炎症疾病治疗剂的制作方法

炎症疾病治疗剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含与下列物质结合的单克隆抗体或其抗原结合片段：含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体的，与组蛋白相关的炎症治疗剂。
NITE BP-972
20100817
【专利说明】炎症疾病治疗剂
[0001]【关联申请】
[0002] 本专利申请伴随基于作为在先申请的日本专利申请的特愿2012-35965号（申请 日：2012年2月22日）的优先权的主张。在所涉及的在先的专利申请中的全部公开内容 引用通过作为本说明书之一部分。 【【技术领域】】
[0003] 本发明涉及以单克隆抗体或其抗原结合片段作为有效成分的新颖的炎症疾病治 疗剂。 【【背景技术】】
[0004] 近年、作为损伤关联分子样式分子组（DAMPs :Damage_associated molecular pattern molecules),报告有作为核内的构成成分的组蛋白。这样的损伤关联分子样式分 子组作为器官伤害等的炎症疾病的原因受到关注。
[0005] 另一方面，败血症是以如感染症、肝硬化、肾功能衰竭、糖尿病、异常分娩一样的疾 病或，如留置导管、输液器具、透析、气管切开一样的对伤或疾病的治疗作为原因，不从细菌 感染巢断绝或细菌断续地侵入血液的重症全身性感染症。另外，败血症不限于由广泛微生 物所致的宿主的侵袭，感染症的临床症状、即定义为满足（1)体温>38°C至<36°C; (2)心率 >90 次/分；（3)呼吸率>20 次呼吸/分至PaC02〈32mmHg ;(4)白细胞数>12000/μ 1、〈4000/ μ 1至杆状核嗜中性粒细胞>10%之中2项以上的病态。最近将显示这样的症状的病态称 为全身性炎症反应综合征（Systemic inflammatory response symdrome :SIRS)(非专利文 献I :Crit. Care Med.，20 :864-874, 1992)。再者败血症也包含合并器官功能障碍、低灌流 或低血压而合并重症败血症、乳酸性酸中毒、乏尿、意识障碍的败血症性休克等（非专利文 献2 :Chest，101 :1644-1655, 1992)。然后病态从重症败血症、败血症休克导致弥散性血管 内凝血综合征（DIC)、成人呼吸穹迫综合征（ARDS)、多器官功能障碍（MODS)。
[0006] 作为这样的败血症的原因菌，主要确认葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞 菌、克雷伯菌（Klebsiella)、肠杆菌（Enterobacter)等。由这些的细菌感染显示高热、恶 寒、频脉、强的全身症状，从而屡屡在动一静脉血、髓液、骨髓液中确认感染菌。
[0007] 近年，由各种强力的抗生物质的开发导致以这些的菌作为原因的败血症变少，由 获得以MRSA作为代表的抗性基因的新的病原菌所致的败血症增加。另外，反映使用留置导 管或输液器具的处置、或者人工透析、气管切开等的侵袭的处置一手术的广泛使用，败血症 的发生越是大医院越有增加倾向。再者，在对于感染抵抗力低的新生儿、高龄者、造血器肿 瘤患者的发症频度、及在施用肾上腺皮质激素或抗癌剂，免疫力降低的患者的败血症的发 症频度增加。由这些，败血症随着医疗的进步反到持续增加。
[0008] 作为这样的败血症的预防一治疗方法，现在已知，检测原因菌而测定其抗生物质 感受性，施用对于起因菌最适的抗生物质的同时，如补液、电解质补正、低蛋白血症的改善、 营养的补给、Y-球蛋白的施用一样的致力于宿主的防卫力的方法等。另外，不幸地，陷入 休克时，进行利用外科手术的病巢的除去、循环障碍的改善、调理素活化物质的施用、肾上 腺皮质激素的施用、合成蛋白酶抑制剂的施用等的处置。但是，由于基础疾病的症状与败 血症的症状重叠，难以进行明确的诊断，导致败血症的预防一治疗困难的情况也屡屡见到。 再者，陷入败血症性休克等时，其预防一治疗是困难，败血症是在现在导致高的死亡率的疾 病。
[0009] 败血症的死亡率是10%?20%，甚至50%，报告不一。败血症休克占败血病例的 40 %，休克例的预后不良，也有77?90 %的死亡率的报告。所以，败血症性休克的预防成为 治疗的第一目标，特别是，掌握在休克的初期阶段发生的变化而可进行早期诊断，则早期治 疗变得可能，可期待预后的改善。但是至今，对多种被认为有效的抗休克药或治疗法的临床 效果有探讨，但其中被判断为有效的则几乎没有。
[0010] 败血症被认为是以由感染刺激（菌自体、内毒素或肽聚糖/磷壁酸复合物的细胞 壁成分及外毒素等）从单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等过量地产生的肿瘤坏死因子 (TNF)、白细胞介素 I (IL-I)、白细胞介素6 (IL-6)及白细胞介素8 (IL-8)等的炎症性细胞因 子作为原因而发症。由过量地产生的炎症性细胞因子，类花生酸或血小板活化因子的脂质 介质也被释放，由它们的相互作用而细胞因子网络被活化，炎症反应扩增。在此过程之中， 补体系统、凝固系、激肽系统、肾上腺皮质刺激激素/内啡肽系统也被活化，引发以血管内 皮障碍作为基础病态的全身性的炎症反应。特别是，在循环障碍或组织障碍的表达中显示 粒细胞来源的弹性蛋白酶或活性氧的相关。
[0011] 因此，进行了多数如抑制炎症性细胞因子一样的物质的施用等所代表的炎症性细 胞因子抑制疗法的临床治验。但是它们以完全的失败告终（非专利文献3 :Lancet，351 : 929-933, 1998、JAMA，271 :1836-1843, 1994)。
[0012] 尽管这样的各种的治疗方法被探讨，败血症的死亡率依然居高不下，有效的治疗 药也几乎没有。其理由是尚未完全地理解败血症的病态（非专利文献4 :Nath. J. Med.，55 : 132-141， 1999)。
[0013] 另外，作为损伤关联分子样式分子组相关的别的炎症疾病，缺血再灌注伤害被报 告。另外报告有，起因于肾缺血再灌注伤害，从而急性肾功能衰竭屡屡发生。但是，对这样 的病态的有效的治疗法几乎没有。
[0014] 从而，依然要求创造对损伤关联分子样式分子组相关的炎症疾病的优良的治疗 剂。
[0015] 【现有技术文献】
[0016]【非专利文献】
[0017] 非专利文献 I :Crit. Care Med.，20 :864-874, 1992
[0018] 非专利文献 2 :Chest，101 :1644-1655, 1992
[0019] 非专利文献 3 :Lancet，351 :929-933, 1998、JAMA，271 :1836-1843, 1994
[0020] 非专利文献 4 :Nath. J. Med.，55 :132-141，1999
[0021] 【发明概述】
[0022] 本发明人此番发现、可特异性地识别含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID N0:1)所示的氨基 酸序列的肽的单克隆抗体或其抗原结合片段对于组蛋白相关的炎症疾病发挥优良的治疗 效果。本发明基于该见解作出。
[0023] 从而，本发明旨在提供对炎症疾病的新颖的治疗剂。
