于例如EP 404097; WO 93/11161,以及Hollinger等，Proc. Natl. Acad Sci. USA巡，6444- 6448 (1993)。本发明设想了抗CD4的多克隆和单克隆抗体这二者及其抗原结 合片段，它们具有以下的至少一项或多项，例如以下的至少2项，例 如以下的至少3项，例如以下的至少4项，例如以下的至少5项，例 如以下的至少6项，例如以下的至少7项，例如以下的至少8项，例 如以下的全部
-通过p56kk诱导ot-酪蛋白的磷酸化，
-诱导p56^自体磷酸化，
-诱导抑制性衔接分子Dok-l和/或SHIP-1和/或SfflP-2的^岸酸化，
-诱导p56^介导的Dok-l磷酸化，
-PKB/Akt途径的抑制，
-远离TCR的CD4隐匿，
-增加和/或上调p53表达，
-诱导细胞周期的Gl期停滞或延长，
-增加CD4+细胞、优选CD4+ T细胞对辐射的敏感性。
多克隆抗体的制备在本领域众所周知。参见例如Green等， "Production of Polyclonal Antisera"， 载于Immunochemical Protocols (Manson编4尋)，1-5页(Humana Press, 1992); Coligan等，"Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats Mice and Hamsters", 载于Current Protocols in Immunology, 2.4.1章，这些文献在此引入作为参考。
单克隆抗体的制备同样是常规的。参见例如Kohler & Milstein, Nature 2^,495-497 (1975); Coligan等，出处同上，2.5.1-2.6.7章；和 Harlow等，载于"Antibodies: A Laboratory Manual", 726页，Cold Spring Harbor Pub. (1988)。单克隆抗体可通过多种已确立的技术由杂交瘤培 养物分离和纯化。这些分离技术包括采用A蛋白Sepharose的亲和层 析、大小排阻层析和离子交换层析。参见例如Coligan等，出处同上， 2.7.1-2.7.12章和2.9.1-2.9.3章；Barnes等，"Purification of Immunoglobulin G (IgG)"， 载于Methods in Molecular Biology,辺， 79-104, Humana Press, NY (1992)。体外和体内操作单克隆抗体的方法是本领域技术人员众所周知
的。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler & Milstein, Nature 2^, 495-497 (1975)描述的杂交瘤法制备，或者可通过 重组方法制备。用于本发明的单克隆抗体还可以使用描述于Clackson 等，Nature M2, 624-628 (1991)以及Marks等，J Mol Biol 222, 581-597 (1991)的技术由噬菌体抗体文库分离。另一个方法涉及通过重组方法 人源化单克隆抗体，以产生含人特异性和可识别序列的抗体。关于综 述参见Holmes等，J Immunol 1^. 2192-2201 (1997)和Vaswani等, Annals Allergy, Asthma & Immunol 105-115 (1998)。
本文使用的术语"单克隆抗体"指得自显著同源的抗体群的抗体， 即所述群包含的单个抗体是相同的，可少量存在的可能天然突变除 外。单克隆抗体是高度特异性的，抗单个抗原性位点或表位。而且， 与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的常规多克隆抗体制备物 相反，每个单克隆抗体均抗抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性 以外，单克隆抗体的有利之处在于它们通过杂交瘤培养物合成，未受 其它免疫球蛋白污染。表示抗体特征的修饰语"单克隆(的)"表明了由 显著同源的抗体群获得的抗体的特征，不能被解释为需要通过任何特 定方法生产抗体。
本文的单克隆抗体包括"嵌合"抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重 链和/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中 的对应序列相同或同源，而链的剩余部分与来源于另一个物种或属于
同或同源，只要它们表现出期望的生物活性(US 4816567); Morrison 等，Proc Natl Acad Sci ￡1, 6851-6855 (1984)。
在一个实施方案中，本文的抗体包括能够活化抗体依赖性细胞介 导的细胞毒性(ADCC)的抗体。在其它实施方案中，本文的抗体包括能 够活化天然杀伤(NK)细胞的抗体。在一个实施方案中，本文的抗体包 括能够与NK细胞上的FcyRIII (CD16)受体相互作用的抗体。在又一个实施方案中，本文的抗体属于IgGl或IgG3亚类。
制造抗体片段的方法在本领域也是已知的(参见例如Harlow等， 载于"Antibodies: A Laboratory Manual", 726页，Cold Spring Harbor Pub. (1988)，该文献在此引入作为参考)。本发明的抗体片段可通过蛋白水 解抗体或通过在大肠杆菌中表达编码该片段的DNA制备。抗体片段 可通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体的常规方法制备。例如， 可通过用胃蛋白酶酶切抗体产生抗体片段，以提供称为F(ab'》的5S 片段。该片段可使用硫醇还原剂和任选地用于由二硫键切割产生的巯 基的封闭基团进一步切割，以产生3.5SFab'单价片段。或者，使用胃 蛋白酶酶切直接产生两个单价Fab'片段和Fc片段。这些方法描述于例 如US 4036945和US 4331647以及其中包含的参考文献。这些专利整 体在此引入作为参考。抗体片段还可以使用重组技术制备。
还可以使用其它切割抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻链 -重链片段，再切割片段，或其它酶促、化学或遗传技术，只要所述片 段结合由完整抗体识别的抗原。例如，Fv片段包含Vh和VL链的结合。 此结合可为非共价的，或者可变链可通过分子间二辟u键连4^或通过化 学品如戊二醛交联。Fv片段例如可包含通过肽接头连接的Vh和Vl 链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建结构基因制备，所述结构基 因包含的DNA序列编码通过寡核苷酸连接的Vh和ViJ吉构域。将结 构基因插入到表达载体中，随后将该表达载体导入到宿主细胞如大肠 杆菌中。重组宿主细胞合成具有桥联两个V结构域的连接肽的单一多 肽链。生产sFv的方法描述于例如Whitlow等，载于"Methods: A Companion to Methods in Enzymology" ， 2, 97 (1991); Bird等，Science 242, 423-426 (1988), US 4946778;和Pack等，BioTechnology U, 1271-1277 (1993)。
另一种形式的抗体片段是编码单一互补决定区(CDR)如CDR3的 肽。CDR肽("最小识别单元")经常参与抗原识别和结合。CDR肽可 通过克隆或构建编码目标抗体的CDR的基因获得。这样的基因例如通过使用聚合酶链反应制备，以由生产抗体的细胞的RNA合成可变 区。参见i列力口 Larrick等， "Methods: a Companion to Methods in Enzymology",第2巻，106页(1991)。
本发明还设想使用人或人源化形式的非人(例如小鼠或大鼠)抗 体。此人源化抗体为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如 Fv、 Fab、 Fab'、 F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，它们包含来源 于非人免疫球蛋白的最小序列，例如表位识别序列。人源化抗体多半 为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的一个或多个互补决定区 (CDR)的残基被具有预期特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体) 如小鼠、大鼠或兔的一个或多个CDR的残基置换。
在一个实施方案中，单克隆抗体为"人，，抗体(免疫球蛋白)。人抗 体例如可使用转基因非人动物制备。这样的动物用于生产异源抗体， 有用的方法是本领域技术人员众所周知的。携带功能性异源免疫球蛋 白转基因的转基因动物的构建是一种通过其可生产与自身抗原反应 的抗体的方法。首先，用作B细胞源的已免疫动物必须产生抗提呈抗 原的免疫应答。为了使动物产生免疫应答，提呈的抗原必须是外源的， 动物必须不耐受该抗原。依照本发明，所述抗原为CD4，例如，人 CD4或其片段或包含至少一个CD4表位的(多)肽。制备人抗体的适宜 方法的实例描述于例如WO 97/13852, 80-98页"具体的优选实施方案" 之下和其中包含的参考文献。在一个实施方案中，本发明涉及能够结 合CD4的单克隆人抗体。
在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被对应的非人残基 置换。而且，人源化抗体可包含既不在受体抗体中存在也不在导入的 CDR或构架序列中存在的残基。实施这些修饰是为了进一步精制和优 化抗体性能。通常，人源化抗体基本上全部都包含至少一个、通常两 个可变结构域，其中全部或基本上全部的CDR区都对应于非人免疫 球蛋白的CDR区，全部或基本上全部的FR区都为人免疫球蛋白共有 序列的FR区。人源化抗体最好还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常为人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步的细节，参见Jones 等，Nature 121, 522-525 (1986); Reichmann等，Nature巡，323-329 (1988); Presta, Curr Op Struct Biol 2, 593-596 (1992); Holmes等，J Immunol 158,2192-2201 (1997)和Vaswani 1998,出处同上)。
可使用天然或重组人CD4多肽或其片段作为抗原，通过本领域 用于生产多克隆和单克隆抗体的任何标准方法，实现抗体的产生。在 一个实施方案中，所述抗体可使用天然或重组产生的CD4、 CD4片,殳 或包含至少一个天然CD4上存在的表位的(多)肽产生。所述CD4例如 可为人CD4。
在一个实施方案中，本发明涉及能够抑制与细胞周期调节相关的 CD4生物功能的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明涉及能够如本文所述结合CD4上的 特定表位并由此抑制与细胞周期相关的CD4蛋白功能的CD4结合肽， 例如抗CD4抗体或其抗原结合片段。
所述术语"表位"意指(抗原分子上)特定组的氨基酸，其由针对该 抗原的抗体识别。术语"表位，，与术语"抗原性决定簇"等同。表位可包 含3个或更多个氨基酸残基，例如4、 5、 6、 7、 8个氨基酸残基，所 述氛基酸残基紧邻定位，'例如在连续的氛基酸序列中，或者位于抗原 的氨基酸序列的远离部分中，但由于蛋白折叠而彼此接近。
依照本发明使用的抗体能够结合CD4表位，例如人CD4 (关于人 CD4序列，参见例如(Maddon PJ等，Cell. 42(1), 93-104 (1985))的表位。 在一个实施方案中，所述表位位于CD4的胞外结构域中。在一个实施 方案中，所述表位位于参与TCR结合的CD4结构域中。在一个实施 方案中，所述抗体与Leu3A竟争结合CD4 (Fishwild等，Nat Biotechnol. 14(7), 845-51 (1996))。非抗体CD4结合肽可能也能够结合这样的表位。
本文使用的与CD4特异性结合指CD4结合肽如抗CD4抗体或其 抗原结合片段以至少lxl(T7 M的亲和力、例如以至少lxl(T8 M的亲 和力、例如1 xl(T9 M、例如1 x 1(T1Q M结合CD4的能力。术语"优先结合CD4"在本文指CD4结合肽如抗CD4抗体或其抗 原结合片段以上述亲和力结合CD4的特性，其中对CD4的亲和力为 其结合CD4或与CD4密切相关的多肽之外的非特异性抗原(例如 BSA、酪蛋白)的亲和力的至少2倍，例如至少5倍以上，例如至少 IO倍以上。
术语"选择性结合CD4"在本文指CD4结合肽如抗CD4抗体或其 抗原结合片段以上述亲和力结合CD4的特性，其中对CD4的亲和力 为对任何其它多肽的亲和力的至少2倍，例如至少5倍以上，例如至 少IO倍以上。
本发明涉及CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段， 其能够调节CD4如人CD4的至少一种生物活性，例如与细胞周期调 节相关的活性。在一个实施方案中，CD4结合肽，例如抗CD4抗体 或其抗原结合片段，能够调节在上文"发明概述"章节中提及的一种或 多种活性。
在本文内容下，所述术语"调节"指能够增强或减弱人CD4的生物 活性的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段。在一个实 施方案中，本发明的特征在于CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗 原结合片段，其能够调节CD4的至少一种生物活性，例如诱导细胞在 细胞周期的Gl期延长或停滞。在一个实施方案中，依照本发明使用 的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段，能够诱导细胞 周期的Gl期的延长或停滞。这可通过包括以下步骤的方法测定
1) 使CD4+细胞群接触CD4结合肽；
2) 测定Gl期的细胞数目；和
3) 比较所述数目与一直未接触CD4结合肽的群中处于Gl期的细 胞数目，其中Gl的延长或停滞被定义为与CD4结合肽接触的 细胞群中处于Gl的细胞数目。
Gl期的细胞数目可通过不同方法测定，例如通过染色DNA，其 中具有2nDNA含量的细胞被说成为处于Gl。还有可能测定Gl的一种或多种标记的存在情况，即主要存在于细胞周期的Gl期的蛋白或 其它化合物。
