用于选择抗细胞凋亡信号传导细胞的装置和方法及其用途

用于选择抗细胞凋亡信号传导细胞的装置和方法及其用途
【专利摘要】本发明公开了适于选择对受体介导的细胞凋亡具有抗性的细胞的一种装置和一种试剂盒以及一种使用所述装置和试剂盒的方法。所述装置能够对从引入所述装置中的异源细胞群体中诱导移植物抗宿主疾病(GvHD)的成熟免疫细胞进行阴性选择。所述装置通过现货供应产品-当前并不存在的溶液来以简化和更廉价的设置实现有效的细胞选择。本发明进一步公开所述装置的用途。
【专利说明】用于选择抗细胞凋亡信号传导细胞的装置和方法及其用途 发明领域
[0001] 本发明涉及医疗装置领域，并且更具体来说涉及目标在于选择对细胞凋亡信号传 导具有抗性的细胞的装置，使用所述装置的方法以及其用途。
[0002] 发明背景
[0003] 干细胞是可以分裂和分化成多种特殊细胞类型并且自我复制来产生更多干细胞 的细胞。在哺乳动物中，干细胞以与胚泡的内细胞团分离的胚胎干细胞或存在于各个组织 中的成体干细胞存在。在成体生物中，干细胞和祖细胞用作机体补充成体组织的修复系统。
[0004] 与依赖于外科手术介入或药物来调节生理活性的所有当前治疗不同，干细胞提供 用于功能障碍的或变性的组织的替代物。因此，干细胞在替代疗法中的使用可以显著改变 许多当前无法治疗的疾病的预后，恢复受损器官的功能并且校正先天性代谢病症和缺陷。 这些细胞在治疗各种各样疾病中的众多临床前和临床使用说明了与干细胞扩展（成体和/ 或胚胎衍生）相关联的技术的重要性。
[0005] 最新发展显示包括造血干细胞和祖细胞（HSPC)以及间充质干细胞（MSC)的造血 区室内的若干干细胞具有分化成免疫造血系统之外的细胞类型的能力，从而为使用这些细 胞类型来用于广大范围变性病症中的组织修复和再生，终止器官衰竭和功能障碍并且可能 通过细胞疗法替代器官移植创造了机会。
[0006] 干细胞的主要临床使用之一是经由造血干细胞移植（HSCT)。在这个手术中，大量 细胞从供体转移到接受者体内，目标在于重建接受者的免疫和造血系统。然而在进行这些 移植时，人们意识到免疫重建实际上是许多抗化疗性癌症如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤 以及许多实体瘤的最佳疗法。除了在肿瘤学中的用途之外，HSCT还有可能治愈非恶性病症 如自身免疫性疾病（例如，糖尿病T1、SLE以及克罗恩病），先天性代谢缺陷和酶缺陷、血红 蛋白病或先天性和后天性免疫缺陷。HSCT已用于非癌症适应症，示出了显著的阳性结果。 然而，这种手术当前被采用于危及生命的病状，因为它存在严重的毒性效应，其中最关键的 是移植物抗宿主疾病（GvHD)。
[0007] 当使用这种方法来治疗癌症时，所述方法在大多数情况下在通过激进的放疗-化 疗来去除免疫造血系统以便预防移入排斥的清髓性预调节之后进行。宿主的免疫造血系统 在移入之前不必去除的最新发现是一个重大进步，因此将用非清髓性预调节和强度降低的 调节（RIC)来替代清髓性预调节。非清髓性预调节的使用已显著（尚未充分）改善由生命 器官功能障碍、移入失败以及顽固性感染引起的危及生命的情况。由于宿主的造血系统并 未通过RIC去除，所以它在供体细胞移入失败的情况下可以恢复。随着时间的推移，供体移 植物接管促进移植物抗肿瘤（GvT)和移植物抗自身免疫（GvA)反应的产生的过程，还另外 使患者暴露于GvHD的临界发病率和死亡率。
[0008] 1型跨膜蛋白/粘附分子（作为造血干细胞的标记物的唾液黏蛋白⑶34)的鉴别 使得能够将CD34+细胞选择用作浓缩造血干细胞来用于移植目的的手段。CD34标记物并不 存在于一些干细胞中，但却存在于各种亚型血液前体上。使用这种阳性选择方法导致了一 些有益干细胞的损失。此外，所述阳性选择方法产生了干细胞和祖细胞与一些后期前体细 胞的混合细胞群体。