[0024] 然后，本发明提供包含与含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID N0:1)所示的氨基酸序列的肽 或该肽和药学上可容许的载体的结合体结合的单克隆抗体或抗原结合片段的炎症疾病治 疗剂。
[0025] 本发明的单克隆抗体或抗原结合片段可有效治疗炎症疾病。 【【专利附图】

【附图说明】】
[0026] 【图1】示本发明的单克隆抗体（以下称为"SSVmAb"）的同种型的鉴定试验的结 果。
[0027] 【图2】示关于本发明的单克隆抗体（SSVmAb)，比较向组蛋白H1、组蛋白H2A、H2B、 H3或H4的结合亲和性的试验的结果。
[0028] 【图3】示关于参考例：保藏号FERMBP-10413的原保藏的杂交瘤16G9所产生的单 克隆抗体（以下，也称为"16G9mAb"），比较向组蛋白H1、组蛋白H2A、H2B、H3或H4的结合 亲和性的试验的结果。
[0029] 【图4】示使用本发明的单克隆抗体（SSVmAb)及16G9mAb的混合淋巴细胞反应 (MLR)试验的结果。
[0030] 【图5】示由流式细胞术比较本发明的单克隆抗体（SSVmAb)及16G9mAb的对T细 胞的反应性的结果。
[0031] 【图6】A示关于本发明的单克隆抗体（SSVmAb)及对照试剂（同种型IgGl)的，使 用ATP合成酶未被siRNA敲落的脾脏细胞的MLR试验的结果。B示关于本发明的单克隆抗 体（SSVmAb)及对照试剂（同种型IgGl)的，使用ATP合成酶被siRNA敲落的脾脏细胞的 MLR试验的结果。
[0032] 【图7】是示在试验例7中，本发明的单克隆抗体（SSVmAb)在败血症模型中提高动 物的生存率的图。
[0033] 【图8】是示在试验例8中，本发明的单克隆抗体（SSVmAb)在败血症模型中提高动 物的生存率的图。
[0034] 【图9】示在试验例8的对照组及SSV mAb施用组中，测定血液样品（血清）中及 肺中的组蛋白Hl浓度的结果。图9A是血液样品中的组蛋白Hl浓度的坐标图。图9B是肺 中的组蛋白Hl浓度的坐标图。
[0035] 【图10】示在试验例8的对照组及SSV mAb施用组中，测定血液样品中及肺中的组 蛋白H3浓度的结果。图IOA是血液样品中的组蛋白H3浓度的坐标图。图IOB是肺中的组 蛋白H3浓度的坐标图。
[0036] 【图11】示在试验例8的对照组及SSV mAb施用组中，测定血液样品中及肺中的组 蛋白H4浓度的结果。图IlA是血液样品中的组蛋白H4浓度的坐标图。图IlB是肺中的组 蛋白H4浓度的坐标图。
[0037] 【图12】是试验例8的试验结束后，从健康大鼠、以及SSV mAb施用组及对照组的 大鼠取得，染色的肺组织切片的显微镜照片。图12A是健康大鼠的照片。图12B是SSV mAb 施用组的照片。图12C是对照组的照片。
[0038] 【图13】是示试验例8的试验结束后，对于SSV mAb施用组及对照组的大鼠，关于 郁血、浮肿、炎症及出血评价的结果的坐标图。
[0039] 【图14】示在试验例8的对照组及SSV mAb施用组中，测定炎症性细胞因子 (TNF-a、IL-I β、IL-6)和抑制性细胞因子（IL-10)的血液样品中浓度的结果。图14A示 血液样品中的TNF-α浓度。图14Β示血液样品中的IL-I β浓度。图14C示血液样品中的 IL-6浓度。图14D示血液样品中的IL-10浓度。
[0040] 【实施方式】
[0041] 【保藏】
[0042] 本发明的杂交瘤小鼠-小鼠杂交瘤SSV-C93-3是在原保藏日2010年8月17日， 在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心（住所：日本国千叶县木更津 市上总镰足2-5-8生物技术本部），以保藏号NITE ΒΡ-972被原保藏。
[0043]【单克隆抗体及杂交瘤】
[0044] 本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段以与含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID Ν0:1)所示 的氨基酸序列的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体结合作为一个特征。涉及的单克 隆抗体或其抗原结合片段对于炎症疾病发挥优良的治疗效果是意外的事实。
[0045] 本发明的炎症疾病优选为与组蛋白相关的炎症疾病，更优选为急性炎症疾病，更 优选为败血症、肾缺血再灌注伤害或肾功能衰竭，再优选为败血症、肾缺血再灌注伤害或急 性肾功能衰竭，再更优选是败血症。
[0046] 根据本发明的优选的实施方式，上述抗体或其抗原结合片段针对含 SSVLYGGPPSAA(SEQ ID Ν0:1)所示的氨基酸序列的肽或该肽和药学上可容许的载体。
[0047] 另外，根据本发明之一的实施方式，上述抗体或其抗原结合片段特异性地结合组 蛋白Η1、组蛋白Η3及组蛋白Η4。有涉及的结合能的抗体或其抗原结合片段如后述的实施 例中的8-2所示，可在炎症疾病的治疗中特别有利地利用。
[0048] 另外，根据本发明的一实施方式，上述抗体或其抗原结合片段相比对接头组蛋白 (组蛋白Hl)的结合亲和性，对核心组蛋白的结合亲和性更高。
[0049] 另外，根据本发明的优选的实施方式，核心组蛋白是组蛋白Η2Α、Η2Β、Η3或Η4,更 优选为Η2Α、Η3或Η4。
[0050] 另外，本发明的抗体或其抗体结合片段可含重链及/或轻链。各轻链及重链可在 其N-末端具有可变区域，在各可变区域中交替含4个框架区域（framework region) (FR) 和，3个互补性决定区域（CDR)。可变区域中的残基根据由Kabat等考虑的系统习惯性地编 号。此系统在 Kabat 等，1987、Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Departement of Health and Human Services，NIH, USA 中有记述。除非特别说明，本说明 书中使用此编号体系。基于这样的Kabat等的方法的编号可使用例如，网站http://WWW. bioinf. org. uk/abysis/tools/analyze. cgi 简易也进行。
[0051] Kabat残基命名法与氨基酸残基的直线编号未必直接一致。实际的直线的氨基 酸序列，尽管有基本可变区域结构的结构的要素、框架或CDR之任何，但对应于其缩短或插 入，相比严格的Kabat编号有更少的或追加的氨基酸。残基的正确的Kabat的编号是，对于 给定的抗体，通过将"标准的'Tiabat编号的序列和抗体的序列中的相同性残基对齐来确定。
[0052] 根据一实施方式，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区域包含含有：含 RASSSVSYMH(SEQ ID N0:2)所示的氨基酸序列的 CDR1、含 ATSNLAS(SEQ ID N0:3)所示的氨 基酸序列的⑶R2、及含QQWSSNPWT(SEQ ID N0:4)所示的氨基酸序列的⑶R3。根据再优选 的实施方式，上述轻链可变区域含SEQ ID NO: 6的第23位?第128位所示的氨基酸序列。