在一个实施方案中，所述细胞为肿瘤细胞。在一个实施方案中， 所述胂瘤细胞为癌细胞或血液学恶性细胞。所述癌细胞可来自原发性 或转移性癌症。具体地说，所述细胞可为下文在"临床疾病"章节中所 述的任何癌症。
依照本发明使用的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合 片段，可能能够通过p56kk诱导为外源性p56kk底物的a-酪蛋白的磷酸 化。a-酪蛋白的磷酸化的诱导例如可通过包括以下步骤的方法测定
1) 使CD4+细胞接触CD4结合肽；
2) 制备所述细胞的裂解物；
3) 使裂解物与a-酪蛋白接触，
4) 测定oc-酪蛋白的磷酸化；和
5) 比较所述磷酸化和使用由另一种一直未接触CD4结合肽得细 胞制备的裂解物获得的磷酸化，其中磷酸化的诱导被定义为用 与CD4结合肽接触的细胞的裂解物获得的较高程度的磷酸化。
所述方法任选地还可包含由裂解物分离CD4以及含CD4的复合 物的步骤。该步骤例如可在步骤2和3之间实施。这例如可通过使用 CD4抗体的常规免疫沉淀技术实现。该步骤可确保仅检测到与CD4 相关的激酶活性。
磷酸化可通过任何常规方法确定，例如通过使用磷酸化特异性抗 体或通过使用放射性标记的磷酸盐，例如得自32P"ATP。
一种测定a-酪蛋白磷酸化的方法公开于下文的实施例2 。
依照本发明使用的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合 片段，能够诱导p56kk自体磷酸化。给定CD4结合肽对p56kk自体磷 酸化的诱导可通过包含以下步骤的方法测定
1) 使CD4+细胞与CD4结合肽接触；
2) 制备所迷细胞的裂解物；3) 分离包含p56kk的复合物；
4) 测定p56^的磷酸化；和
5) 比较所述^^粦酸化和使用由另一种一直未接触CD4结合肽的细 胞制备的裂解物获得的磷酸化，其中磷酸化的诱导被定义为用 与所述抗体接触的细胞的裂解物获得的较高程度的磷酸化。
包含p56kk的复合物的分离可通过众多不同方法获得，例如通过 使用p56^特异性抗体或已知结合p56lek的蛋白如CD4抗体免疫沉淀。 ^畴酸化可如上测定。 一种测定p56kk自体力痒酸化的方法描述于下文的 实施例2。
依照本发明使用的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合 片段，能够增加和/或上调p53表达。给定CD4结合肽对p53表达的 增加和/或上调可通过包含以下步骤的方法测定
1) 使CD4+细胞与CD4结合肽接触；
2) 测定p53表达；和
3) 比较所述表达和另 一种一直未接触CD4结合肽的细胞中的p53 表达，其中p53表达的增加和/或上调-波定义为与CD4结合肽 接触的细胞中较高的p53表达水平。
p53表达可通过众多常规方法测定。这例如可使用p53抗体通过 例如蛋白质印迹实现。
依照本发明使用的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合 片段，能够诱导Dok-l和/或SHIP-1和/或SHIP-2的磷酸化。给定CD4 结合肽对磷酸化的诱导可通过包含以下步骤的方法测定
1) 使CD4+细胞与CD4结合肽接触；
2) 制备所述细胞的裂解物；
3) 分离包含Dok-l和/或SHIP-1和/或SHEP-2的复合物；
4) 测定Dok-l和/或SfflP-l和/或SfflP-2的-岸酸化；和
5) 比较所述磷酸化和使用由另一种一直未接触CD4结合肽的细 胞制备的裂解物获得的磷酸化，其中磷酸化的诱导被定义为用与CD4结合肽接触的细胞的裂解物获得的较高程度的磷酸化。
包含Dok-l和/或SHIP-1和/或SfflP-2的复合物的分离可通过众 多不同方法获得，例如通过使用结合Dok-l和/或SHIP-1和/或SHIP-2 的化合物或结合Dok-l和/或SfflP-l和/或SfflP-2的蛋白沉淀。所述 化合物可为抗体。但是，所述化合物还可为SH2。磷酸化可如上所述 测定。 一种测定Dok-l和/或SHIP-1 ^畴酸化的方法描述于下文的实施 例2。
依照本发明使用的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合 片段，能够增加CD4+细胞、例如CD4+T细胞、例如人CD4+T细胞 对辐射的敏感性。这可通过包含以下步骤的方法测定
1) 使CD4+细胞、例如CD4+ T细胞、例如人CD4+ T细胞与CD4 结合肽接触；
2) 对细胞进行辐射；
3) 测定细胞死亡，例如细胞凋亡；和
4) 比较所述细胞死亡和在一直未接触CD4结合肽的细胞中获得 的细胞死亡，其中敏感性增加被定义为与CD4结合狀接触的细 胞中较高程度的细胞死亡，例如凋亡。
所述辐射可为任何辐射，例如UV。大量适宜测定凋亡的方法是 技术人员已知的。适宜方法的非限制性实例为膜联蛋白-V染色法、半 胱天冬酶(caspase)活性测定、对半胱天冬酶切割产物的存在情况的测 定。用碘化3,3'-二己基氧杂羰花青染色或膜完整性测定。测定CD4+ 细胞对辐射敏感性的方法的实例描述于下文的实施例3、 4、 5和6。
依照本发明使用的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合 片段，可在一个实施方案中引起远离TCR的p56^隐匿。另外，CD4 结合肽可通过p56^直接产生负信号。因此，依照本发明使用的CD4 结合肽经常可通过抑制经由TCR的信号转导，潜在地通过远离TCR 的p56^隐匿，还通过直接抑制信号转导，介导其对T细胞信号转导 的抑制性作用。在本发明的一个实施方案中，CD4结合肽可引起p5一k激酶活化，该活化又可导致增加的Dok-l和/或SfflP-l磷酸化。
在本发明的一个实施方案中，CD4结合肽是专利申请 W097/13852中公开的任一种抗CD4抗体。例如，所述抗体可为如在 所述申请中所述能够结合CD4的任何鼠抗体，例如Leu 3a、 RPA-TA、 92-09A-4F7-A5-2 或 92-09A-1D7-1-7-1 、 92國09A画4f7-A5-2 和 92-09A-1D7-1-7-1,它们已按照布达佩斯/>约分别以保藏号HB 11307 和HB 11308保藏于ATCC专利培养物保藏机构。在一个实施方案中， CD4结合肽是人抗体，例如在所述申请中所述的2Cll-8、 1F2、 1E11、 2E4、 4D1、 6C1、 6G5、 7G2、 10C5、 1G1、 1G2、 2C5.1或4E4.2。在 所述申请中尤其描述了 2C5.1和4E4.2的VDJ接合处的序列。在一个 实施方案中，CD4结合肽是如在所述申请中描述的6G5。 6G5的VH 和Vl序列在困1中给出。
在本发明的一个实施方案中，CD4结合肽选自扎木单抗(GenMab, Denmark,也称为Humax-CD4和HM6G (Fishwild等，Clin Immunol. 22(2), 138-52 (1999),与在W097/13852中描述的6G5相同)、凯利昔 单抗(也称为IDEC-CE9.1、 IDEC)、克立昔单抗(也称为IDEC-151、 IDEC) 、 TNX/355 (也称为 Hu-5A8， Tanox, Biogen) 、 TRX/1 (TolerRx/Genentech)、 10T4a (也称为13B8.2, Immunotech)、普立昔单 抗(也称为cM-T412， Centocor)和4162W94 (Glaxo)。在本发明的某些实 施方案中，CD4结合肽^皮人源化或为人抗体。因此，在这些实施方案 中，抗体可选自扎木单抗、TNX/355、 TRX/1、 10T4a和4162W94。 在本发明的一个实施方案中，CD4结合肽为扎木单抗。
还包含在本发明中的是，CD4结合肽可为包含重链和/或轻链的 至少VDJ接合处的任何抗体或包含例如选自以下的抗体的重链的至 少CDR3或例如至少全部CDR (例如抗体的至少一个可变区，例如两 个可变区)的抗体:扎木单抗、凯利昔单抗、克立昔单抗、TNX/355、 TRX/1、 10T4a、普立昔单抗和4162W94,或选自在W097/13852中 公开的Leu 3a、 RPA-TA、 92-09A-4F7誦A5-2 、 92-09A-1D7-1誦7國1 、 2C11 -8 、1F2、 1E11、 2E4、 4D1、 6C1、 6G5、 7G2、 10C5、 1G1、 1G2、 2C5.1 和4E4.2。
在一个实施方案中，依照本发明使用的CD4结合肽是能够特异 性结合由抗体识别的表位或与由抗体识别的表位重叠的CD4结合肽， 例如抗CD4抗体或其抗原结合片段，所述识别抗体选自扎木单抗、凯 利昔单抗、克立昔单抗、TNX/355、 TRX/1、 10T4a、普立昔单抗和 4162W94,或选自在W097/13852中公开的Leu 3a、 RPA-TA、 92-09A画4F7-A5-2、 92醫09A國1D7-1画7画1 、 2Cll-8、 1F2、 1E11、 2E4、 4D1、 6C1、 6G5、 7G2、 10C5、 1G1、 1G2、 2C5.1和4E4.2。
本领域技术人员可用的不同测定可用于测定CD4结合肽，例如 抗CD4抗体或其抗原结合片段，(也称为测试CD4结合肽)，是否识别 与特定单克隆抗体(也称为参比抗体)相同或重叠的表位。例如，所述 测定包括以下步骤
-提供包含由参比抗体识别的表位的CD4或其片段 -将测试CD4结合肽和参比抗体加至所述CD4，其中测试CD4 结合肽或参比抗体用可检测标记来标记。或者，测试CD4结合 肽和参比抗体均可用不同的可4企测标记来标记 -检测所述可检测标记在CD4上的存在情况 -由此检测出测试CD4结合肽能否替代参比抗体。 如果测试CD4结合肽能够替代参比抗体，则测试CD4结合肽识 别与参比抗体相同或重叠的表位。因此，如果参比抗体用可检测标记 来标记，那么针对CD4的低的可检测信号指示参比抗体的替代。如果 测试CD4结合肽用可^r测标记来标记，那么针对CD4的高的可检测 信号指示参比抗体的替代。CD4片段例如可固定在能够容易处理的固 体支持体上。可检测标记可为任何直接或间接可检测标记，例如酶、 放射性同位素、重金属、有色化合物或荧光化合物。
依照本发明使用的CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合 片段，可通过药学领域已知用于递送蛋白和抗体的任何方法给予患者。诸如抗体的肽尤其适合于胃肠外给予。胃肠外给予例如可经由皮 下、肌内或静脉内给予，包括灌输或注射。本发明的药物组合物还适
于使用替代药物递送方法给予(参见例如Langer, Science, 242, 1527-1533 (1990))。
用于胃肠给予的药物组合物通常包含CD4结合肽(例如CD4结合 肽，例如抗-CD4抗体或其抗原结合片段，例如单克隆抗体)溶解在可 接受载体如水性载体中的溶液。可使用多种水性载体，例如水、緩冲 水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸等。这些溶液是无菌的， 一般没有颗粒物 质。这些组合物可通过众所周知的常规除菌技术除菌。这些组合物还 可通过众所周知的常规技术进行病毒减少或多重病毒减少。组合物可 根据需要包含药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如pH 调节剂和緩冲剂、渗透压调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、 乳酸钠等。CD4结合肽(例如抗CD4抗体或其抗原结合片段)在这些制 剂中的浓度可广泛变化，例如以重量计由少于约0.5%、通常为或至少 约0.1%至多达1.5%或2.0%乃至更高，并将按照选定的具体给予方式 主要基于液量、粘度等选择。制备胃肠外施用的组合物的实际方法对 本领域技术人员是已知的或显而易见的，更详细地描述于例如 Remington's Pharmaceutical Sciences, 第 17 版，Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1985)，该文献在此引入作为参考。
其它有用的制剂是适合于鼻和肺施用的制剂，例如吸入剂和气溶胶。
CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段，可配制为中 性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽化合物的游离M 形成)，其与无机酸形成，例如盐酸或磷酸，或与诸如乙酸、草酸、酒 石酸、扁桃酸等的有机酸形成。与游离羧基形成的盐还可以来自无机 碱，例如氬氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，诸 如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。
注射剂通常^f皮制备为液体溶液或悬浮液、适于在注射前溶解在或悬浮在液体如无菌水中的固体形式。制备物还可以被乳化。活性成分 经常与药学上可接受的并与活性成分相适的赋形剂混合。适宜的赋形 剂例如为水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其组合。另外，如 果期望的话，制备物可包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、盐、 pH緩沖剂或增强制备物的有效性或转运的物质。
可施用包^^依照本发明使用的CD4结合肽(例如抗CD4抗体或其 抗原结合片段)或其混合物的组合物，用于治疗处置恶性疾病、炎性皮 肤病或用于调节临床疾病的辐射治疗。在治疗应用中，组合物以有效 量、必需的剂量和时间段给予患者，以实现预期治疗结果。在本发明 背景下，这样的量被定义为"治疗有效量，，。CD4结合肽(例如抗CD4 抗体或其抗原结合片段)的治疗有效量可依据诸如个体的病况、年龄、 性别和体重的因素以及CD4结合肽在个体中激发期望的响应的能力 而变化。治疗有效量还是其中治疗有益作用胜于CD4结合肽(例如抗 CD4抗体或其抗原结合片段)的任何毒性或有害作用的量。