[0009] 这种混合细胞群体的移植降低了移植成功率[Askenasy N.等，Current Stem Cell Research and Therapy 2006 ;1 :85-94]。因此，产生了对保留造血重建所需的所有细 胞同时又丢弃引起副作用的细胞的选择方法的需求。
[0010] 与体细胞不同，已记录造血干细胞和祖细胞（HSPC)、间充质干细胞以及神经祖细 胞（NP)对损伤因子如由放疗-化疗和因残留造血细胞大量死亡而释放到髓空间中的次级 因子两者造成的那些损伤因子不敏感。HSPC尤其能够抵抗由肿瘤坏死因子（TNF)家族受体 转导的细胞凋亡信号，相反所述HSPC用于在大多数原始祖细胞中传递生长信号。在鼠模型 中，已示出造血祖细胞在损伤和应激的条件下会大幅上调若干TNF家族受体。在移植环境 中，这种生理机制优于更原始的祖细胞用于细胞凋亡敏感供体细胞的移入。因此，使移植群 体暴露于TNF家族细胞凋亡诱导配体如FasL、Trail、Tweak或TNF- α导致阴性地选择干细 胞群体，因为对TNF家族配体诱导细胞凋亡敏感的细胞群体经历细胞凋亡并且被从移植体 去除。专利申请W0 2007/138597中公开了这种方法在鼠模型中的使用。
[0011] 供体移植物的组成是干细胞移植的重要参数。已示出要求阈值数量的祖细胞来确 保移入。此外，一些非干细胞子集的存在大体上提高了移入的概率，这样使得异源细胞混合 物的移植比纯化祖细胞的移植更有效。供体移植物内最显著的子集是（CD4+和CD8+)T细 胞，因为已证明它们能够抵抗排斥并且支持骨髓微环境内的造血祖细胞移入。然而，同种异 体T细胞到部分免疫压制的接受者体内的移植支持持久的移入，这将介导可能致命的移植 物抗宿主反应（GvH)或移植物抗宿主疾病（GvHD)。成熟的供体T细胞介导这种反应，而在 移植后再次发育的供体T细胞对宿主具有耐受性。已针对介导GvH并支持移入的T细胞子 集之间的解离做了大量努力；然而，实验证据迄今为止尚无结论。
[0012] 移植物抗宿主疾病（GvHD)包括通常处于移植后前100天内的急性期反应以及发 展更为缓慢但具有同等有害后果的慢性反应。重要的是，两种反应都是在移植后数天内由 成熟的供体T细胞所介导的初始炎症引发的。急性GvHD通常通过免疫压制疗法来治疗，所 述免疫压制疗法对造血重建具有不利影响，然而当前并不存在用于慢性反应的有效疗法。 预防GvHD的传统方法包括：使用细胞表面标记物如CD3、CD4、CD8耗尽来自供体接种物的 成熟T细胞，有时还伴随B淋巴细胞。使用各种细胞表面标记物来实现更具选择性的T细 胞耗尽（TCD)的巨大努力并未取得成功。
[0013] 更特殊的耗尽通过在对宿主抗原的离体敏化之后使用细胞凋亡信号消除反应性T 细胞子集取得了良好的结果。用于特殊耗尽的特征在于：敏化的T细胞表达活化相关分子 的所有组成成分，变得对活化诱导细胞死亡（AICD)敏感并且以较快的速率增殖。然而，这 种方法的选择性消除存在若干主要障碍。首先，T细胞的敏化是重复暴露于抗原的过程，所 述过程要求3至7天的离体孵育。因此，T细胞活化必须在移植前至少3天进行。其次，使 快速循环的T细胞对AICD敏感的敏化和活化还诱导效应/记忆T细胞的发育和扩展，所述 效应/记忆T细胞的持久的同种异体反应性可能会引发和传播GvHD。效应/记忆T细胞部 分因固有的低水平的半胱天冬酶-3而对Fas交联具有相应的抗性，从而产生在输注离体培 养的T细胞之后使患者倾向于出现急性和慢性GvHD的细胞凋亡抗性表型。第三，最有效的 离体敏化是针对主要组织相容性复合物（MHC)的组分，所述组分的差异导致了移植环境中 的重大异体反应。然而，所述GvHD反应主要是由次要组织相容性复合抗原（miHA)刺激的 并且主要靶向组织特异性抗原（TSA)。正常和异常组织表位通过由预移植调节和炎症所造 成的损伤被暴露。还有待于发现用于选择性耗尽诱导GvHD的T细胞同时保留支持GvT和 移植移入的细胞的子集的有效方法。