[0053] 另外，根据别的实施方式，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区域包含 含有：含 GYNMN(SEQ ID N0:7)所示的氨基酸序列的 CDR1、含 NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQ ID N0:8)所示的氨基酸序列的⑶R2、及含SPYYSNYWRYFDY(SEQ ID N0:9)所示的氨基酸序列的 ⑶R3。根据再优选的实施方式，上述重链可变区域含SEQ ID NO: 11的第20位?第141位 所示的氨基酸序列。
[0054] 另外，根据本发明的更加优选的实施方式，本发明的抗体或其抗原结合片段包含 含有下列⑶Rl?3的轻链可变区域：含RASSSVSYMH(SEQ ID N0:2)所示的氨基酸序列的 CDR1、含 ATSNLAS(SEQ ID N0:3)所示的氨基酸序列的 CDR2、及含 QQWSSNPWT(SEQ ID N0:4) 所示的氨基酸序列的CDR3 ;包含含有下列CDRl?3的重链可变区域：含GYNMN(SEQ ID N0:7)所示的氨基酸序列的CDR1、含NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQ ID N0:8)所示的氨基酸序列 的CDR2、及含SPYYSNYWRYFDY(SEQ ID N0:9)所示的氨基酸序列的CDR3。
[0055] 另外，根据本发明的更加优选的实施方式，本发明的抗体或其抗原结合片段包含： 含SEQ ID N0:6的第23位?第128位所示的氨基酸序列的轻链可变区域，和含SEQ ID NO: 11的第20位?第141位所示的氨基酸序列的重链可变区域。
[0056] 另外，根据本发明的优选的实施方式，上述单克隆抗体或其抗原结合片段可下调 ATP合成酶活性。另外，根据本发明的更优选的实施方式，上述ATP合成酶是线粒体的ATP 合成酶。
[0057] 本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段之上述结合亲和性及ATP合成酶活性的 下调活性例如，由本申请说明书的试验例2及4中记载的方法确认。
[0058] 另外，本发明的单克隆抗体优选为，嵌合抗体、人源化抗体或完全人型抗体。这 些抗体可由本领域技术人员基于例如，Morrison, S. L.，Oi，V. T.，"immunoglobulin genes" Academic Press (London), 260-274 (1989) > Roguska, M. L. et. Al. , Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 969-973 (1994) > Tomizuka, K. et. al. Functional expressionand germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice, Nature Genet. , 16, 133-143(1997)> Winter, G. et. al. , Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. Tmmunol · , 12, 433-455 (1994)、Griffiths, A. D. et. al. , Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires, ΕΜΒ0. J.，13, 3245-3260(1994)等中记载的现有【技术领域】的公知技术来制造。
[0059] 另外，根据本发明的优选的实施方式，上述抗原结合片段优选为Fab、Fab'、 (Fab，） 2、Fv 或 scFv。
[0060] 另外，根据本发明的别的优选的实施方式，上述单克隆抗体或其抗原结合片段由 杂交瘤小鼠-小鼠杂交瘤SSV-C93-3产生。
[0061] 本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、及杂交瘤可例如，如以下一样制造。艮P， 首先，本发明的杂交瘤可通过，将含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID N0:1)所示的氨基酸序列的肽或 该肽和药学上可容许的载体的结合体作为致敏抗原使用，使利用此致敏抗原免疫的哺乳动 物的浆细胞（免疫细胞）与哺乳动物的骨髓瘤细胞融合，对得到的杂交瘤进行克隆，从该杂 交瘤中筛选来得到。然后，本发明的单克隆抗体可通过培养本发明的杂交瘤，回收其产生的 抗体而得到。
[0062] 作为免疫哺乳动物的方法,可使用在现有【技术领域】的一般施用法,具体而言,可举 出腹腔内注射、脾脏内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、经口施用、经粘膜施用、经皮 施用等，优选为腹腔内注射、脾脏内注射。致敏抗原的施用间隔根据致敏抗原的施用量及哺 乳动物的种类等适宜决定，但可设为例如，每1个月间数次。
[0063] 免疫的哺乳动物不特别限定，但优选考虑细胞融合中使用的与骨髓瘤细胞的适合 性等而选择，可举出例如，小鼠、大鼠、仓鼠等，优选为小鼠。
[0064] 另外，作为免疫细胞，优选使用脾细胞。
[0065] 作为本发明中使用的骨髓瘤细胞，可举出例如，P3(P3X63Ag8. 653) (J. Immunol.， 123，1548，1978)、p3_Ul (Current Topics in Micro-biology 及 Immunology, 81，1-7, 1978)、NS-I (Eur.J. Immunol.，6, 511-519, 1976)、MPC-Il (Cell，8, 405-415, 1976)、 Sp2/0-Agl4 (Nature, 276, 269-270, 1978), FO (J. Immunol. Meth. ,35, 1-21, 1980), S194(J. Exp. Med. ,148,313-323, 1978)、及 R210 (Nature, 277, 131-133, 1979)等，优选为 P3 或 P3-U1，更优选为P3。
[0066] 免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合可根据例如，Milstein等（Milstein et. al.) 的方法（Methods Enzymol.，73, 3-46, 1981)等进行。具体而言，细胞融合可通过例如，在融 合促进剂的存在下、在培养基中使免疫细胞和骨髓瘤细胞混合来实施。然后，在细胞融合 中，可添加适宜培养基，重复离心分离的操作而生成杂交瘤。
[0067] 作为细胞融合中使用的培养基，可举出例如，RPMI-1640培养基、MEM培养基等的 细胞融合中通常使用的培养基。另外，可适宜联用牛胎儿血清（FBS)等的血清补液。
[0068] 另外，细胞融合温度优选于25?37°C，更优选于30?37°C。
[0069] 另外，骨髓瘤细胞和免疫细胞的混合比率优选为1:1?1:10左右。
[0070] 作为融合促进剂，可举出例如，聚乙二醇（PEG)、仙台病毒（HVJ)等，优选为PEG。 PEG的分子量可适宜选择，例如，平均分子量可为1，000?6, 000左右。另外，培养基中的 PEG的浓度优选为约30?60% (W/V)。