依照本发明使用的治疗有效量的CD4结合肽可由临床医师确定， 这是本领域技术人员已知的。例如，对于表面或局部应用，CD4结合 肽的量可低于单次系统疗法，由此可减少或避免潜在的系统性副作用 (例如CD4+细胞的系统性清除)。剂量例如可在20 mg-2000 mg的范围 内，例如在20 mg-100 mg (例如为约20 mg、约40 mg、约60 mg、约 80 mg或约100 mg的量)的范围内，或例如为约150 mg、约200 mg、 约250 mg、约300 mg、约350 mg、约400 mg、约450 mg、约500 mg、 约550 mg、约600 mg、约650 mg、约700 mg、约750 mg、约800 mg、 约850 mg、约900 mg、约950 mg、约1000 mg、约1050 mg、约1100 mg、约1150 mg、约1200 mg、约1250 mg、约1300 mg、约1350 mg、 约1400 mg、约1450mg、约1500 mg、约1550 mg、约1600 mg、约 1650 mg、约1700 mg、约1750 mg、约1800 mg、约1850 mg、约1900 mg、约1950 mg或约2000 mg的量。 一般来说，临床医师能够通过本 领域众所周知的设计用于确定适合的治疗剂量的普通实验确定适合的剂量。
对于某些实施方案，CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结 合片段，被局部给予，例如通过直接射至疾病部位。在其它实施方案 中，CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段，以系统方式 给予。
用于本发明的某些CD4结合肽有足够活性，但对于另一些，如 果制备物还包含药学上接受的添加剂和/或载体，则作用将被增强。这 样的添加剂和载体在本领域众所周知。在某些情况下，包括促进活性 物质向其靶递送的化合物将是有利的。
在本发明的一个实施方案中，在辐射治疗之前给予至少一次CD4 结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段，并且抗体每周给予至少 一次。
在本发明的一个实施方案中，在辐射治疗之前给予2、 3、 4、 5 乃至更多次CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段，并每 周给予至少一次抗体。
在本发明的一个实施方案中，在开始辐射治疗的同时给予CD4 结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片^R。
在本发明的一个实施方案中，在开始辐射治疗之后给予1、 2、 3、 4、 5乃至更多次CD4结合肽，例如抗CD4抗体或其抗原结合片段， 并每周给予至少一次抗体。
在本发明的一个实施方案中，在此过程中给予所述CD4结合肽 的时间段将是治疗有效的。给予持续时间取决于要治疗的患者(包括例 如患者的体重和年龄)、要治疗的疾病和疾病阶段。CD4结合肽的给 予时间段可在1-48周的范围内，例如在4-30周的范围内，或例如在 8-16周的范围内，例如12周。
在本发明的一个实施方案中，CD4结合肽的给予可以治疗有效的 方式重复几次。两次连续治疗之间的时间可在1-200周的范围内，例 如在4-104周的范围内，例如在24周至52周的范围内。在一个实施方案中，本发明涉及辐射治疗组合CD4结合肽(例如 抗CD4抗体或其抗原结合片段)给予治疗临床疾病的用途，例如上文 描述的任一种临床疾病，包括恶性疾病或炎性皮肤病。可使用众多辐 射治疗，例如补骨脂素和长波紫外线辐射(PUVA)、 UVB、窄谱UVB、 高剂量UVA、光分离置换法、电子束或x射线。在一个实施方案中， 本发明涉及补骨脂素和长波紫外线辐射(PUVA)。
在本发明的一个实施方案中，PUVA用作辐射治疗。补骨脂素化 合物如上所述口服或局部给予。所述补骨脂素的口服给予可如上所述 进行，例如在紫外线A(UVA)辐射治疗前至少约1小时，并在所述辐 射治疗前不超过约3小时。当补骨脂素直接应用于皮肤时，紫外线A (UVA)辐射治疗可如上所述进行，例如在l-30分钟的范围内，例如在 1-15分钟内。PUVA治疗以每个月l-10次治疗给予，例如每个月1-7 次治疗，例如每个月l-5次治疗，例如每周l-5次治疗，例如每周1-3 次治疗，例如每周l次治疗。在一个实施方案中，辐射治疗以和CD4 结合肽的给予相同的治疗间隔给予。
将依照本发明实施PUVA辐射治疗过程中的光强度，小心控制最 大辐射曝露量，以避免对患者不必要的损伤。技术人员能够容易地确 定适宜的光强度。计算对紫外光的最大辐射暴露量的方法是本领域已 知的。PUVA辐射治疗将^f吏用在例如280-440 nm范围内、例如在 320-400 nm范围内的波长的长波紫外光(UVA)进行。
依照本发明的初始UVA辐射治疗的持续时间可在10秒至20分 钟的范围内，例如在20秒至IO分钟的范围内。暴露时间在治疗与治 疗之间可逐渐增加。 一般来说，对UVA的暴露时间可在l-60分钟的 范围内，例如在l-30分钟的范围内。
补骨脂素被定义为结合细胞中的DNA并终止它们复制的众多药 物和其它物质中的任一种，是增加皮肤对用于治疗作用的光的反应的 光敏感化学物质。补骨脂素是包含平面三环结构的化合物，该结构对 核酸具有天然亲和性，可插入碱基之间，进入DNA双螺旋体的两条链之间，典型地在腺噪呤和胸腺嘧咬碱基之间。在用长波紫外光(UV) 辐射时，补骨脂素典型地共价连接至核酸，经常连接至胸腺嘧^，还 连接至尿嘧啶核香和胞嘧啶核苷，有效地将双螺旋体束缚在一起。然 后补骨脂素分子可抑制需要解开双螺旋体的过程。补骨脂素优选终止 细^>的活性，而不杀伤细^;。
在一个实施方案中，依照本发明使用的补骨脂素化合物具有以下
通式<formula>formula see original document page 44</formula>其中R!、 R2、 R3、 R4、 RV和Rs独立地选自氢、卤素、C(.即烷
基和用卣素、胺或羟基取代的C(wo)-烷基，以及任选地用羟基取代的
Cd—K))醚；或者I^和Rs—起形成吡啶并。
卣素应被用于指囟素基团，其选自氯、氟、溴和碘。 C(wo)-烷基被用于指含1-10个碳原子的烷基。烷基可为直链的或
支链的。Cd,烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁
基和戊基。
胺应被用于指结构式RaRbN-的基团，其中Ra和Rb独立地为氢或 C^.K))-烷基。在一个实施方案中，Ra和Rb均是氢。
羟基应被用于指结构式HO-的基团。
Cn.!o)-烷基-O-应被用于指含1-10个碳原子的醚基。醚基可为直链的或支链的。C(wo)-烷基-O-的实例是曱氧基、乙氧基、丙氧基、异 丙氧基、丁氧基、异丁氧基和戊氧基。
在一个实施方案中，补骨脂素化合物可选自吡啶并-[3,4-C]补骨脂
素、7-曱基吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、8-甲氧基补 骨脂素、4,5',8-三曱基补骨脂素、4-曱基补骨脂素、4,4-二曱基补骨脂 素、4-5'-二甲基补骨脂素、4',8-甲氧基补骨脂素、4'-(co-氨基-2-氧杂) 烷基-4，5',8-三曱基补骨脂素、4'-(4-M-2-氧杂)-丁基-4,5',8-三曱基补 骨脂素、4'-氯曱基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-氨基甲基-4,5',8-三甲基 补骨脂素、4'-(2-羟基乙氧基)-甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-(6-羟基 己氧基)-曱基-4，5',8-三甲基补骨脂素、4'-羟甲基-4,5',8-三曱基补骨脂 素、5-曱基-白芷素和2H-呋喃并[2,3-h][l]苯并吡喃-2-酮。
在一个实施方案中，补骨脂素可为5-曱氧基补骨脂素或8-甲氧基 补骨脂素。5-甲氧基补骨脂素例如可以商品名Pentaderm获得，而8-甲氧基补骨脂素例如以商品名Genoxalen获得。
本发明使用的补骨脂素可通过药学领域已知用于递送补骨脂素 的任何方法给予患者。补骨脂素一般适合于口服或局部给予。
包含补骨脂素的制剂可通过常规技术制备，例如描述于 Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, E.W. Martin编 辑，Mack Publishing Company,第19版，Easton, Pa。药物制剂可具有 本领域技术人员已知的任何形式。例如，药物制剂可为生物粘附和非 生物粘附的凝胶剂、粉末剂、片剂、锭剂、咀嚼片、香口胶、丸剂、 胶嚢剂、扁嚢剂、栓剂、分散颗粒剂、贴剂、棒糖、软膏剂、洗剂、 乳剂、泡沫剂、植入剂或香膏的形式。包含补骨脂素的药物制剂通常 为选自以下的形式片剂、胶嚢剂、乳剂、洗剂、凝胶或软膏剂。
含补骨脂素的制剂通常包含药学上可接受的赋形剂。这些药学上 可接受的赋形剂不必是治疗活性成分，而是所述赋形剂可为 一种或多 种可起稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、 润湿剂、片剂崩解剂或嚢化物质作用的物质。这样的JU武形剂包括但不限于药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维 素、葡萄糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、蔗糖、碳酸镁、黄芪 胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。另外，药 学上可接受的赋形剂可为着色剂、调味剂、稳定剂、纟爰冲剂、人工和 天然甜味剂、分散剂、增稠剂等。
在粉末剂中，赋形剂可为磨碎的固体，其为具有磨碎的活性组分 的混合物。在片剂中，活性组分以适宜的比例和具有必需的结合能力 的赋形剂混合，并压制成期望的形状和大小。粉末剂和片剂可包含1% 至约70%的活性化合物。
依照本发明的乳剂、软膏剂或凝胶剂是用于外部应用的活性成分
的半固体制剂。它们可如下制备将单独的或在溶液中的或悬浮在水
性或非水性流体中的、为磨碎或粉末化形式的活性成分借助于合适机 器与例如本领域技术人员已知的油脂基剂或非油脂基剂混合。 基剂的实例是可包含一种或多种烂的基剂，例如石更、软和液体石
蜡、甘油、石蜡油、蜂蜡、金属皂；胶浆剂；天然来源的油，例如杏 仁、玉米、花生、蓖麻或橄榄油或其衍生物，例如聚氧乙烯蓖麻油； 羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸和/或酯，例如硬脂酸或油酸，或豆蔻酸 异丙酯。
而且，基剂可包含醇，例如丙二醇、不同分子量的聚乙二醇(PEG)、 鲸蜡醇、乙醇或大粒凝胶。制剂可掺入任何适宜的表面活性剂或乳化 剂，例如阴离子、阳离子或非离子性表面活性剂，例如山梨糖醇酐酉旨、 聚山梨醇酯、Crem叩horEL、 Tween 20或其聚氧乙烯衍生物。还可包 括悬浮剂，例如天然胶、纤维素衍生物或无机材料，例如硅酸盐质硅 石(silicaceous silicas)和其它成分， <列长口羊毛月旨。
依照本发明的洗剂包括适用于皮肤或眼睛的那些洗剂。应用于皮 肤的洗剂或擦剂可包括加快干燥和冷却皮肤的物质，例如酒精或丙 酮，和/或保湿剂，例如甘油或油，例如蓖麻油或花生油。
在本发明的一个实施方案中，单位剂量的补骨脂素可在约1至约1000 mg的范围内，例如由约2至约500 mg，例如由约5至约100 mg, 例如由约10至约50mg。
当口服给予时，补骨脂素例如可在辐射治疗之前至少15分钟、 例如至少30分钟、例如至少1小时、例如至少2小时给予。补骨脂 素在辐射治疗之前至多2天、例如至多1天、例如至多12小时、例 如至多6小时、例如至多3小时、例如至多2小时给予。在一个实施 方案中，补骨脂素在辐射治疗之前约1小时和在辐射治疗之前不超过 约3小时给予。当直接给予皮肤时，补骨脂素可在UV辐射治疗(例如 紫外线A (UVA)辐射治疗)之前1分钟至2天内、例如1分钟至1天内、 例如1分钟至12小时内、例如1分钟至6小时内、例如1分钟至3 小时内、例如1分钟至1小时内、例如1分钟至30分钟内应用，例 如在所述辐射治疗之前1-15分钟内应用。
在本发明的一个实施方案中，可给予UVB或UVB窄谱辐射治疗。 UVB或UVB窄谱治疗以每月1-10次治疗、例如每月l-7次治疗、例 如每月l-5次治疗、例如每周l-5次治疗、例如每周l-3次治疗、例 如每周1次治疗给予。在一个实施方案中，辐射治疗以和CD4结合肽 给予相同的治疗间隔给予。按照标准方案调整光强度，最通常是基于 最小红斑剂量(MED)或标准红斑剂量(SED)。 MED被定义为在施用后 足以产生皮肤红肿的最小量的x射线或其它辐射形式，被认为是一次 安全给予的剂量。用于UVB或UVB窄谱的波长可在250-400 nm的 范围内，例如在280-320 nm的范围内。
术语"电子束辐射治疗"在本文可与术语"全皮电子束疗法 (TSEBT)"互换使用。
在本发明的一个实施方案中，电子束辐射治疗可用作辐射治疗。 电子束可应用于局部皮肤或全皮，以1-15 MeV范围内的能量传递， 例如在4-9 MeV的范围内，以仅治疗皮肤。用于全皮电子束疗法 (TSEBT)过程中的剂量经常高达36 Gy,其可以一般处于0.1-5 Gy范 围内的分剂量，例如在1.5-2 Gy的范围内，以和CD4结合肽的给予相同的治疗间隔至多每周3次递送。
在本发明的一个实施方案中，辐射治疗可为光分离置换法。光分
离置换法如下进行白细胞除去法分离单核细胞级分，然后使其接触 UVA和Genoxalen或如上文描述的任何其它补骨脂素。然后将辐射过 的细胞返回给患者。上述方法对本领域技术人员是众所周知的。光分 离置换法特别适合于包含循环性恶性细胞的恶性病症，例如T细胞淋 巴瘤，例如CTCL。光分离置换法起初以至少连续2天进行，例如每 月1次或例如每月2次连续2天，直至已发生最大清除。此后进行至 少3个月、例如6个月的每月治疗，然后逐渐减弱到4周间隔，例如 6周间隔，例如8周间隔并停止。但是，本领域技术人员能够依据患 者、要治疗的病症和自身经验调整具体的光分离置换法治疗。
在本发明的一个实施方案中，X射线可用作辐射治疗。X射线可 给予局限于淋巴结、脏器、皮肤病灶的淋巴瘤如肿瘤或广泛大斑块疾 病。治疗例如可在给予CD4结合肽之后以和CD4结合肽的给予相同 的治疗间隔给予。可用于本发明的辐射类型包括但不限于低电压X射 线。经常执行分剂量。确定在需要该治疗的患者中获得疗效所需的x 射线的强度和持续时间的方法是本领域技术人员众所周知的。
本发明涉及用CD4结合肽(例如抗CD4抗体或其抗原结合片羊殳) 和辐射治疗临床疾病。临床疾病可为对此治疗响应的任何临床疾病。
在一个实施方案中，临床疾病是直接或间接涉及表达CD4的细 胞的疾病。因此，临床疾病可为直接或间接涉及〇04+ T细胞的任何 疾病。因此，临床疾病可为涉及增加的CD4+ T细^^增殖的疾病，例 如CD4+ T细胞的过度增殖，或者其可包括CD4+ T细胞向疾病部位的 增加的募集，例如不需要的CD4+ T细胞向疾病部位的募集。涉及CD4+ T细胞过度增殖的临床疾病包括例如某些恶性疾病。