[0071] 另外，可根据期望将二甲基亚砜等的辅助剂适宜添加到培养基中。
[0072] 本发明的杂交瘤的选择可通过，将由细胞融合得到的杂交瘤在例如，HAT培养基 等的通常的选择培养基中培养，使用通常的有限稀释法，作为例如，对含SSVLYGGPPSAA(SEQ ID NO: 1)所示的氨基酸序列的肽或该肽和药学上可容许的载体的结合体的抗体价等指标 而进行筛选来实施。利用HAT培养基的培养期间是对于杀灭作为目的的杂交瘤以外的细胞 (未融合细胞）充分的时间，通常可为数天?数周。如此得到的本发明的杂交瘤可在通常的 培养基中进行继代培养，另外，可在液氮中长期保存。
[0073]另外，作为回收本发明的单克隆抗体或其抗体结合片段的方法，可举出例如，将杂 交瘤根据常规方法培养，从该培养上清得到单克隆抗体等的方法、或者将杂交瘤施用于与 此有适合性的哺乳动物而使增殖，从其腹水得到单克隆抗体等的方法等。其中，前者的方法 对于得到高纯度的抗体而言优选，另一方面，后者的方法对于大量地生产抗体而优选。
[0074] 再者，本发明的单克隆抗体或其抗体结合片段可由盐析法、凝胶过滤法、亲和性层 析等的方法纯化至高纯度。
[0075] 本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，如上所述，对与组蛋白相关的炎症疾病 有优良的治疗效果。从而，根据本发明的别的实施方式，在炎症疾病治疗剂的制造中提供本 发明的单克隆抗体的使用。另外，在上述方法中，炎症疾病优选为与组蛋白相关的炎症疾 病，更优选为急性炎症疾病，更优选为败血症、肾缺血再灌注伤害或肾功能衰竭，再优选为 败血症、肾缺血再灌注伤害或急性肾功能衰竭，再更加优选是败血症。另外，本发明的单克 隆抗体或其抗原结合片段可直接使用，也可与药学容许的添加剂等一同作为医药组合物使 用。从而，根据本发明之一的实施方式，提供含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的炎 症疾病治疗用的医药制剂。
[0076] 本发明的败血症治疗剂，例如，可将本发明的单克隆抗体溶解于注射用生理盐水、 注射用蒸馏水、注射用缓冲溶液等而制备。再者，在本发明的免疫抑制用组合物中可含有 适当的溶剂、溶解辅助剂、保存剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、张度剂、缓冲剂、赋形 齐?、增粘剂、着色剂、公知的载体（各种脂质体、聚氨基酸载体、合成高分子、天然高分子等） 等。
[0077] 另外，根据本发明的别的实施方式提供炎症疾病的治疗方法，其包括向受试者施 用有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。其中，"治疗"是指改善确立的病态。 另外，根据本发明的别的实施方式，提供减轻受试者的炎症疾病的发生风险的方法，包括向 受试者施用有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。另外，在上述方法中，炎症疾 病优选为与组蛋白相关的炎症疾病，更优选为急性炎症疾病，更优选为败血症、肾缺血再灌 注伤害或肾功能衰竭，再优选为败血症、肾缺血再灌注伤害或急性肾功能衰竭，再更加优选 是败血症。
[0078] 另外，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可发挥显著的免疫抑制作用。可在 炎症疾病治疗中使用的上述单克隆抗体或其抗原结合片段可产生免疫抑制作用是意外的 事实。从而，根据一个的实施方式，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段作为免疫抑制剂 使用。
[0079] 另外，根据一实施方式，作为上述待测样品，优选为哺乳动物，更优选为人。
[0080] 另外，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段也可与炎症疾病中使用的其他药剂 组合而同时或依次施用给哺乳动物。
[0081] 另外，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可全身或局部地施用，作为具体性 的施用方法，可举出点滴、静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、经口施用、经粘膜 施用、经皮施用等。
[0082] 另外，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段的有效量不特别限定，可由本领域技 术人员根据待测样品的种类、性质、性别、年龄、症状等而适宜决定。例如，作为涉及的有效 量，可举出1次或数次0. 05?40mg/体重kg/日、优选为2?IOmg/体重kg/日等。 【实施例】
[0083] 以下，举实施例具体说明本发明，本发明不限于这些实施例。
[0084] 【实施例1 :单克隆抗体（SSVmAb)的制造】
[0085] 【抗原物质的制造】
[0086] 作为抗原物质，使用含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的肽及KLH的结合体。
[0087] 在抗原物质的制备中，首先，含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的肽由Fmoc肽 固相合成法（制造装置；ABI430型Applied Biosystems公司制）合成。再者，上述肽及 KLH(SIGMA公司制）的结合体是将上述肽5mg、KLH约20mg及戊二醛30 μ g(片山化学工业 株式会社）在磷酸缓冲液（pH 8. 0)中，于室温搅拌约6小时而合成。
[0088] 【杂交瘤的制造】
[0089] 【免疫】
[0090] 将在PBS中溶解抗原物质的溶液0. 8mL(抗原物质浓度：0. 5mg/mL)和弗氏完全佐 剂（和光纯药株式会社制）〇. 8mL混合，得到悬浮液（抗原浓度：0. 25mg/mL)。接下来，将此 悬浮液0.2mL腹腔内施用给BALB/c小鼠。再者，将此悬浮液每2周以同量施用给小鼠。然 后，从施用开始16周后，将溶解PBS中抗原的溶液0. 2mL (抗原浓度：600?1000mg/mL)最 终施用到小鼠腹腔内。再有，在施用时，从眼底静脉进行采血，由ELISA测定抗体价。最终 施用的4天后，进行全采血，将得到的血液离心分离（2000rpm、20分钟），得到抗血清而作为 以下的实验的对照抗血清使用。另外，全采血后，从大鼠摘出脾脏，将得到的脾细胞在以下 的细胞融合中使用。
[0091] 【细胞融合】
[0092] 将上述的脾细胞及骨髓瘤细胞（P3X63_Ag. 8. 653)以脾细胞：骨髓瘤细胞= 10:1?10混合而进行离心分离（1500rpm，5分钟）。离心分离之后，使用吸吐器除去上清， 向得到的细胞沉淀经1分钟添加37°C的聚乙二醇4000 (50% PBS溶液）ImL而作为混合液。 将此混合液于37 °C静置1分钟之后，每30秒钟加 ImL的37 °C的IMDM培养基（计9mL)之 后，进行离心分离（1500rpm、5分钟）。离心分离后，将上清吸除，适量添加37°C的含有15% FCS(JRH BI0SCIENCES制）的頂DM(GIBO)制）培养基。将得到的悬浮液向96孔培养板进 行各IOOmL分注，在37°C /5% CO2温育器中培养1天。再者，添加 HAT培养基（将HAT粉 末（HAT MEDIA SUPPLEMENT (X 50)、SIGMA制）溶解于无血清MDM培养基IOmL中，用含有 10% FCS的MDM培养基稀释50倍的）IOOmL,在37°C /5% CO2温育器中培养。每2?3 天进行HAT培养基的更换，10天后切换为HT培养基（将HT粉末（HT MEDIA SUPPLEMENT、 SIGMA制）溶解于无血清MDM培养基IOmL中，用含有10% FCS的MDM培养基稀释50倍 的），在37°C /5% CO2温育器中进行3天培养。之后每2?3天进行培养基（HT培养基） 的更换。由显微镜确认细胞增殖之后，回收培养上清（约IOOmL)。使用此培养上清进行利 用抗体价测定的杂交瘤的筛选。
[0093] 【杂交瘤细胞的筛选】
[0094] 【抗体价测定】
[0095] 向96孔平底板每1孔添加各50 μ L上述含抗原物质（5mg)的缓冲液（碳酸氢 盐缓冲液=IOOmM NaHC03-Na0H、pH9. 2?9. 5、肽浓度：1 μ g/mL)，于室温静置2小时而包 被。将板用清洗缓冲液（PBST)清洗3次，以200?250 μ L/孔加封闭缓冲液（3 %脱脂 乳1% BSA、PBS)，于4°C反应一昼夜之后，清洗3次。然后，以100 μ L/孔加杂交瘤的培养 上清，于37°C反应4小时或于4°C反应一昼夜。将板清洗3次之后，以50μ!7孔加用稀 释缓冲液（IOmM Tris-HCl(pH 8.0)、0· 9% (W/V)NaCl、0. 05% (W/V)Tween20)稀释 10000 倍的生物素标记抗小鼠 IgG(Biotion_labeled anti-mouse IgG、SIGMA),于室温反应2 小时。其后清洗6次之后，以50 μ L/孔加用稀释缓冲液稀释1000倍的碱性磷酸酶标记 Streptaridin (Streptaridin)，于室温反应1?2小时。其后进行6次清洗，以50 μ L/孔 加突光底物缓冲液（Attophos substrate buffer、Roche_Diagnostics公司制），将板遮光 而显色。荧光强度用CytoFluorII (PERCEPTIVE公司制）测定。
[0096]【杂交瘤的筛选】
[0097] 通过上述抗体价测定，向显示阳性的结果的孔（IXlO5细胞/mL)加含有15% FCSlO% HCF(杂交瘤克隆因子、Origin公司制）的IMDM培养基，分注到96孔培养板至成约 200细胞/孔，在37°C 5% CO2温育器中进行培养。然后，与上述同样地进行抗体价测定，选 择抗体产生量多的杂交瘤。
[0098] 再进行有限稀释，用含有15% FCSUO%的HCF的IMDM培养基稀释至选择的杂交 瘤成0. 5?1细胞/孔，在37°C /5% CO2温育器中培养约3?4天之后，与上述同样地进 行抗体价测定，选择抗体产生量多的杂交瘤。再重复有限稀释，得到产生针对上述抗原物 质的单克隆抗体的杂交瘤。其中，选择抗体价最高的杂交瘤而命名为小鼠-小鼠杂交瘤 SSV-C93-3。
[0099]【单克隆抗体的取得】
[0100] 使用含有15 % FCS的RPMI培养基培养杂交瘤小鼠-小鼠杂交瘤 SSV-C93-3 (I X IO6细胞/mL)。接下来，回收杂交瘤培养液，为了除去死细胞片而用滤器过 滤。接下来，向培养上清加硫酸铵至终浓度成40%，于40°C搅拌1小时。接下来，进行离心 分离（3000g、30分钟、4°C )，舍去上清而回收沉淀。将此沉淀用上述培养上清的1/10量的 PBS溶解，用PBS作为外液而透析一晚。
[0101] 接下来，将上述沉淀用20mM磷酸钠缓冲液（pH7. 0)进行2倍稀释，与IM TriS-HCl 缓冲液一同添加到HiTrapNHS活化柱。再者，用0. IM甘氨酸-HCl溶液（pH2. 7)将抗体的 溶出，回收到级分管中。
[0102] 【试验例I :SSVmAb的同种型的鉴定】
[0103] 为了鉴定实施例1的单克隆抗体（SSVmAb)的同种型，进行使用小鼠单克隆抗体同 种型试剂（SIGMA)的同种型鉴定试验。
[0104] 结果如图1所示，IgGl示最高的值。
[0105] 另外，将小鼠 IgGl (eBioscience公司）及实施例1的单克隆抗体（SSVmAb)用 2-巯基乙醇还原，用SDS-PAGE处理时，均在同样的位置（50KD、25KD)确认相当于重链及轻 链的条带。另一方面，代替小鼠 IgGl而使用小鼠 IgM(eBioscience公司）进行同样的实验 时，确认不到同样的条带。
[0106] 从图1及SDS-PAGE的结果确认，实施例1的单克隆抗体（SSVmAb)的同种型是 IgGl。
[0107] 【试验例2 :对SSVmAb的核心组蛋白的亲和性的确认】
[0108] 在W02006/025580号公报中，作为可在免疫抑制中使用，与含SEQ ID N0:1所示的 氨基酸序列的肽结合的抗Hl单克隆抗体，报告有杂交瘤16G9 (保藏号FERMBP-10413)所产 生的单克隆抗体（16G9mAb)。
[0109] 从而，以W02006/025580号公报中记载的抗体（16G9mAb)作为参考例1，进行对与 实施例1的单克隆抗体（SSVmAb)的抗原的亲和性的比较。
[0110] 作为抗原，选择作为参考例l(16G9mAb)的抗原的组蛋白H1、及作为组蛋白Hl类似 抗原的核心组蛋白H2A、H2B、H3及H4。
[0111] 用ELISA确定组蛋白Hl或核心组蛋白和SSVmAb的亲和性。
[0112] 将96孔微平板用组蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4包被。各自的组蛋白溶解于IOOmM 碳酸钠缓冲液（PH9. 3)而使用。将该板用PBS-吐温20(0. 05% )清洗，用3%脱脂乳和 1 % BSA封闭1小时。向各孔添加 SSVmAb 5 μ g/mL，温育1小时。将结合的SSVmAb使用 过氧化物酶（HRP)缀合物抗小鼠 IgGl Ab(SIGM)检测，温育1小时。将结合的SSVmAb使 用ABTS[2, 2' -连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-磺酸）]底物溶液检测，使用Multiskan Ascent (Thermo Fisher Scientific Inc. ,Waltham，MA)测定 405nm 的吸光度。
[0113] 结果如图2及3所示。
[0114] 如图2所示，在实施例I(SSVmAb)中，相比对组蛋白Hl的亲和性，对组蛋白H2A、 H2B、H3或H4的亲和性更高。
[0115] 另一方面，如图3所示，在参考例1(16G9)中，相比对组蛋白H2A、H2B、H3及H4的 亲和性，对组蛋白Hl的亲和性更高。
[0116] 【试验例3 :MLR试验】