在一个实施方案中，所述临床疾病可至少部分地响应于辐射治疗。
在一个实施方案中，临床疾病选自恶性疾病和炎性皮肤病。恶性疾病可为任何恶性疾病，例如原发性癌症或转移性癌症。本 文使用的术语"恶性疾病"意指还包括癌前病变。
所述"原发性癌症"指一群肿瘤细胞，其已获得至少一种癌症细 胞的特征，但还没有侵入邻近组织，并一起保持局限于最初起源位置 的肿瘤中。所述"转移性癌症"指一群肿瘤细胞，其起源于原发性癌 症细胞，已侵入到所述原发性癌症周围的组织，经由机体扩散，附着 在新的远距离位置，并生长为新胂瘤。
癌前和/或恶性疾病例如可为癌症或可发展为癌症的疾病。在本发 明范围内的术语癌症包括恶性和良性胂瘤这二者，以及白血病和淋巴 瘤。
癌症例如可为腺瘤、癌或肉瘤。癌症例如可选自黑素瘤、脑瘤、 成神经细胞瘤、乳癌、肺癌、前列腺癌、颈癌、子宫癌、卵巢癌、白 血病、结肠癌、直肠癌、睾九癌、肾癌、肝癌、唇癌、舌癌、胃癌、 皮肤癌、肉瘤、间皮瘤、膀胱癌、骨胂瘤、恶性胸腔积液、腹水、脑
膜性癌、头颈癌以及内分泌器官(例如曱状腺、垂体和肾上腺)癌。
在一个实施方案中，所述恶性疾病选自成人T细胞白血病或淋巴 瘤和T细胞前淋巴细胞性白血病。
在一个实施方案中，所述恶性疾病选自CD4+皮肤T细胞淋巴瘤， 例如蕈样肉芽肿病、赛谢综合征(Sezary syndrome)、淋巴瘤样丘渗病 或间变性大细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中，所述恶性疾病选自CD4+结节性T细胞淋巴 瘤，例如外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤或间变. 性大T细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中，皮肤的炎性疾病选自银屑病、皮炎湿渗、特 应性皮炎、硬皮病、扁平苔藓和斑秃。
以下是本发明实施方案的清单
实施方案1: CD4结合肽在制备用于在接受或将接受辐射治疗的 个体中治疗临床疾病的药物组合物中的用途。实施方案2: CD4结合肽在制备用于和辐射治疗组合治疗临床疾 病的药物组合物中的用途。
实施方案3: CD4结合肽在制备用于调节临床疾病的辐射治疗的 药物组合物中的用途。
实施方案4: CD4结合肽和补骨脂素化合物在制备用于治疗临床 疾病的药盒组件中的用途。
实施方案5:按照实施方案4的用途，其中药盒组件用于调节辐 射治疗。
实施方案6:按照实施方案1-5中任一项的用途，其中CD4结合 肽能够结合人CD4。
实施方案7:按照实施方案1-6中任一项的用途，其中CD4结合 肽使用哺乳动物细胞培养物生产。
实施方案8:按照实施方案1-7中任一项的用途，其中CD4结合 肽能够活化p56^激酶。
实施方案9:按照实施方案8的用途，其中p56^激酶的活化增 加至少一种抑制性衔接分子Dok-l和/或SHIP-1的磷酸化。
实施方案10:按照实施方案1-9中任一项的用途，其中CD4结 合肽为抗CD4抗体或其CD4结合片段。
实施方案ll:按照实施方案10的用途，其中所述抗体为单克隆抗体。
实施方案12:按照实施方案IO或实施方案11的用途，其中所述 抗体为人源化抗体。
实施方案13:按照实施方案10-11中任一项的用途，其中所述抗 体为人抗体。
实施方案14:按照实施方案10-13中任一项的用途，其中所述抗
体具有K型(K)轻链。
实施方案15:按照实施方案10-14中任一项的用途，其中所述抗 体选自扎木单抗、凯利昔单抗、克立昔单抗、TNX/355、 TRX/1、 IQT4a、普立昔单抗和4162W94。
实施方案16:按照实施方案15的用途，其中所述抗体为扎木单抗。
实施方案17:按照实施方案1-16中任一项的用途，其中所述辐 射治疗选自补骨脂素化合物与长波紫外线辐射(PUVA)、 UVB、窄谱 UVB、高剂量UVA、电子束和x射线的施用组合。
实施方案18:按照实施方案17的用途，其中所述辐射治疗为补 骨脂素化合物与长波紫外线辐射(PUVA)的施用组合。
实施方案19:按照实施方案18的用途，其中所述补骨脂素化合 物具有以下通式
其中R!、 R2、 R3、 R4、 RV和Rs独立地选自氢、卤素、Qwo)-烷 基和用卣素、胺或羟基取代的C(wo)-烷基，以及任选地用羟基取代的 C(w。)醚；或者R！和R5 —起形成吡啶并。
实施方案20:按照实施方案1-19中任一项的用途，其中所述补 骨脂素化合物选自吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、7-曱基吡啶并-[3,4-c]补骨 脂素、5-曱氧基补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、4,5',8-三甲基补骨脂素、 4-曱基补骨脂素、4,4-二甲基补骨脂素、4-5'-二曱基补骨脂素、4'，8-甲 氣基补骨脂素、4'-(G)-氨基-2-氧杂)烷基-4，5',8-三甲基补骨脂素、4'-(4-氨基-2-氧杂)-丁基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-氯甲基-4,5',8-三曱基补 骨脂素、4'-氨基-曱基-4,5',8-三曱基补骨脂素、4'-(2-羟基乙氧基)-甲基 -4,5'，8-三曱基-补骨脂素、4'-(6-羟基己氧基)-甲基-4,5',8-三甲基补骨脂 素、4'-羟甲基-4，5',8-三甲基补骨脂素、5-甲基-白芷素和2H-呋喃并 [2,3-h][l]苯并吡喃-2-酮。
实施方案21:按照实施方案20的用途，其中所述补骨脂素化合 物为5-甲氧基补骨脂素或8-甲氧基补骨脂素。
实施方案22:按照实施方案1-21中任一项的用途，其中所述临 床疾病为恶性疾病或炎性皮肤病。
实施方案23:按照实施方案22的用途，其中所述临床疾病为恶 性疾病。
实施方案24:按照实施方案22或实施方案23的用途，其中所述 恶性疾病选自白血病和淋巴瘤。
实施方案25:按照实施方案22-24中任一项的用途，其中所述恶 性疾病为T细胞前淋巴细胞性白血病。
实施方案26:按照实施方案22-24中任一项的用途，其中所述恶 性疾病选自CD4+皮力夫T细胞淋巴瘤。
实施方案27:按照实施方案26的用途，其中所迷恶性疾病选自 蕈样肉芽肿病、赛谢综合征、淋巴瘤样丘渗病和间变性大细胞淋巴瘤。
实施方案28:按照实施方案22-24中任一项的用途，其中所述恶 性疾病选自CD4+结节性T细胞淋巴瘤。
实施方案29:按照实施方案28的用途，其中所述恶性疾病选自 外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和间变性大T细 胞淋巴瘤。
实施方案30:按照实施方案22的用途，其中所述临床疾病为炎 性皮肤病。
实施方案31:按照实施方案22或实施方案30的用途，其中所述 炎性皮肤病选自银屑病、皮炎湿渗、特应性皮炎、硬皮病、扁平苔藓和斑壳。
实施方案32:治疗恶性疾病的方法，所述方法包括给予其需要的
患者治疗有效量的CD4结合肽，并对所述患者进行辐射治疗。
实施方案33:按照实施方案32的方法，其中所述恶性疾病选自 白血病和'淋巴瘤。
实施方案34:按照实施方案32或实施方案33的方法，其中所述 恶性疾病为T细胞前淋巴细胞性白血病。
实施方案35:按照实施方案32或实施方案33的方法，其中所述 恶性疾病选自CD4+皮肤T细胞淋巴瘤。
实施方案36:按照实施方案35的方法，其中所述恶性疾病选自 蕈样肉芽肿病、赛谢综合征、淋巴瘤样丘渗病和间变性大细胞淋巴瘤。
实施方案37:按照实施方案32或实施方案33的方法，其中所述 恶性疾病选自CD4阳性结节性T细胞淋巴瘤。
实施方案38:按照实施方案37的方法，其中所述恶性疾病选自 外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和间变性大T细 胞淋巴瘤。
实施方案39: —种治疗炎性皮肤病的方法，所述方法包括给予其 需要的患者治疗有效量的CD4结合肽，并对所述患者进行辐射治疗。
实施方案40:按照实施方案39的方法，其中所述炎性皮肤病选 自银屑病、皮炎湿疹、特应性皮炎、硬皮病、扁平苔藓和斑秃。
实施方案41: 一种调节临床疾病的辐射治疗的方法，所迷方法包 括给予其需要的患者治疗有效量的CD4结合肽，并对所述患者进行辐 射治疗。
实施方案42:按照实施方案32-41中任一项的方法，其中所述 CD4结合肽能够结合人CD4。
实施方案43:按照实施方案32-42中任一项的方法，其中所述 CD4结合肽使用哺乳动物细胞培养物生产。
实施方案44:按照实施方案32-43中任一项的方法，其中所述CD4结合肽能够活化p56^激酶。
实施方案45:按照实施方案44的方法，其中所述p56^激酶的 活化增加至少一种抑制性雀H妾分子Dok-l和/或SfflP-l的石舞酸化。
实施方案46:按照实施方案32-45中任一项的方法，其中CD4 结合肽为抗CD4抗体或其CD4结合片段。
实施方案47:按照实施方案46的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
实施方案48:按照实施方案46或实施方案47的方法，其中所述 抗体为人源化抗体。
实施方案49:按照实施方案46或实施方案47的方法，其中所述 抗体为人抗体。
实施方案50:按照实施方案46-49中任一项的方法，其中所述抗
体具有K型(K)轻链。
实施方案51:按照实施方案46-50中任一项的方法，其中所述抗 体选自扎木单抗、凯利昔单抗、克立昔单抗、TNX/355、 TRX/1、 IOT4a、 普立昔单抗和4162W94。
实施方案52:按照实施方案51的方法，其中所述抗体为扎木单抗。
实施方案53:按照实施方案32-52中任一项的方法，其中所述辐 射治疗选自补骨脂素与长波紫外线辐射(PUVA)、 UVB、窄谱UVB、 高剂量UVA、电子束和x射线。
实施方案54:按照实施方案53的方法，其中所述辐射治疗为补 骨脂素与长波紫外线辐射(PUVA),其中补骨脂素化合物在UVA治疗 之前施用。
实施方案55:按照实施方案54的方法，其中所述补骨脂素化合 物具有以下通式或
其中R!、 R2、 R3、 R4、 RV和Rs独立地选自氢、卤素、C(wo广烷 基和用卣素、胺或羟基取代的C(wo)-烷基，以及任选地用羟基取代的 C^。)醚；或者R！和R5 —起形成吡啶并。
实施方案56:按照实施方案32-55中任一项的方法，其中所述补 骨脂素化合物选自吡啶并-[3，4-c]补骨脂素、7-甲基吡啶并-[3,4-c]补骨 脂素、5-曱氧基补骨脂素、8-曱氧基补骨脂素、4,5',8-三曱基补骨脂素、 4-曱基补骨脂素、4,4-二甲基补骨脂素、4-5'-二甲基补骨脂素、4',8-甲 氧基补骨脂素、4'-(co-氛基-2-氧杂)烷基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-(4-氨基-2-氧杂)-丁基-4,5',8-三曱基补骨脂素、4'-氯甲基-4,5',8-三甲基补 骨脂素、4'-氨基-甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-(2-羟基乙氧基)-甲基 -4,5',8-三曱基-补骨脂素、4'-(6-羟基己氧基)-甲基-4,5',8-三甲基补骨脂 素、4'-羟甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素、5-甲基-白芷素和2H-呋喃并 [2，3-h][l]苯并吡喃-2-酮。
实施方案57:按照实施方案56的方法，其中所述补骨脂素化合 物为5-甲氧基补骨脂素或8-甲氧基补骨脂素。
实施方案58:按照实施方案54-57中任一项的方法，其中所述补 骨脂素化合物在辐射治疗前5-0.5小时的时间段内给予。
实施方案59:按照实施方案58的方法，其中所述补骨脂素化合物在辐射治疗前的2-1小时的时间段内给予。
实施方案60:按照实施方案32-59中任一项的方法，其中所述 CD4结合肽通过静脉内、皮下或肌内注射给予。
实施方案61:按照实施方案32-60中任一项的方法，其中所述 CD4结合肽在辐射治疗前给予至少一次。
实施方案62:按照实施方案32-61中任一项的方法，其中所述 CD4结合肽每周给予一次。
实施方案63:按照实施方案32-62中任一项的方法，其中所述患 者以每周l-5次的范围进行辐射治疗。
实施方案64:按照实施方案32-63中任一项的方法，其中至少一 种CD4结合肽治疗和至少一种辐射治疗在同一周内给予。
实施方案65:按照实施方案32-64中任一项的方法，其中所述 CD4结合肽治疗和辐射治疗在4-30周的时间段内给予。
实施方案66:按照实施方案65的方法，其中所述CD4结合肽治 疗和辐射治疗在8 -16周的时间段内给予。
实施方案67:按照实施方案66的方法，其中所述CD4结合肽治 疗和辐射治疗在12周的时间段内给予。
实施方案68:按照实施方案32-67中任一项的方法，其中所述辐 射治疗局部给予或给予至全皮肤。
实施方案69:按照实施方案32-67中任一项的方法，其中所述辐 射治疗给予至体外血液。
实施方案70:按照实施方案69的方法，其中所述辐射治疗为光 分离置换法。
实施方案71:包含CD4结合肽和补骨脂素化合物连同一种或多 种药学上可接受的赋形剂的药盒组件，所述药盒组件用作药物。
实施方案72:包含CD4结合肽和补骨脂素化合物连同 一种或多 种药学上可接受的赋形剂的药盒组件，所述药盒组件用作治疗恶性疾 病的药物。实施方案73:包含CD4结合肽和补骨脂素化合物连同 一种或多 种药学上可接受的赋形剂的药盒组件，所述药盒组件与辐射治疗组合 用作治疗恶性疾病的药物。
实施方案74:按照实施方案72或73的药盒组件，其中所述恶性 疾病选自白血病禾口淋巴瘤。
实施方案75:按照实施方案72-74中任一项的用途，其中所述恶 性疾病为T-细月包前淋巴细胞性白血病。
实施方案76:按照实施方案72-74中任一项的用途，其中所述恶 性疾病选自CD4+皮肤T细胞淋巴瘤。
实施方案77:按照实施方案76的用途，其中所述恶性疾病选自 蕈样肉芽肿病、赛谢综合征、淋巴瘤样丘渗病和间变性大细胞淋巴瘤。
实施方案78:按照实施方案72-74中任一项的用途，其中所述恶 性疾病选自CD4+结节性T细胞淋巴瘤。
实施方案79:按照实施方案78的用途，其中所述恶性疾病选自 外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和间变性大T细 胞淋巴瘤。
实施方案80:包含CD4结合肽和补骨脂素化合物连同一种或多 种药学上可接受的赋形剂的药盒组件，所述药盒组件用作治疗炎性皮 肤病的药物。