[0117] 使用无处理的M大鼠来源的脾脏淋巴细胞（应答细胞）及进行丝裂霉素 C(协 和发酵工业株式会社制）处理的LEI大鼠来源的脾脏淋巴细胞（刺激细胞）。将应答细胞 用10% FCS-RPMI培养基调节到5 X IO5细胞/mL，将刺激细胞用10% FCS-RPMI培养基调 节到8 X IO6细胞/mL。将此应答细胞悬浮液及刺激细胞悬浮液各自100 μ L接种到96孔 圆底板（Nunc Brand Products公司制）之后，在混合培养开始时添加参考例1的单克隆抗 体16G9mAb (0. 1、2、4或6 μ g/mL/孔）或实施例1的单克隆抗体SSVmAb (4 μ g/mL/孔），在 37°C，5% C02/95%空气的条件下培养3. 5天以上。另外，作为阳性对照，添加免疫抑制剂他 克莫司（FK506:藤泽药品公司制、InM/孔）。再者，在培养结束15小时前添加溴脱氧尿苷 (BrdU) 10 μ L。然后，使用BrdU标记&检测试剂盒III (Roche Diagnostics公司制），以提 取的细胞内DNA的BrdU量作为指标，由免疫抑制物质测定处理的细胞的增殖能，作为免疫 抑制水平的指标。
[0118] 结果如图4所示。
[0119] 在实施例I (SSVmAb)中，显示BrdU量提取的吸光度相比参考例I (16G9mAb)及他 克莫司（FK506)的更低。特别是，比较实施例1(SSV mAb)的吸光度0. 552±0. 114(平均 ±3』.）和同添加量（4以8/11117孔）的参考例1(16691^13)的吸光度1.351±0.389(平均 土S. E.)，则实施例1的平均值是参考例1的约41 %左右。
[0120] 【试验例4 :对单克隆抗体（SSVmAb) T细胞的反应性的确认】
[0121] 由以下的方法，从C57BL/6小鼠（5周龄、雌、日本Charles River公司制）摘出脾 脏，制备全脾细胞。
[0122] 首先，在放入5ml的RPMI1640培养基（Sigma-Aldrich公司制R-8758)的5ml培养 皿（BD Bioscience公司制FALCON 351007)中将脾脏用解剖用夹和镊子良好分解而悬浮脾 细胞后，移到15ml离心管（BD Bioscience公司制FALCON 352096)中。接下来，将5ml皿 上用磷酸缓冲盐水（PBS，Invitrogen公司制20012-027)清洗数次，将这些也加到先前的细 胞悬浮液中而静置后，将上清回收到别的15ml离心管中。再者，向残渣的不溶性脾脏组织 也再加 RPMI1640培养基5ml，仅回收静置后上清，将这和上述的细胞悬浮液合并而进行以 l，500rpm，5min的离心分离。向回收的细胞加裂解缓冲液（150mM NH4Cl/15mM NaHCO3A). ImM EDTA-Na2，pH 7. 3)2ml，由叩敲溶血后，加 PBS 10ml，将以l，500rpm，5min离心清洗3次的细 胞作为全脾细胞。
[0123] 接下来，基于接下来记载的方法，从本脾细胞将全T细胞使用Pan T细胞分离试剂 盒，小鼠 （Miltenyi Biotec公司制130-090-861)，由磁筛选（MACS)纯化。
[0124] 首先，将脾细胞用MACS缓冲液（0· 5%牛血清白蛋白（BSA，Nacalai tesque公司 制08777-36)/PBS)以5xl07个细胞/200 μ 1的比例悬浮，添加50 μ 1生物素-抗体混剂 /^107个细胞，于41：温育101^11。将其悬浮于15(^1嫩05缓冲液/5\10 7个细胞后，添加 100 μ 1抗生物素微珠/5 X IO7个细胞，于4°C温育15min。向其添加 MACS缓冲液（10ml)， 以1500rpm离心清洗5min后，将回收细胞悬浮于MACS缓冲液500 μ 1。将MACS柱（MS柱、 Miltenyi Biotec 公司制 130-042-201)设置于磁体（MiniMACS 分离单兀、Miltenyi Biotec 公司制130-090-312)中，用500 μ I MACS缓冲液将柱平衡化后，供应上述的细胞悬浮液。回 收经过的级分500 μ 1及其后的利用MACS缓冲液的柱清洗级分（I. 5ml)而作为纯化未刺激 T细胞（纯度约97% )。
[0125] 由流式细胞术（FACS)解析上述的未刺激和16G9mAb或SSV mAb的反应性。
[0126] 首先，将各T细胞样品（IxlO6个细胞）悬浮于89 μ 1的FACS缓冲液（0. 5% FBS/ PBS/0. 02 % NaN3)后，加 1 μ g 的抗-小鼠 CD16/32-阻断 Fc 结合（eBioscience 公司制 14-0161-85)，于 4°C温育 20min。向其加作为第 1 抗体的 16G9mAb 或 SSV mAb(100yg/ ml) 10 μ 1，于4°C温育60min。用FACS缓冲液将细胞离心清洗2次后，加100 μ 1第2抗体 (生物素-缀合的大鼠抗-小鼠 IgMmAMeBioscience公司制13-5780-85)或生物素-缀合 的大鼠抗-小鼠 IgGlmAb (BD Biosciences 公司制 553441)、各 1 μ g/ml)，于 4°C温育 30min。 再用FACS缓冲液将细胞离心清洗2次后，加100 μ 1链霉亲合素-PE-Cy7 (BD Biosciences 公司制556463、1 μ g/ml)，向其添加 FITC-缀合的大鼠抗-小鼠 CD3mAb (BD Biosciences 公司制553062)至终浓度成1 μ g/ml，于4°C温育30min。用FACS缓冲液离心清洗2次及 用40 μ m细胞滤器（BD Bioscience公司制FALCON 352340)过滤处理后，将各样品供应到 FACSCalibur流式细胞仪及CellQuest软件（BD Bioscience公司制）而解析16G9mAb或 SSV mAb阳性/⑶3阳性T细胞数。
[0127] 结果如图5所示。
[0128] 比较参考例I (16G9mAb)及实施例I (SSV mAb)，则在对⑶3阳性T细胞的反应性中 确认不到显著差异，这些抗体示同等的反应性（student t-test、p〈0. 05)。
[0129] 【试验例5 :由SSV mAb的下调的革巴的确定】
[0130] 用蛋白质组解析鉴定7种由实施例I (SSV mAb)下调的候选蛋白质。
[0131] 然后，7种候选蛋白质中，由以下的方法确认ATP合成酶是实施例1(SSV mAb)的靶 抗原。
[0132] 首先，使用ThermoFisher公司的Accell siRNA试剂盒，取得敲落了线粒体ATP合 成酶的Balb/c小鼠来源的T细胞。
[0133] 接下来，根据试验例2的方法，使用得到的T细胞，以实施例I (SSV mAb)作为试验 物质进行MLR试验。
[0134] 其中，作为对照试剂使用同种型IgGl (eBioscience公司）。另外，作为对照试验， 使用未敲落ATP合成酶的小鼠来源的T细胞进行同样的试验。
[0135] 结果如图6A及B所示。
[0136] 如图6A所示，在ATP合成酶未被敲落时，实施例1(SSV mAb)相比同种型IgGl显 著地抑制细胞增殖。
[0137] 另一方面，如图6B所示，在ATP合成酶被敲落时，关于细胞增殖的抑制，在实施例 1(SSV mAb)和同种型IgGl之间确认不到显著差异。
[0138] 在图6A及B中，由ATP合成酶的敲落而SSV mAb的免疫抑制活性降低，提示SSV mAb在免疫抑制时下调ATP合成酶活性。
[0139] 【试验例6 :SSV mAb的轻链及重链的可变区域序列的鉴定】
[0140] 【杂交瘤cDNA的合成】
[0141] 使用快速纯化RNA试剂盒（TaKaRa公司制），从在试验例1中取得的杂交瘤（小 鼠-小鼠杂交瘤SSV-C93-3)制备I. 6 X IO7个细胞总RNA。使用多聚（A) +自总RNA分离试 剂盒（NIPPON GENE 制），从 240 μ g 的总 RNA 制备 mRNA。使用 Etachinmate (NIPPON GENE 公司制）进行乙醇沉淀，使mRNA沉淀。用75%乙醇清洗之后，将mRNA干燥。向其加10 μ L 无 RNA酶的水，溶解mRNA。将得到的mRNA溶液于-80°C保存。使用SMARTer RACE cDNA扩 增试剂盒（Clontech公司制），从1 μ g的SSV杂交瘤mRNA合成5' -RACE用的cDNA。将得 到的cDNA溶液于-20°C保存。
[0142] 【SSV mAb轻链及重链中的互补性决定区域（⑶R)的鉴定】
[0143] 基于小鼠 IgGl重链恒定区的碱基序列制作引物5'-CAC CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AG-3'（SEQ ID NO: 12)。基于小鼠轻链κ恒定区的碱基序列制作引物5' -CAC GAC TGA GGC ACC TCC AGA TG-3'（SEQ ID NO: 13)。使用各自的引物和通用引物A混合物 (SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒附属引物），以cDNA作为模板进行5' -RACE。RACE反应使 用Advantage2 PCR试剂盒（Clontech公司制）。对反应液进行琼脂糖电泳，将约600bp的 重链5'-RACE产物及约550bp的轻链5'-RACE产物使用E. Z. N. A.凝胶提取试剂盒（OMEGA bio-tek公司制）从凝胶纯化。将其连结到pGEM-T Easy载体（Prco公司制），转化感受态高 大肠杆菌（E. coli)DH5 α (Τ0Υ0Β0公司制）。从得到的转化体，使用E. Z. N. A.质粒Minipr印 试剂盒I (OMEGA bio-tek公司制）制备质粒。将制备的质粒作为模板，使用BigDye终止子 v3. 1环测序试剂盒（Applied Biosystems公司制）进行循环反应。
[0144] 接下来，使用DNA测序仪（Applied Biosystems制），解析轻链及重链可变区域的 碱基序列。
[0145] 结果，轻链可变区域的碱基序列如SEQ ID NO: 5的第67位?第384位所示。
[0146] 另外，重链可变区域的碱基序列如SEQ ID NO: 10的第58位?第423位所示。
[0147] 再有，基于由翻译起始密码子和Kabat等的方法确定的FR(恒定区）1的位置，推 定SEQ ID NO: 5的第1位?第66位是轻链信号肽的碱基序列，及SEQ ID NO: 10的第1位? 第57位是重链的信号肽的碱基序列。
[0148] 接下来，从得到的碱基序列推定轻链及重链的可变区域的氨基酸序列，根据Kabat 等的方法鉴定⑶R区域。
[0149] 结果，轻链的可变区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:6的第23位?第128位所示。 其中，SEQ ID NO:6的第1位?第22位是轻链信号肽的氨基酸序列。
[0150] 另外，轻链可变区域可变区域的氨基酸序列之中确认，⑶Rl如RASSSVSYMH(SEQ ID N0:2)所示，CDR2 如 ATSNLAS(SEQ ID N0:3)所示，CDR3 如 QQWSSNPWT(SEQ ID N0:4)所示。
[0151] 另外，重链的可变区域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11的第20位?第141位所示。 其中，SEQ ID NO: 11的第1位?第19位是重链信号肽的氨基酸序列。
[0152] 另外，重链可变区域的氨基酸序列之中确认，⑶Rl如GYNMN(SEQ ID NO:7)所示， CDR2 如 NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQ ID N0:8)所示，CDR3 如 SPYYSNYWRYFDY(SEQ ID N0:9)所 /Jn 〇
[0153] 【试验例7 :败血症治疗作用的评价】
[0154] 将BALB/c小鼠（实验开始时体重20g-30g、n = 6)利用SPF、恒温恒湿（22± 1度、 55±5%)，在塑料制笼内，在12小时明暗循环的条件下饲育。饵及水自由摄取。作为实验 的败血症模型，由LPS40mg/kg的腹腔内施用诱发一般地使用的脂多糖（LPS)诱发致死的败 血症。将溶解于生理盐水的SSV mAb向腹腔内，以LPS施用30分钟前、LPS施用6小时后， 12小时后的3次、作为SSV mAb量以100 μ g/次施用到腹腔内。研究其后的动物个体的生 存。再有，对照是代替SSV mAb而同样地施用溶解于生理盐水的IgG(SIGMA公司制）。
[0155] 结果示于图7。对于LPS施用（败血症衍生）后70小时的生存率而言，对照组 (IgG)是20% (累积生存比例0. 2)，而SSV mAb施用组是70% (累积生存比例0. 7)。对于 LPS施用（败血症衍生）后70小时的生存率而言，SSV mAb施用组（SSV)是对照组（IgG) 的约3. 5倍，SSV mAb施用组显著地更高（p〈0. 05)。
[0156] 【试验例8 :炎症疾病治疗作用的评价】
[0157] 【8-1】
[0158] 将BALB/c小鼠（实验开始时体重20g-30g、η = 10)利用SPF、恒温恒湿（22±1 度、55±5%)，在塑料制笼内，在12小时明暗循环的条件下饲育。饵及水自由摄取。接下 来，对小鼠进行LPS40mg/kg的腹腔内施用，作为炎症疾病，与试验例7同样地诱发脂多糖 (LPS)诱发致死的败血症。将溶解于生理盐水的SSV mAb向腹腔内，以LPS施用30分钟前、 LPS施用6小时后，12小时后的3次、以100 μ g/次的SSV mAb量施用于腹腔内。研究其后 的动物个体的生存。再有，对照是代替SSV mAb而同样地施用溶解于生理盐水的IgG (SIGMA 公司制）。
[0159] 结果示于图8。对照组（IgG)的LPS施用（败血症衍生）后24小时的生存率是 20 %，而SSV mAb施用组是70 %。SSV mAb施用组（SSV)的LPS施用（炎症衍生）后70小 时的生存率是对照组（IgG)的约3. 5倍，SSV mAb施用组显著地更高（p〈0. 05)。
[0160] 【8-2 :血清及炎症组织中的组蛋白浓度测定】
[0161] 在试验例8中，在对照组及SSV mAb施用组中，基于长谷川等（Surg Res. 2012 May 1;174(1):136-41.)进行的方法，在全身麻醉下取得心脏来源的血液或肺组织。对于得到 的样品，由使用ELISA法的市售的测定试剂盒测定组蛋白H1、组蛋白H3及H4的浓度。
[0162] 组蛋白Hl浓度测定的结果如图9A(血液来源血清）及图9B(肺组织）所示。
[0163] SSV mAb施用组的血液样品中的组蛋白Hl浓度在试验中不增加，维持大致一定。 另一方面，对照组的血液样品中的组蛋白Hl浓度在试验期间确认增减。
[0164] 另外确认，炎症组织（肺）的组蛋白Hl浓度是，SSV mAb施用组相比对照组更显 著地降低。