实施方案81:包含CD4结合肽和补骨脂素化合物连同一种或多 种药学上可接受的赋形剂的药盒组件，所述药盒组件与辐射治疗组合 用作治疗炎性皮肤病的药物。
实施方案82:按照实施方案80或实施方案81的用途，其中所述 炎性皮肤病选自银屑病、皮炎湿渗、特应性皮炎、硬皮病、扁平苔藓 和斑禿。
实施方案83:包含CD4结合肽和补骨脂素化合物连同一种或多 种药学上可接受的赋形剂的药盒组件，所述药盒组件用作调节辐射治 疗的药物用于治疗临床疾病。实施方案84:按照实施方案71-83中任一项的药盒组件，其中所 述补骨脂素化合物以治疗有效量存在。
实施方案85:按照实施方案71-84中任一项的药盒组件，其中所 述CD4结合肽以治疗有效量存在。
实施方案86:按照实施方案71-85中任一项的药盒组件，其中所 述CD4结合肽能够结合人CD4。
实施方案87:按照实施方案71-86中任一项的药盒组件，其中所 述CD4结合肽使用哺乳动物细胞培养物生产。
实施方案88:按照实施方案71-87中任一项的药盒组件，其中所 述CD4结合肽能够活化p56欣激酶。
实施方案89:按照实施方案88的药盒组件，其中p56^激酶的 活化增加至少一种抑制性衔接分子Dok-l和/或SfflP-l的磷酸化。
实施方案90:按照实施方案71-89中任一项的药盒组件，其中所 述CD4结合肽为抗CD4抗体或其CD4结合片段。
实施方案91:按照实施方案90的药盒组件，其中所述抗体为单 克隆抗体。
实施方案92:按照实施方案90或实施方案91的药盒组件，其中 所述抗体为人源化抗体。
实施方案93:按照实施方案90或实施方案91的药盒组件，其中 所述抗体为人抗体。
实施方案94:按照实施方案90-93中任一项的药盒组件，其中所
述抗体具有K型(K)轻链。
实施方案95:按照实施方案90-94中任一项的药盒组件，其中所 述抗体选自扎木单抗、凯利昔单抗、克立昔单抗、TNX/355、 TRX/1、 10T4a、普立昔单抗和4162W94。
实施方案96:按照实施方案95的药盒组件，其中所述抗体为扎 木单抗。
实施方案97:按照实施方案71-96中任一项的药盒组件，其中所述补骨脂素化合物具有以下通式<formula>formula see original document page 59</formula>或
<formula>formula see original document page 59</formula>
<formula>formula see original document page 59</formula>
其中R!、 R2、 R3、 R4、 RV和Rs独立地选自氢、卣素、C(w。;r烷 基和用卣素、胺或羟基取代的C(wo)-烷基，以及任选地用羟基取代的 C(wo)醚；或者和R5 —起形成吡啶并。
实施方案98:按照实施方案71-97中任一项的药盒组件，其中所 述补骨脂素化合物选自吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、7-甲基吡啶并-[3,4-c〗 补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、8-甲氣基补骨脂素、4,5',8-三甲基补骨 脂素、4-甲基补骨脂素、4,4-二甲基补骨脂素、4-5'-二甲基补骨脂素、 4'，8-曱氧基补骨脂素、4'-(co-氨基-2-氧杂)烷基-4,5',8-三甲基补骨脂素、 4'-(4-氨基-2-氧杂)-丁基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-氯甲基-4，5',8-三甲 基补骨脂素、4'-氨基-甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-(2-羟基乙氧基)-曱基-4,5',8-三曱基-补骨脂素、4'-(6-羟基己氧基)-甲基-4,5',8-三曱基补 骨脂素、4'-鞋曱基-4,5',8-三甲基补骨脂素、5-曱基-白芷素和2H-呋喃 并[2,3-h][l]苯并p比喃-2-酮。
实施方案99:按照实施方案98的药盒组件，其中所述补骨脂素 化合物为5-甲氧基补骨脂素或8-甲氧基补骨脂素。
实施方案100:按照实施方案71-99中任一项的药盒组件，其中 所述药盒组件配制为单位剂型，其中每单位剂量的CD4结合肽包含在20 mg至2000 mg范围内的肽。
实施方案101:按照实施方案71-100中任一项的药盒组件，其中 所述药盒组件配制为单位剂型，其中每单位剂量的补骨脂素包含在10 mg至50 mg范围内的补骨脂素化合物。
实施方案102:按照实施方案71-101中任一项的药盒组件，其中 所述CD4结合肽处于适合于胃肠外给予的制剂中。
实施方案103:按照实施方案71-102中任一项的药盒组件，其中 所述CD4结合肽被配制为溶液或适合于制备悬浮液或溶液的粉末。
实施方案104:按照实施方案71-103中任一项的药盒组件，其中 所述补骨脂素化合物处于适合于口服或局部给予的制剂中。
实施方案105:按照实施方案71-104中任一项的药盒，其中所述 补骨脂素化合物以选自片剂、胶嚢剂、乳剂、洗剂或软膏剂的形式配 制。
实施方案106:用于在接受或将接受辐射治疗的个体中治疗恶性 疾病或炎性皮肤病的CD4结合肽。
实施方案107:用于与辐射治疗组合治疗恶性疾病或炎性皮肤病 的CD4结合肽。
实施方案108:用于调节临床疾病的辐射治疗的CD4结合肽。
实施方案109:按照实施方案106-108中任一项的CD4结合肽， 其中所述CD4结合肽能够结合人CD4。
实施方案110:按照实施方案106-109中任一项的CD4结合肽， 其中所述CD4结合肽使用哺乳动物细胞培养物生产。
实施方案111:按照实施方案106-110中任一项的CD4结合肽， 其中所述CD4结合肽能够活化p56欣激酶。
实施方案112:按照实施方案111的CD4结合肽，其中p56^激 酶的活化增加至少一种抑制性衔接分子Dok-l和/或SfflP-l的磷酸化。
实施方案113:按照实施方案106-112中任一项的CD4结合肽，实施方案114:按照实施方案113的CD4结合肽，其中所述抗体 为单克隆抗体。
实施方案115:按照实施方案113或实施方案114的用途，其中 所述抗体为人源化抗体。
实施方案116:按照实施方案113或实施方案114的CD4结合肽， 其中所述抗体为人抗体。
实施方案117:按照实施方案113-116中任一项的CD4结合肽，
其中所述抗体具有K型(K)轻链。
实施方案118:按照实施方案113-117中任一项的CD4结合肽， 其中所述抗体选自扎木单抗、凯利昔单抗、克立昔单抗、TNX/355、 TRX/1、 10T4a、普立昔单抗和4162W94。
实施方案119:按照实施方案118的CD4结合肽，其中所述抗体 为扎木单抗。
实施方案120:按照实施方案106-119中任一项的CD4结合肽， 其中所述辐射治疗选自补骨脂素化合物与长波紫外线辐射(PUVA)、 UVB、窄i普UVB、高剂量UVA、电子束和x射线的施用组合。
实施方案121:按照实施方案120的CD4结合肽，其中所述辐射 治疗为补骨脂素化合物与长波紫外线辐射(PUVA)的施用组合。
实施方案122:按照实施方案121的CD4结合肽，其中所述补骨 脂素化合物具有以下通式
<formula>formula see original document page 61</formula>其中R!、 R2、 R3、 R4、 RV和Rs独立地选自氢、卣素、C(wo)-烷 基和用由素、胺或羟基取代的C(wo)-烷基，以及任选地用羟基取代的 C(wo)醚；或者R!和Rs—起形成吡啶并。
实施方案123:按照实施方案106-122中任一项的CD4结合肽， 其中所述补骨脂素化合物选自吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、7-曱基吡啶并 -[3,4<]补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、8-曱llJ^补骨脂素、4,5',8-三甲 基补骨脂素、4-甲基补骨脂素、4,4-二曱基补骨脂素、4-5'-二曱基补骨 脂素、4',8-曱氧基补骨脂素、4'-((D-氨基-2-氧杂)烷基-4,5',8-三甲基补 骨脂素、4'-(4-氨基-2-氧杂)-丁基-4，5',8-三甲基补骨脂素、4'-氯曱基 -4,5',8-三曱基补骨脂素、4'-氨基-甲基-4,5',8-三曱基补骨脂素、4'-(2-羟基乙氧基)-曱基-4，5',8-三甲基-补骨脂素、4'-(6-羟基己氧基)-甲基 -4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-羟曱基-4,5',8-三甲基补骨脂素、5-甲基-白 芷素和2H-呋喃并[2,3-h][l]苯并吡喃-2-酮。
实施方案124:按照实施方案123的CD4结合肽，其中所述补骨 脂素化合物为5-甲氧基补骨脂素或8-甲氧基补骨脂素。
本文描述的治疗方法还可以与其它治疗组合，尤其是与常规用于 治疗特定临床疾病的其它治疗组合。例如，在其中所述临床疾病为恶 性疾病的本发明实施方案中，治疗可与化疗、手术治疗、用免疫刺激 物治疗、基因治疗、用其它肽如抗体治疗和/或使用树突细胞的治疗组 合。
实施例 实施例1
利用扎木单抗抑制活化的T细胞中的T细胞信号转导该实施例表明了扎木单抗(GenMab, Denmark)经T细胞受体(TCR) 对T细胞活化的抑制性作用。结果示于图2。
在图2中呈现的T细胞活化时对T细胞信号转导分子的作用用分 离自健康供体的外周血的CD4+ T细胞获得。CD4+ T细胞使用 RosetteSep富集混合物(Stemcell Technologies Inc, Canada)分离，并通 过lymphoprep (Axis Shield, Poc AS, Norway)密度离心分离。CD4+ T细 胞(107个细胞)与扎木单抗温育，然后用固定在乳胶珠上的CD3单克 隆抗体(OKT3，可得自Orthoclone, Pharmacy, UMC, Utrecht)刺激。细 胞使用裂解緩冲液(1% Nonidet P-40, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2mM EGTA, 1 mM Na3V04, 10 mM NaF, 10 mM焦石粦酸钠和蛋 白酶抑制剂(Roche Molecular Biochemicals， Sussex, UK))裂解。在双份 细胞裂解物样品中的蛋白通过7-15%梯度凝胶SDS-PAGE分离，并通 过电泳转移至印迹膜上。膜与特异性酪氨酸磷酸化蛋白的抗体温育， 剥离，然后用不管特异性蛋白的磷酸化状态而识别它们的抗体再探 测。蛋白用缀合HRP的二抗检测，通过ECL显现，并使用磷成像仪 定量。
图2中的结果表明，扎木单抗在经由固定化CD3单克隆抗体的 TCR刺激后对胞内蛋白的酪氨酸磷酸化产生普遍抑制(图2A)。 21kDa 和23kDa蛋白在它们的磷酸化方面被显著抑制， 一皮鉴别为TCR-;链的 p21和p23磷酸化异构体(图2A)。所观察到的扎木单抗对下游酪氨酸 激酶《链相关蛋白70' (ZAP刁0)的磷酸化的抑制与此一致(图2B)。以 前，TCR;的活化和随后的ZAP-70的活化被表明由酪氨酸激酶p56kk 诱导(Chan AC等，Annu Rev Immunol. U, 555-92 (1994)， van Oers NS 等，J Exp Med. 183(3), 1053-1062 (1996), Weiss A等，，),263-74 (1994),其与CD4的胞质尾区有关(Rudd CE，Proc Natl Acad Sci USA. ^1(14), 5190-5194 (1988), Veillette， 1988，出处同上)。其磷酸化也被 扎木单抗抑制的36-38kDa显性酪氨酸磷酸化蛋白被鉴别为'活化T 细胞的衔接蛋白接头'(LAT)(图2A)。另外，扎木单抗抑制在T细胞活化中起关键作用的3个下游信号转导途径Erkl/2、 p38丝氨酸/苏 氨酸和AKT/PKB (图2C)。
总之，扎木单抗抑制非常早期的T细胞活化事件达约50%，其可 能是p56^依赖性的，由此将相当的抑制性作用水平传输至多个下游 信号转导途径。
实施例2
通过扎木单抗直接抑制T细胞中的信号转导
该实施例表明扎木单抗在T细胞中直接抑制信号转导。结果示于图3。
在图3中呈现的T细胞中的抑制性衔接分子的活化用如在实施例 1中所述分离的CD4+T细胞获得。将CD4+T细胞(3xlOE7个细胞)与 扎木单抗温育，适宜时在接触扎木单抗前与Src激酶抑制剂PP2或虎 刺素(Merck Biosciences, Nottingham, UK)预温育。细胞裂解物与CD4 沉淀抗体温育，抗体结合蛋白用G蛋白sepharose沉淀。对于SH2-结 合蛋白的沉淀，裂解物与偶联至谷胱甘肽琼脂糖珠的 SH2C-RasGAP-GST温育。CD4-沉淀物与含1 mM DTT、 5 ATP 和1 ^Ci 32P"ATP的激酶纟爰沖液(40 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl2, 3 mM MnCl2, 200 Na3V04的10%甘油溶液)温育。反应通过在 Laemmli緩冲液中煮沸终止。蛋白通过7-15%梯度凝胶SDS-PAGE分 离，并通过电泳转移至印迹膜上。干燥的膜对放射照相敏感性胶片曝 光，然后与特异性蛋白的抗体温育。用缀合HRP的二抗检测蛋白，通 过ECL显现，并使用磷成像仪定量。
图3中的结果表明，扎木单抗对CD4相关的p56欣酪氨酸激酶活 性、作为外源p56她底物的a-酪蛋白的磷酸化和p56lek自体磷酸化产生 最佳刺激(图3A)。由扎木单抗诱导的p56^活性增加看起来可能与扎 木单抗温育时表明T细胞活化受损的数据相矛盾(图2)。以下概述了 一个可能的解释，然而本发明不受具体的基础机制限制。我们假定扎木单抗可引起p56她隐匿，远离TCR。另外，扎木单抗可通过p56kk
直接产生负信号，因为业已表明p56^在磷酸化中起作用，由此活化
抑制性衔接蛋白'酪氨酸激酶下游，(Dok-l)(Martelli, 2001，出处同 上，Okabe, 2005,出处同上)和'接触SH2结构域的5'-肌醇磷酸酶， (SHIP-l)(Lamkin, 1997，出处同上)。扎木单抗实际上诱导Dok-l和 SHIP-1的磷酸化(图3B、 3C)。所观察到的扎木单抗增加p56kk活化和 Dok-l活化诱导之间的直接关联经由用Src抑制剂PP2或用更特异性 的p56kk抑制剂虎刺素预处理细胞证实。用这些抑制剂预处理导致沉 淀的Dok-l量减少(图3D)。总之，扎木单抗的CD4结合引起p56lck 激酶活化，该活化又导致Dok-l和SHIP-1磷酸化增加。
实施例3
扎木单抗与UV处理组合对初始CD4+ T细胞的影响
总CD4+ T细胞或CD45RO+和CD45RA+部分分离自由两种性别 的健康供体获得的血库白细胞去除包(blood bank leukopheresis packs)。 将无菌PBS加入到每个血包中，并通过lymphoprep密度离心(淋巴细 月包分离液；BioWhittaker，经由Cambrex Verviers, Belgium;产品号 17-829E)以800xg 20分钟(刹车O)分离外周血单核细胞(PBMC)。取出 在梯度界面的PBMC,用PBS清洗3次(400xg， 7分钟，刹车3),然 后重悬浮在RPMI中。使用Dynal CD4+ T细胞阴性分离试剂盒(Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany;产品号113.1 l)按照生产商的方案 通过阴性选择分离CD4+ T细胞。采用Dynal CD4+ T细胞阴性分离 试剂盒(Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany;产品号113.17)并组 合抗CD45R0+ (Becton Dickinson,目录号555491))和CD45RA+ (Becton Dickinson,目录号556625)细胞的小鼠单克隆抗体以及组合抗小鼠磁 珠，由PBMC悬浮液分离CD4+CD45RA+和CD4+CD45R0+ T细胞部分。 通过经由扎木单抗-FITC (Ge腿ab B.V.;批号200302)和抗-CD3-PE (Becton Dickinson ，目录号556612)染色的流式细胞法，对于CD4+CD45RA+和CD4+CD45R0+ T细胞部分而言用抗-CD45RA-FITC 和CD45RO-PE抗体，检查CD4+T细胞的百分率，并使用Cell Quest 软件(Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgium)以FACS Calibur 分析细胞相关荧光。
在分离的CD4+ T细胞和CD4+CD45RA+和CD4+CD45R0+ T细胞 部分细胞在培养基(RPMI 1640,补加10。/。热失活胎牛血清(Fetal clone II-Hyclone;产品号SH30066.3)、 2 mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，经 由Cambrex;产品号17-605F)和50单位/ml青霉素和50吗/ml链霉素 (BioWhittaker，经由Cambrex;产品号DEI7-603E))中适应1小时之后， 将细胞重悬浮在单独的培养基中、补加10 pg/ml扎木单抗(Genmab, Denmark)的培养基中以及含10吗/ml HuMab-KLH (Genmab B.V.;对 照lgGK)的培养基中。这些批次用多种剂量的UV (50-1000 J/n^)和UV 交联剂(UV Stratalinker 2400, Stmtagene)处理，变成凋亡的细胞量通过 3个独立测定于0、 4、 8、 24和48小时确定。首先，对于膜联蛋白V 染色法，使用膜联蛋白-V-FITC和7-AAD (7-氨基放线菌素D)(BD Biosciences)通过流式细胞法进行分析，膜联蛋白-V-FITC+/7-AAD^B 胞被视为凋亡的。其次，对于胞内半胱天冬酶-3染色法，CD4+T细胞 用FACS緩沖液(PBS,含有2% HIFCS和0.01%叠氮化物)清洗2次， 之后重悬浮在Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences)中。在于4。C温育20 分钟后，细胞用透化/清洗緩冲液(BDBiosciences)清洗2次，然后用活 性半胱天冬酶-3单克隆抗体(BD Biosciences)染色，后^^妄流式细月包术， 半胱天冬酶-3阳性细胞被视为凋亡的。对于用碘化3,3'-二己基氧杂羰 花青(DiOC6)(Aldrich, Poole， Dorset, UK)法分析，细胞用23 ng/ml DiOC6染色，然后进行流式细胞术。表现出FSC和DiOC6强度损失的 细胞被视为凋亡的。
实施例4
扎木单抗与UV治疗组合对CD4+ T细胞系的影响将CD4+T细胞系SUP-T1 (ATCC，序号CRL-1942)、 CEM-NKr (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program;试剂编号458)在 培养基(RPMI 1640,补加10。/。热失活胎牛血清(Fetal clone II-Hyclone; 产品号SH30066.3)、 2mML-谷氨酰胺(BioWhittaker，经由Cambrex; 产品号17-605F)以及50单位/ml青霉素和50昭/ml链霉素 (BioWhittaker，经由Cambrex;产品号DE17-603E》中在5% C02-95% 空气中于37。C培养，至3-10xl()S个细胞/ml的最佳细胞密度。
将细胞重悬浮在单独的培养基中、补加10吗/ml扎木单抗 (Genmab, Denmark)的培养基中以及含10 |tig/ml HuMab-KLH (Genmab B.V.;对照IgGl， k)的培养基中。这些批次用多种剂量的UV (50-1000 J/m2)和UV交联剂(UV Stratalinker 2400, Stratagene)处理，变成凋亡的 细胞量通过3个独立测定于0、 4、 8、 24和48小时确定。首先，对 于膜联蛋白V染色法，使用膜联蛋白-V-FITC和7-AAD (7-氨基放线 菌素D)(BD Biosciences)通过流式细胞法进行分析，膜联蛋白 -V-FITC+/7-AAD+细胞被视为凋亡的。其次，对于胞内半胱天冬酶-3 染色法，CD4+ T细胞用FACS緩冲液(PBS，含有2% HIFCS和0.01% 叠氮化物)清洗2次，之后重悬浮在Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) 中。在于4。C温育20分钟后，细胞用透化/清洗緩冲液(BD Biosciences) 清洗2次，然后用活性半胱天冬酶-3单克隆抗体(BD Biosciences)染色， 后接流式细胞术，半胱天冬酶-3阳性细胞被视为凋亡的。对于用碘化 3,3'-二己基氧杂羰花青(DiOC6)(Aldrich， Poole, Dorset, UK)法分析，细 胞用23 ng/ml DiOC6染色，然后进行流式细胞术。表现出FSC和DiOC6 强度损失的细胞被视为凋亡的。
实施例5
扎木单抗与PUVA治疗组合对初级CD4+ T细胞的影响
初级CD4+ T细胞以及CD4+CD45RA+和CD4+CD45R0+ T细胞部 分细胞如在实施例3中所述分离。在分离的细胞于培养基(RPMI 1640，补力。10%热失活胎牛血清 (Fetal clone II-Hyclone;产品号SH30066.3)、 2 mM L-谷氨酰胺 (BioWhittaker,经由Cambrex;产品号17-605F)以及50单位/ml青霉 素和50昭/ml链霉素(BioWhittaker，经由Cambrex;产品号DE17-603E)) 中适应最少1小时后，将细胞重悬浮在单独的培养基中、补加10|iig/ml 扎木单抗(Genmab, Denmark)的培养基中以及含10昭/ml HuMab-KLH (GenmabB.V.;对照IgGl, k)的培养基中。这些细胞在5% COr95% 空气中于37。C培养0、 0.3、 1、 2、 4和8小时。在培养后，用无血清 培养基清洗细胞。将细胞分为两部分 一部分与8-MOP (200 ng/ml 8-甲氧基补骨脂素)在无血清培养基中于室温温育5分钟，另一部分在单 独的无血清培养基中于室温温育5分钟。然后，细胞接触多种剂量的 UV (50-1000 J/m2)和UV交联剂(UV Stratalinker 2400, Stratagene)。在 处理后，细胞在培养基中温育，变成凋亡的细胞量通过3个独立测定 于0、 4、 8、 24和48小时确定。首先，对于膜联蛋白V染色法，使 用膜联蛋白-V-FITC和7-AAD (7-氨基放线菌素D)(BD Biosciences)通 过流式细胞法进行分析，膜联蛋白-V-FITC+Z7-AAD+细胞被视为凋亡 的。其次，对于胞内半胱天冬酶-3染色法，CD4+T细胞用FACS緩沖 液(PBS，含有2。/。HIFCS和0.0P/。叠氮化物)清洗2次，之后重悬浮在 Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences)中。在于4。C温育20分钟后，用透 化/清洗緩冲液(BD Biosciences)清洗细胞2次，然后用活性半胱天冬酶 -3单克隆抗体(BDBiosciences)染色，后接流式细胞术，半胱天冬酶-3 阳性细胞计数被视为凋亡的。对于用碘化3,3'-二己基氧杂羰花青 (DiOC6)(Aldrich, Poole, Dorset, UK)法分析，细胞用23 ng/ml DiOC6染 色，然后进行流式细胞术。表现出FSC和DiOQ强度损失的细胞净皮视 为凋亡的。
实施例6
扎木单抗与PUVA治疗组合对CD4+ T细胞系的影响
6细胞系SUP-T1和CEM-NKr描述于实施例4。将细胞重悬浮在单 独的培养基中、补加10 jug/ml扎木单抗(Genmab, Denmark)的培养基中 以及含10昭/ml HuMab-KLH (Genmab B.V.;对照lgGK)的培养基中。 这些细胞在5% 0)2-95%空气中于37"培养0、 0.3、 1、 2、 4和8小 时。在培养后，用无血清培养基清洗细胞。将细胞分为两部分 一部 分与8-MOP (200 ng/ml曱氧沙林)在无血清培养基中于室温温育5分 钟，另一部分在单独的无血清培养基中于室温温育5分钟。然后，细 胞接触多种剂量的UV (50-1000 J/m"和UV交联剂(UV Stratalinker 2400, Stratagene)。在处理后，细胞在培养基中温育，变成凋亡的细胞 量通过3个独立测定于0、 4、 8、 24和48小时确定。首先，对于膜 联蛋白V染色法，使用膜联蛋白-V-FITC和7-AAD (7-氨基放线菌素 D)(BD Biosciences)通过流式细胞法进行分析，膜联蛋白 -V-FITC+/7-AAD+细胞被视为凋亡的。其次，对于胞内半胱天冬酶-3 染色法，CD4+T细胞用FACS緩冲液(PBS,含有2%fflFCS和0.01% 叠氮化物)清洗2次，之后重悬浮在Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) 中。在于4。C温育20分钟后，细胞用透化/清洗緩冲液(BD Biosciences) 清洗2次，然后用活性半胱天冬酶-3单克隆抗体(BD Biosciences)染色， 后接流式细胞术，半胱天冬酶-3阳性细胞计数祐、视为凋亡的。对于用 碘化3,3'-二己基氧杂羰花青(DiOC6)(Aldrich, Poole, Dorset, UK)法分 析，细胞用23ng/mlDiOC6染色，然后进行流式细胞术。表现出FSC 和DiOC6强度损失的细胞计数被视为凋亡的。
实施例7
OP)UVA-诱导的Gl期T细胞的凋亡
SUP-T1和CEM-NKr细胞系与0.5-50 pg/ml巴菲敌柯林同步5-18 小时，细胞在G1/S交界处累积。细胞周期停滞将如下被解除用PBS 清洗细胞3次，并将它们返回到正常培养基，培养4-6小时。此后， 将诺考达唑(200吗/ml)加入到培养基中，再培养6小时。通过此方法，几乎所有的细胞都将同步在M期。通过用PBS洗除诺考达唑3次并 重悬浮在正常培养基中，同步的细胞将在1小时内移至G1期。在10、 20、 30、 40、 50和60分钟时，细胞用多种剂量的UV (50-1000 J/m2) 和UV交联剂(UV Stmtalinker 2400, Stratagene)处理，变成凋亡的细胞 量通过3个独立测定确定。首先，对于膜联蛋白V染色法，使用膜联 蛋白-V-FITC和7-AAD (7-氨基放线菌素D)(BD Biosciences)通过流式 细胞法进行分析，膜联蛋白-V-FITC+/7-AAD+细胞祐:视为凋亡的。其 次，对于胞内半胱天冬酶-3染色法，CD4+T细胞用FACS緩沖液(PBS， 含有2% HIFCS和0.01%叠氮化物)清洗2次，之后重悬浮在 Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences)中。在于4。C温育20分钟后，细胞 用透化/清洗緩沖液(BD Biosciences)清洗2次，然后用活性半胱天冬酶 -3单克隆抗体(BDBiosciences)染色，后接流式细胞术，半胱天冬酶-3 阳性细胞计数被视为凋亡的。对于用碘化3,3'-二己基氧杂羰花青 (DiOC6)(Aldrich， Poole, Dorset, UK)法分析，细胞用23 ng/ml DiOC6染 色，然后进行流式细胞术。表现出FSC和DiOC6强度损失的细胞4^f见 为凋亡的。
实施例8
(P)UVA治疗，后接NK细胞介导的对初级CD4+ T细胞的ADCC,细 胞裂解的诱导
健康志愿者的外周人血细胞(知会同意后)通过脉穿刺收集，并以 血沉棕黄层的形式提供(Sanquin, Utrecht, The Netherlands)。将无菌 PBS加入人血，外周血单核细胞(PBMC)通过lymphoprep密度离心(淋 巴细胞分离液；BioWhittaker,经由Cambrex Venders, Belgium;产品 号17-829E)以800xg (刹车0) 20分钟(Heraeus MultifUge 3S-R)分离。由 梯度界面取出PBMC,用PBS清洗3次(400xg, 7分钟，刹车3)，然 后重悬浮在补加0.1% BSA的PBS中。
按照生产商的方案使用Dynal CD4+ T细胞阴性分离试剂盒(Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany;产品号113.11 )使用阴性选 择分离CD4+ T细胞(或CD45RO+和CD45RA+部分)。