[0165] 组蛋白H3浓度测定的结果如图IOA(血液来源血清）及图IOB(肺组织）所示。
[0166] 经确认，血液样品及炎症组织（肺）的组蛋白H3浓度呈现出SSVmAb施用组相比 对照组更低的倾向。
[0167] 组蛋白H4浓度测定的结果如图IlA(血液来源血清）及图IlB(肺组织）所示。
[0168] 经确认，血液样品及炎症组织（肺）的组蛋白H3浓度呈现出SSVmAb施用组相比 对照组更低的倾向。
[0169] 再有，试验结束后，由与试验例2同样的方法，由ELISA进行SSV mAb和，组蛋白 Hl、组蛋白H3及组蛋白H4的结合测定。
[0170] 结果确认，SSV mAb在体外与组蛋白H1、组蛋白H3及组蛋白H4有结合能力。
[0171] 【8-3 :肺组织的染色试验】
[0172] 试验例8的试验结束后，从对照组及SSV mAb施用组的大鼠各自取得肺组织切片， 基于长谷川等（Surg Res. 2012 May 1;174(1) :136-41.)进行的方法，使用苏木精一曙红染 色液（和光纯药制）进行染色。接下来，对得到的样品的显微镜照片进行摄影。
[0173] 作为参考，对于健康大鼠也同样地对肺组织片段的照片进行摄影。
[0174] 结果如图12A?C所示。
[0175] 图12A(健康大鼠）和，图12B(SSV mAb施用组）观察不到肺中的炎症。另一方面， 在图12C(对照组）中，在肺中确认炎症。
[0176] 【8-4 :郁血、浮肿、炎症及出血的评价】
[0177] 试验例8的试验结束后,根据Murakami等的方法（Shock, 18 (2002), p. 236)评价 郁血、浮肿、炎症及出血评分。具体而言，利用显微镜的24视野的扩大像作为观测对象。然 后，在SSV mAb施用组及对照组的郁血、浮肿及炎症的恶化程度用评分0-4的5个阶段（4 的恶化度最商）评价。
[0178] 结果如图13所示（评分的平均值土标准偏差）。
[0179] 对于郁血、浮肿、炎症及出血之任何，均是相比对照组，SSV mAb施用组示显著地更 低的值。
[0180] 【8-5 :炎症关联细胞因子的测定】
[0181] 在试验例8中，在对照组及SSV mAb施用组中，每3小时从静脉血取得血清。然 后，对于得到的样品，由使用ELISA法的市售的测定试剂盒测定炎症性细胞因子（TNF-α、 IL-I i3、IL-6)和抑制性细胞因子（IL-10)的浓度。
[0182] 结果如图14A?D所示。
[0183] 如图14A?C所示，关于炎症性细胞因子TNF-α、IL-Ιβ及IL-6而言，SSV mAb 施用组的值相比对照组显著地降低。
[0184] 另一方面，如图14D所示，关于抑制性细胞因子IL-10而言，SSVmAb施用组的值相 比对照组显著地升高。
[0185] 从上述结果也可确认，SSV mAb施用组相比对照组炎症被抑制。
[0186] 【试验例9:由肾缺血再灌注伤害所致的对急性肾功能衰竭的治疗效果的确认试验 1]
[0187] 对于Wistar系雄性大鼠 （η = 4)，在全身麻醉下摘出右肾后，将左肾用血管夹进行 缺血再灌注而制成模型。接下来，在SSV mAb施用组中，在模型制成30分钟前及再灌注后 立即，施用lOmg/kg的SSVmAb。另外，在对照组中，代替SSV mAb而同样地施用IgG(SIGMA 公司制）。然后，测定模型制成24小时后的血清中的尿素氮（BUN)及肌酸酐（Cr),评价肾 障碍的水平。另外，试验结束后，进行大鼠的剖检，进行组织学评价。
[0188] 结果如表1所示。
[0189] 【表1】
[0190]
【权利要求】
1. 炎症疾病治疗剂，其包含与下列物质结合的单克隆抗体或其抗原结合片段： 含SSVLYGGPPSAA(SEQIDN0:1)所示的氨基酸序列的肽，或 该肽和药学上可容许的载体的结合体。
2. 权利要求1所述的治疗剂，其中所述炎症疾病与组蛋白相关。
3. 权利要求1或2所述的治疗剂，其中所述炎症疾病是急性炎症疾病。
4. 权利要求1?3之任一项所述的治疗剂，其中所述炎症疾病选自败血症、肾缺血再灌 注伤害及肾功能衰竭。
5. 权利要求1?4之任一项所述的治疗剂，其中所述炎症疾病是败血症。
6. 权利要求1?5之任一项所述的治疗剂，其与组蛋白H1、组蛋白H3及组蛋白H4结 合。
7. 权利要求1?6之任一项所述的败血症治疗剂，其包含含有下列⑶R1?3的轻链可 变区域： 含RASSSVSYMH(SEQIDN0:2)所示的氨基酸序列的CDR1、 含ATSNLAS(SEQIDN0:3)所示的氨基酸序列的⑶R2、及 含QQWSSNPWT(SEQIDN0:4)所示的氨基酸序列的CDR3。
8. 权利要求1?7之任一项所述的治疗剂，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段的 轻链可变区域含SEQIDNO:6的第23位?第128位所示的氨基酸序列。
9. 权利要求1?8之任一项所述的治疗剂，其包含含有下列⑶R1?3的重链可变区 域： 含GYNMN(SEQIDN0:7)所示的氨基酸序列的CDR1、 含NINPYYGSTSYNQKFKG(SEQIDN0:8)所示的氨基酸序列的CDR2、及 含SPYYSNYWRYFDY(SEQIDN0:9)所示的氨基酸序列的CDR3。
10. 权利要求1?9之任一项所述的治疗剂，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段的 重链可变区域含SEQIDNO: 11的第20位?第141位所示的氨基酸序列。
11. 权利要求1?10之任一项所述的治疗剂，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段 针对上述肽或肽和药学上可容许的载体。
12. 权利要求1?11之任一项所述的治疗剂，其中所述药学上可容许的载体是钥孔青 贝血蓝蛋白、卵白蛋白或牛血清白蛋白。
13. 权利要求1?12之任一项所述的治疗剂，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段 可下调ATP合成酶活性。
14. 权利要求1?13之任一项所述的治疗剂，其中所述单克隆抗体是嵌合抗体、人源化 抗体、或者人抗体。
15. 权利要求1?14之任一项所述的治疗剂，其中所述单克隆抗体由杂交瘤小鼠-小 鼠杂交瘤SSV-C93-3产生。
16. 权利要求1?15之任一项所述的治疗剂，其中所述抗原结合片段是Fab、Fab'、 (Fab，）2、Fv或scFv。
17. 炎症疾病的治疗方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求1?16之任一项所 述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
18. 权利要求1?16之任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制造炎症疾病 的治疗剂的用途。
【文档编号】C12N15/09GK104379165SQ201380020995
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年2月22日
【发明者】佐藤秀次, 后藤武, 大森直哉, 江贵真, 岛田弥生, 猪股雅史, 草野徹, 平冢孝宏, 野口隆之, 萩原聪 申请人:学校法人城西大学