使用Dynal 阴性分离试剂盒组合抗CD45R0+ (Becton Dickinson, 目录号555491》或CD45RA+ (Becton Dickinson,目录号556625)细胞 的小鼠单克隆抗体以及组合抗小鼠磁珠，由PBMC悬浮液分离CD4+ T 细胞或CD4+CD45RA+和CD4+CD45RO+ T细胞部分。通过经由 HuMax-CD4-FITC (Genmab B.V.;批号200302)和抗-CD3-PE (Becton Dickinson,目录号556612)染色的流式细胞法，对于CD4+CD45RA+ 和CD4+CD45R0+ T细胞部分而言分别用抗-CD45RA-FITC和 CD45RO-PE抗体，检查CD4+T细胞的百分率。使用Cell Quest软件 (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgium)以FACS Calibur分斗斤 细l包相关荧光。
使用Dynal NK细胞阴性分离试剂盒(Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany;产品号113.15)按照生产商的方法通过阴性选择由 外周人血分离NK细胞。NK细胞的百分率通过经由CD56-PE (Becton Dickinson,目录号555516)和CD16-FITC (Becton Dickinson,目录号 555406)染色的流式细胞法检查，使用Cell Quest软件(Becton Dickinson: Erembodegem-Aalst, Belgium)以FACS Calibur分析细胞相关荧光。
分离的NK细胞在37。C、 5。/。C02下在补加10%热失活加强型小 牛血清(CCS)、 50 pg/ml链霉素和50 U/ml青霉素(Cambrex,目录号 DE17-603E)、 2 mM L-谷氨酰胺(Cambrex，目录号BE17-605F)和 200-300 U/ml IL曙2的RPMI 1640 (Cambrex,目录号BE12國115F)中培 养，直至CD4+T细胞被PUVA处理(2天后)。
分离的CD4+ T细胞或分离的CD4+CD45RA+和CD4+CD45RO+部 分用荧光细胞膜标记PKH26 (FL2)(PKH26红色荧光细胞连接试剂盒, Sigma-AJdrich Chemie， Zwijndrecht, The Netherlands ; 产品号 PKH26-GL)按照生产商的方法标记。
将PKH26-标记的CD4+T细胞(或分离的部分)以1*105个细胞/孔以100 pi转移至96孔平底板(包被10吗/ml OKT3 (Orthoclone,目录号 01KS34H)。
接着，加入50 CD28 (CLB,目录号M1650;最终浓度为2 吗/ml)。最后，加入50nl稀释的扎木单抗，获得终体积200 pl/孔。
这些CD4+ T细胞于37°C、 5% C02中温育2天。在培养后，将 细胞分为两个相等的部分 一部分与1 pg/ml 8-MOP(补骨脂素；Fluka, 目录号95560)于室温温育30分钟，另 一部分在没有8-MOP的情况下 于室温温育30分钟。
接着，以1 J/cm2 UVA于距UVA灯(UVP⑧8W，型号UVLMS-38) 不同的距离辐射细胞不同的时间段。
培养的NK-细胞用PBS清洗3次(400xg, 7分钟，刹车3),然后 以2.5-5*106个细胞/1111 (取决于培养和清洗后的NK细胞产量)重悬浮 在培养基中。
在辐射后，将PKH26标记和(P)UVA处理的CD4+ T细胞以 2.5-5*104个细胞/孔以100 |Lil (取决于培养和清洗后培养基中的NK-细 胞量)转移至96孔圓底板。
随后，以2.5-5*105个细胞/孔(调整每孔的服细胞量，以获得10:1 效应子/革巴细胞比率)力口入100 pl NK细胞，将细胞离心下来(54xg, 10 秒，刹车3)。沉淀的细胞在5%(302中于37。C温育0、 4和24小时。 对于自发裂解的检测，靶细胞与培养基在没有NK细胞的情况下温育。
在温育后，将细胞离心下来(500xg, 5分钟，刹车3),并将细胞 转移至具有100 pl FACS緩冲液的Micronic FACS管中。细胞在临分 析前用TO-PRO -3 (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands;产品号 T3605; 1:100,000最终稀释度)染色。TO-PRO-3碘化物是在通过裂解 的T细胞的透化膜进入后用于核酸的荧光染料，并在FL4中是可检测 的。使用FACSCaliburTM和采用适宜补偿设置的Cell Quest Pro软件 (Becton Dickinson)通过流式细胞法评价细胞相关荧光。通过将PKH26+ 细胞群中的TO-PRC^-3+细胞数除以PKH26+细胞总数计算细胞裂解百分率。
实施例9
在临床环境中的应用
在本发明的 一个实施方案中，罹患恶性疾病或炎性皮肤病的患者 在给予CD4结合肽之前接触PUVA，例如患者可在开始CD4结合肽 给予之前按照说明书接触PUVA治疗1周、2周或2-4周。CD4结合 肽的给予可单独地继续，或在用PUVA继续治疗的过程中继续。在一 个实施方案中，同时开始并进行PUVA治疗和CD4结合肽的给予。 在一个实施方案中，CD4结合肽为扎木单抗(Genmab, Denmark)。在一 个实施方案中，CD4结合肽以700 mg的剂量通过静脉内输注在2-3 小时内给予。在初始剂量后根据需要每2周1次给予350 mg CD4结 合肽的维持剂量，直至临床症状看起来显著改善，或者直至症状消失。 在一个实施方案中，CD4结合肽的剂量逐渐增加，直至观察到对症状 的作用，或直至出现不可接受的副作用。治疗方案根据需要每3-9个 月重复1次或多次。患者可同时用其它已确立的治疗方案治疗。
在一个实施方案中，补骨脂素在开始PUVA和CD4结合肽治疗 之前应用于患者。在一个实施方案中，在开始PUVA和CD4结合肽 治疗的同时或之后应用补骨脂素。
权利要求
1.CD4结合肽在制备用于在接受或将接受辐射治疗的个体中治疗临床疾病的药物组合物中的用途。
2. CD4结合肽在制备用于与辐射治疗组合治疗临床疾病的药物 组合物中的用途。
3. CD4结合肽在制备用于调节临床疾病的辐射治疗的药物组合 物中的用途。
4. CD4结合肽和补骨脂素化合物在制备用于临床疾病治疗的药 盒组件中的用途。
5. 权利要求4的用途，其中所述药盒组件用于调节辐射治疗。
6. 权利要求1-5中任一项的用途，其中所述CD4结合肽能够结 合人CD4。
7. 权利要求1-6中任一项的用途，其中所述CD4结合肽使用哺 乳动物细胞培养物生产。
8. 权利要求1-7中任一项的用途，其中所述CD4结合肽能够活 化p56^激酶。
9. 权利要求8的用途，其中p56欣激酶的活化增加至少一种抑制 性衔接分子Dok-l和/或SHIP-1的磷酸化。
10. 权利要求1-9中任一项的用途，其中用于本发明的CD4结合 肽选自在结合至CD4阳性细胞时能够活化天然杀伤细胞的CD4结合 肽。
11. 权利要求10的用途，其中用于本发明的CD4结合肽在结合 至CD4阳性细胞时能够结合天然杀伤细胞上的CD16,并由此活化天 然杀伤细胞。
12. 权利要求1-11中任一项的用途，其中所述CD4结合肽为抗 CD4抗体或其CD4结合片段。
13. 权利要求12的用途，其中所述抗体为单克隆抗体。
14. 权利要求12或权利要求13的用途，其中所述抗体为人源化 抗体。
15. 权利要求12-13中任一项的用途，其中所述抗体为人抗体。
16. 权利要求12-15中任一项的用途，其中所述抗体具有k型(k) 轻链。
17. 权利要求12-16中任一项的用途，其中所述抗体选自扎木单 抗、凯利昔单抗、克立昔单抗、TNX/355、 TRX/1、 K)T4a、普立昔单 抗和4162W94。
18. 权利要求17的用途，其中所述抗体为扎木单抗。
19. 权利要求1-18中任一项的用途，其中所述辐射治疗选自补骨 脂素化合物与长波紫外线辐射(PUVA)、 UVB、窄谱UVB、高剂量 UVA、电子束和x射线的施用组合。
20. 权利要求19的用途，其中所述辐射治疗为补骨脂素化合物与 长波紫外线辐射(PUVA)的施用组合。
21. 权利要求20的用途，其中所述补骨脂素化合物具有以下通式<formula>formula see original document page 3</formula>或<formula>formula see original document page 3</formula>其中Rp R2、 R3、 R4、 RV和Rs独立地选自氢、卤素、C(wo)-烷 基和用面素、胺或羟基取代的Cn-io)-烷基，以及任选地用羟基取代的C(1-10)醚；或者R！和R5 —起形成吡咬并。
22. 权利要求1-21中任一项的用途，其中所述补骨脂素化合物选 自吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、7-曱基吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、5-甲氧基 补骨脂素、8-曱氧基补骨脂素、4,5',8-三甲基补骨脂素、4-曱基补骨脂 素、4,4-二甲基补骨脂素、4-5'-二曱基补骨脂素、4',8-甲氧基补骨脂素、 4'-(co-氨基-2-氧杂)烷基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-(4-氨基-2-氧杂)-丁 基-4,5'，8-三甲基补骨脂素、4'-氯曱基-4,5',8-三曱基补骨脂素、4'-氨基-曱基-4,5',8-三曱基补骨脂素、4'-(2-羟基乙氧基)-甲基-4,5',8-三甲基-补 骨脂素、4'-(6-羟基己氧基)-曱基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-羟曱基 -4,5',8-三甲基补骨脂素、5-甲基-白芷素和2H-呋喃并[2,3-h][l]苯并吡 喃-2-酮。
23. 权利要求22的用途，其中所述补骨脂素化合物为5-曱氧基 补骨脂素或8-甲氧基补骨脂素。
24. 权利要求1-23中任一项的用途，其中所述临床疾病为恶性疾 病或炎性皮力夫病。
25. 权利要求24的用途，其中所述临床疾病为恶性疾病。
26. 权利要求24或权利要求25的用途，其中所述恶性疾病选自 白血病和淋巴瘤。
27. 权利要求24-26中任一项的用途，其中所述恶性疾病为T细 胞前淋巴细胞性白血病。
28. 权利要求24-26中任一项的用途，其中所述恶性疾病选自 CD4+皮肤T细胞淋巴瘤。
29. 权利要求28的用途，其中所述恶性疾病选自蕈样肉芽肿病、 赛谢综合征、淋巴瘤样丘瘆病和间变性大细胞淋巴瘤。
30. 权利要求24-26中任一项的用途，其中所述恶性疾病选自 CD4+结节性T细胞淋巴瘤。
31. 权利要求30的用途，其中所述恶性疾病选自外周T细胞淋 巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和间变性大T细胞淋巴瘤。
32. 权利要求24-31中任一项的用途，其中所述恶性疾病为至少 一种其它治疗方法难以治疗的。
33. 权利要求24的用途，其中所述临床疾病为炎性皮肤病。
34. 权利要求24或权利要求33的用途，其中所述炎性皮肤病选 自银屑病、皮炎湿渗、特应性皮炎、硬皮病、扁平苔藓和斑秃。
35. 权利要求24、 33或34中任一项的用途，其中所述炎性皮肤 病为至少一种其它治疗方法难以治疗的。
36. —种治疗恶性疾病的方法，所述方法包括给予其需要的患者 治疗有效量的CD4结合肽，并对所述患者进行辐射治疗。
37. 权利要求36的方法，其中所述恶性疾病选自白血病和淋巴瘤。
38. 权利要求36或权利要求37的方法，其中所迷恶性疾病为T 细胞前淋巴细胞性白血病。
39. 权利要求36或权利要求37的方法，其中所述恶性疾病选自 CD4+皮月夫T细胞淋巴瘤。
40. 权利要求39的方法，其中所述恶性疾病选自蕈样肉芽肿病、 赛谢综合征、淋巴瘤样丘瘆病和间变性大细胞淋巴瘤。
41. 权利要求36或权利要求37的方法，其中所述恶性疾病选自 CD4阳性结节性T细胞淋巴瘤。
42. 权利要求41的方法，其中所述恶性疾病选自外周T细胞淋 巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和间变性大T细胞淋巴瘤。
43. 权利要求36-42中任一项的方法，其中所述恶性疾病是至少 一种其它治疗方法难以治疗的。
44. 一种治疗炎性皮肤病的方法，所述方法包括给予其需要的患 者治疗有效量的CD4结合肽，并对所述患者进行辐射治疗。
45. 权利要求44的方法，其中所述炎性皮肤病选自银屑病、皮炎 湿渗、特应性皮炎、硬皮病、扁平苔藓和斑秃。
46. 权利要求44-45中任一项的治疗方法，其中所述炎性皮肤病是至少 一 种其它治疗方法难以治疗的。
47. —种调节临床疾病的辐射治疗的方法，所述方法包括给予其 需要的患者治疗有效量的CD4结合肽，并对所述患者进行辐射治疗。
48. 权利要求36-47中任一项的方法，其中所述CD4结合肽能够 结合人CD4。
49. 权利要求36-48中任一项的方法。其中所述CD4结合肽使用 哺乳动物细胞培养物生产。
50. 权利要求36-49中任一项的方法。其中所述CD4结合肽能够 活化p56^激酶。
51. 权利要求50的方法，其中所述p56^激酶的活化增加至少一 种抑制性衔接分子Dok-l和/或SfflP-l的磷酸化。
52. 权利要求36-51中任一项的方法，其中用于本发明的CD4结 合肽选自在结合至CD4阳性细胞时能够活化天然杀伤细胞的CD4结 合肽。
53. 权利要求36-52中任一项的方法，其中用于本发明的CD4结 合肽在结合至CD4阳性细胞时还能够结合天然杀伤细胞上的CD16, 并由此活化天然杀伤细胞。
54. 权利要求36-53中任一项的方法，其中CD4结合肽为抗CD4 抗体或其CD4结合片段。
55. 权利要求54的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
56. 权利要求54或权利要求55的方法，其中所述抗体为人源化 抗体。
57. 权利要求54或权利要求55的方法，其中所述抗体为人抗体。
58. 权利要求54-57中任一项的方法，其中所述抗体具有k型(k)轻链。
59. 权利要求54-58中任一项的方法，其中所述抗体选自扎木单 抗、凯利昔单抗、克立昔单抗、TNX/355、 TRX/1、 K)T4a、普立昔单 抗和4162W94。
60. 权利要求59的方法，其中所述抗体为扎木单抗。
61. 权利要求36-60中任一项的方法，其中所述辐射治疗选自补 骨脂素与长波紫外线辐射(PUVA)、 UVB、窄谱UVB、高剂量UVA、 电子束和x射线。
62. 权利要求61的方法，其中所述辐射治疗为补骨脂素与长波紫 外线辐射(PUVA),其中补骨脂素化合物在UVA治疗之前施用。
63. 权利要求62的方法，其中所述补骨脂素化合物具有以下通式<formula>formula see original document page 7</formula>或<formula>formula see original document page 7</formula>其中R、R2、 R3、 R4、 RV和Rs独立地选自氢、卤素、C(!-K))-烷 基和用由素、胺或羟基取代的C(wo)-烷基，以及任选地用羟基取代的 C(w。)醚；或者R和R5 —起形成吡啶并。
64.权利要求36-63中任一项的方法，其中所述补骨脂素化合物 选自吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、7-甲基吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、5-甲氧 基补骨脂素、8-曱氧基补骨脂素、4，5',8-三甲基补骨脂素、4-甲基补骨 脂素、4,4-二曱基补骨脂素、4-5'-二曱基补骨脂素、4',8-甲氧基补骨脂 素、4'-(co-M-2-氧杂)烷基-4,5',8-三曱基补骨脂素、4'-(4-#^-2-氧杂)-丁基-4，5'，8-三曱基补骨脂素、4'-氯甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-氨 基-甲基_4,5',8-三曱基补骨脂素、4'-(2-羟基乙氧基)-曱基-4,5'，8-三曱基-补骨脂素、4'-(6-羟基己氧基)-曱基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-羟曱基 -4，5',8-三甲基补骨脂素、5-甲基-白芷素和2H-呋喃并[2,3-h][l]苯并吡 喃-2誦酮。
65. 权利要求64的方法，其中所述补骨脂素化合物为5-甲氧基 补骨脂素或8-甲氧基补骨脂素。
66. 权利要求62-65中任一项的方法，其中所述补骨脂素化合物 在辐射治疗前的5-0.5小时的时间段内给予。
67. 权利要求66的方法，其中所述补骨脂素化合物在辐射治疗前 的2-1小时的时间段内给予。
68. 权利要求36-67中任一项的方法，其中所述CD4结合肽通过 静脉内、皮下或肌内注射给予。
69. 权利要求36-68中任一项的方法，其中所述CD4结合肽在辐 射治疗前给予至少一次。
70. 权利要求36-69中任一项的方法，其中所述CD4结合肽每周 给予一次。
71. 权利要求36-70中任一项的方法，其中所述患者以每周1-5 次的范围进行辐射治疗。
72. 权利要求36-71中任一项的方法，其中至少一种CD4结合肽 治疗和至少 一种辐射治疗在同 一周内给予。
73. 权利要求36-72中任一项的方法，其中所述CD4结合肽治疗 和辐射治疗在4-30周的时间段内给予。
74. 权利要求73的方法，其中所述CD4结合肽治疗和辐射治疗 在8-16周的时间段内给予。
75. 权利要求74的方法，其中所述CD4结合肽治疗和辐射治疗 在12周的时间段内给予。
76. 权利要求36-76中任一项的方法，其中所述辐射治疗局部给 予或给予至全皮肤。
77. 权利要求36-76中任一项的方法，其中所述辐射治疗给予至体外血液。
78. 权利要求77的方法，其中所述辐射治疗为光分离置换法。
79. —种药盒组件，所述药盒组件包含CD4结合肽和补骨脂素化 合物连同一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述药盒组件用作药 物。
80. —种药盒组件，所述药盒组件包含CD4结合肽和补骨脂素化 合物连同一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述药盒组件用作治疗 恶性疾病的药物。
81. —种药盒组件，所述药盒组件包含能够结合CD4的CD4结 合肽和补骨脂素化合物连同一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述 药盒组件用作与辐射治疗组合治疗恶性疾病的药物。
82. 权利要求80或81的药盒组件，其中所述恶性疾病选自白血 病和'淋巴瘤。
83. 权利要求80-82中任一项的用途，其中所述恶性疾病为T-细 胞前'淋巴细胞性白血病。
84. 权利要求80-82中任一项的用途，其中所述恶性疾病选自 CD4+皮肤T细胞淋巴瘤。
85. 权利要求84的用途，其中所述恶性疾病选自蕈样肉芽肿病、 赛谢综合征、淋巴瘤样丘渗病和间变性大细胞淋巴瘤。
86. 权利要求80-82中任一项的用途，其中所述恶性疾病选自 CD4+结节性T细胞淋巴瘤。
87. 权利要求86的用途，其中所述恶性疾病选自外周T细胞淋 巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和间变性大T细胞淋巴瘤。
88. 权利要求80-87中任一项的用途，其中所述恶性疾病是至少 一种其它治疗方法难以治疗的。
89. —种药盒组件，所述药盒组件包含CD4结合肽和补骨脂素化 合物连同 一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述药盒组件用作治疗 炎性皮月夫病的药物。
90. —种药盒组件，所述药盒组件包含CD4结合肽和补骨脂素化 合物连同一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述药盒组件用作与辐 射治疗组合治疗炎性皮肤病的药物。
91. 权利要求89或权利要求90的用途，其中所述炎性皮肤病选 自银屑病、皮炎湿渗、特应性皮炎、硬皮病、扁平苔藓和斑壳。
92. 权利要求89-91中任一项的用途，其中所述炎性皮肤病是至 少 一 种其它治疗方法难以治疗的。
93. —种药盒组件，所述药盒组件包含CD4结合肽和补骨脂素化 合物连同一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述药盒组件用作调节 辐射治疗的药物以治疗临床疾病。
94. 权利要求79-93中任一项的药盒组件，其中所述补骨脂素化 合物以治疗有效量存在。
95. 权利要求79-94中任一项的药盒组件，其中所述CD4结合肽 以治疗有效量存在。
96. 权利要求79-95中任一项的药盒组件，其中所述CD4结合肽 能够结合人CD4。
97. 权利要求79-96中任一项的药盒组件，其中所述CD4结合肽 使用哺乳动物细胞培养物生产。
98. 权利要求79-97中任一项的药盒组件，其中所述CD4结合肽 能够活化p56^激酶。
99. 权利要求98的药盒组件，其中p56^激酶的活化增加至少一 种抑制性衔接分子Dok-l和/或SfflP-l的磷酸化。
100. 权利要求79-99中任一项的药盒组件，其中所述CD4结合 肽选自在结合至CD4阳性细胞时能够活化天然杀伤细胞的CD4结合 肽。
101. 权利要求100的药盒组件，其中所述药盒中的CD4结合肽 在结合至CD4阳性细胞时能够结合天然杀伤细胞上的CD16,由此活 化天然杀伤细胞。
102. 权利要求79-101中任一项的药盒组件，其中所述CD4结合 肽为抗CD4抗体或其CD4结合片段。
103. 权利要求102的药盒组件，其中所述抗体为单克隆抗体。
104. 权利要求102或权利要求103的药盒组件，其中所述抗体为 人源化抗体。
105. 权利要求102或权利要求103的药盒组件，其中所述抗体为 人抗体。
106. 权利要求102-105中任一项的药盒组件，其中所述抗体具有 K型0c)轻链。
107. 权利要求102-106中任一项的药盒组件，其中所述抗体选自 扎木单抗、凯利昔单抗、克立昔单抗、TNX/355、 TRX/1、 10T4a、普 立昔单抗和4162W94。
108. 权利要求106的药盒组件，其中所述抗体为扎木单抗。
109. 权利要求79-108中任一项的药盒组件，其中所述补骨脂素 化合物具有以下通式其中Ri、 R2、 R3、 R4、 RV和R5独立地选自氢、卤素、C(wo)-烷 基和用卣素、胺或羟基取代的C(wo)-烷基，以及任选地用羟基取代的 Cn—iQ)醚；或者R！和R5 —起形成吡咬并。
110. 权利要求79-109中任一项的药盒组件，其中所述补骨脂素 化合物选自吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、7-甲基吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、 5-曱氧基补骨脂素、8-甲l^补骨脂素、4,5',8-三甲基补骨脂素、4-甲 基补骨脂素、4,4-二甲基补骨脂素、4-5'-二曱基补骨脂素、4',8-甲氧基 补骨脂素、4'-((D-氨基-2-氧杂)烷基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-(4-M -2-氧杂)-丁基-4,5',8-三曱基补骨脂素、4'-氯曱基-4,5',8-三曱基补骨脂 素、4'-氨基-甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-(2-羟基乙氧基)-甲基-4,5',8-三甲基-补骨脂素、4'-(6-羟基己氧基)-曱基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-羟甲基-4，5'，8-三甲基补骨脂素、5-甲基-白芷素和2H-呋喃并[2,3-h][1] 苯并吡喃-2-酮。
111. 权利要求110的药盒组件，其中所述补骨脂素化合物为5-甲氧基补骨脂素或8-甲氧基补骨脂素。
112. 权利要求79-111中任一项的药盒组件，其中所述药盒组件 配制为单位剂型，其中每单位剂量的CD4结合肽为在20 mg至2000 mg范围内的肽。
113. 权利要求79-112中任一项的药盒组件，其中所述药盒组件 配制为单位剂型，其中每单位剂量的补骨脂素为在10mg至50mg范 围内的补骨脂素化合物。
114. 权利要求79-113中任一项的药盒组件，其中所述CD4结合 肽处于适合于胃肠外给予的制剂中。
115. 权利要求79-114中任一项的药盒组件，其中所述CD4结合 肽坤皮配制为溶液或适合于制备悬浮液或溶液的粉末。
116. 权利要求79-115中任一项的药盒组件，其中所述补骨脂素 化合物处于适合于口服或局部给予的制剂中。
117. 权利要求79-116中任一项的药盒，其中所述补骨脂素化合 物被配制为选自片剂、胶嚢剂、乳剂、洗剂或软膏剂的形式。
118. —种CD4结合肽，所述CD4结合肽用于在接受或将接受辐 射治疗的个体中治疗恶性疾病或炎性皮肤病。
119. 一种CD4结合肽，所述CD4结合肽与辐射治疗组合用于治 疗恶性疾病或炎性皮肤病。
120. —种CD4结合肽，所述CD4结合肽用于调节临床疾病的辐 射治疗。
121. 权利要求118-120中任一项的CD4结合肽，其中所述CD4 结合肽能够结合人CD4。
122. 权利要求118-121中任一项的CD4结合肽，其中所述CD4 结合肽使用哺乳动物细胞培养物生产。
123. 权利要求118-122中任一项的CD4结合肽，其中所述CD4 结合肽能够活化p56欣激酶。
124. 权利要求123的CD4结合肽，其中p56kk激酶的活化增加 至少一种抑制性衔4妻分子Dok-l和/或SHIP-1的磷酸化。
125. 权利要求118-123中任一项的CD4结合肽，其中所述CD4 结合肽选自在结合至CD4阳性细胞时能够活化天然杀伤细胞的CD4 结合肽。
126. 权利要求125的用途，其中所述CD4结合肽在结合至CD4 阳性细胞时能够结合天然杀伤细胞上的CD16,并由此活化天然杀伤 细胞。
127. 权利要求118-126中任一项的CD4结合肽，其中所述CD4 结合肽为抗CD4抗体或其CD4结合片段。
128. 权利要求127的CD4结合肽，其中所述抗体为单克隆抗体。
129. 权利要求127或权利要求128的用途，其中所述抗体为人源 化抗体。
130. 权利要求127或权利要求128的CD4结合肽，其中所述抗 体为人抗体。
131. 权利要求127-130中任一项的CD4结合肽，其中所述抗体具有K型(K)轻链。
132. 权利要求127-131中任一项的CD4结合肽，其中所述抗体选自扎木单抗、凯利昔单抗、克立昔单抗、TNX/355、 TRX/1、 10T4a、 普立昔单抗和4162W94。
133. 权利要求132的CD4结合肽，其中所迷抗体为扎木单抗。
134. 权利要求127-133中任一项的CD4结合肽，其中所述辐射 治疗选自补骨脂素化合物与长波紫外线辐射(PUVA)、 UVB、窄谱 UVB、高剂量UVA、电子束和x射线的施用组合。
135. 权利要求134的CD4结合肽，其中所述辐射治疗为补骨脂 素化合物与长波紫外线辐射(PUVA)的施用组合。
136. 权利要求135的CD4结合肽，其中所迷补骨脂素化合物具 有以下通式其中Rh R2、 R3、 R4、 RV和Rs独立地选自氢、卤素、C(wo)-烷 基和用囟素、胺或羟基取代的C(wo)-烷基，以及任选地用羟基取代的 C(wo)醚；或者R！和R5 —起形成吡啶并。
137.权利要求127-136中任一项的CD4结合肽，其中所述补骨 脂素化合物选自吡啶并-[3,4-c]补骨脂素、7-甲基吡啶并-[3,4-c]补骨脂 素、5-曱氧基补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、4,5',8-三曱基补骨脂素、 4-甲基补骨脂素、4,4-二甲基补骨脂素、4-5'-二曱基补骨脂素、4',8-曱 氧基补骨脂素、4'-((D-氨基-2-氧杂)烷基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-(4-氨基-2-氧杂)-丁基-4,5',8-三甲基补骨脂素、4'-氯甲基-4,5',8-三曱基补 骨脂素、4'-M-甲基-4,5',8-三曱基补骨脂素、4'-(2-羟基乙氧基)-曱基 國4,5'，8-三曱基-补骨脂素、4'-(6-羟基己氧基)-甲基-4，5',8-三甲基补骨脂 素、4'-羟甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素、5-甲基-白芷素和2H-呋喃并 [2,3-h][l]苯并吡喃-2-酮。
138.权利要求137的CD4结合肽，其中所述补骨脂素化合物为 5-甲氧基补骨脂素或8-曱氧基补骨脂素。
全文摘要
本发明涉及能够结合CD4的肽，例如抗体，及其调节临床疾病的辐射治疗的用途。辐射治疗例如可通过用PUVA治疗。
文档编号A61P17/00GK101287493SQ200680038287
公开日2008年10月15日 申请日期2006年8月18日 优先权日2005年8月18日
发明者D·亚历山大, O·巴德斯加德, P·帕伦 申请人:根马布股份公司