【发明内容】

[0014] 本发明公开了适用于选择对受体介导的细胞凋亡具有抗性的细胞的一种装置和 一种试剂盒以及一种使用所述装置和试剂盒的方法。所述装置能够对从引入所述装置中的 异源细胞群体中诱导移植物抗宿主疾病（GvHD)的成熟免疫细胞进行阴性地选择。所述装 置通过现货供应产品-当前并不存在的溶液来以简化和更廉价的设置实现有效的细胞选 择。本发明进一步公开所述装置的用途。
[0015] 根据一个方面，本发明公开一种包括由生物相容性材料制成的容器和固定至表面 的生物活性细胞凋亡诱导配体的装置，其中所述装置适用于细胞选择。
[0016] 根据一个实施方案，固定了所述生物活性细胞凋亡诱导配体的所述表面是所述容 器的内表面。
[0017] 根据另一个实施方案，固定了所述生物活性细胞凋亡诱导配体的所述表面是所述 容器内存在的珠粒的表面。
[0018] 根据另一个实施方案，所述容器选自包括袋子、管柱、管、瓶子、小瓶以及烧瓶的 组。
[0019] 根据又另一个实施方案，构成所述装置的所述生物相容性材料选自包括聚丙烯、 聚苯乙烯、硅酮、聚氯乙烯或其组合的组。
[0020] 根据又另一个实施方案，所述固定的细胞凋亡诱导配体选自包括肿瘤坏死因子 a (TNF- α )、Fas 配体（FasL)、Trail、Tweak 或其任何组合的组。
[0021] 根据另一方面，本发明公开一种用于从异源细胞群体选择抗细胞凋亡信号传导细 胞的方法；所述细胞群体包含抗细胞凋亡信号传导细胞和细胞凋亡信号传导敏感细胞。所 述方法包括：将包含异源细胞群体的样品引入本发明的装置中并且在所述装置内孵育所述 细胞，从而从所述细胞群体选择抗细胞凋亡信号传导细胞。
[0022] 根据另一个实施方案，选择的抗细胞凋亡细胞是干细胞，所述干细胞选自包括以 下的组：脐带血干细胞、流动的外周血液干细胞、骨髓干细胞、癌症干细胞以及神经干细胞。
[0023] 根据另一个实施方案，选择的抗细胞凋亡细胞是对活化诱导细胞死亡（AICD)不 敏感的免疫细胞。在又另一个实施方案中，对活化诱导细胞死亡（AICD)不敏感的所述免疫 细胞是T细胞。
[0024] 根据另一个实施方案，选择的抗细胞凋亡细胞是祖细胞。
[0025] 根据又另一个实施方案，所述方法中使用的所述细胞群体来源于：骨髓、祖细胞流 动的外周血液或脐带血（UCB)。
[0026] 根据又另一个实施方案，在所述装置内的孵育时间是2小时至72小时。
[0027] 根据又另一方面，本发明公开一种细胞选择试剂盒，所述细胞选择试剂盒包括本 发明的装置以及用于维持所述装置内细胞凋亡诱导配体的完整性和活性的溶液。根据一些 实施方案，所述试剂盒进一步包括细胞凋亡诱导配体，所述细胞凋亡诱导配体选自具有肿 瘤坏死因子a (TNF_a)、Fas配体（FasL)、Trail、Tweak或其任何组合的组。
[0028] 根据另一个实施方案，用于维持细胞凋亡诱导配体的完整性和活性的所述溶液是 缓冲液或培养基。
[0029] 根据又另一方面，本发明公开一种使用上述装置和试剂盒的方法。所述方法是用 于改善造血干细胞和祖细胞（HSPC)移植的临床效果的方法。在所述方法中，提供了包含细 胞群体的样品；所述细胞群体包含干细胞和祖细胞。使所述群体与细胞凋亡诱导配体接触， 并且收回剩余细胞并且将其用于移植。根据另外的实施方案，所述接触发生在本发明的装 置内。
[0030] 根据另一个实施方案，所述方法中的所述细胞群体来源于：骨髓、祖细胞流动的外 周血液或脐带血（UCB)。
[0031] 根据另一个实施方案，使用所述方法选择的干细胞选自包括以下的组：脐带血干 细胞、流动的外周血液干细胞、骨髓干细胞、癌症干细胞以及神经干细胞。
[0032] 根据另一个实施方案，细胞群体用Fas配体（FasL)孵育21至24小时的时间段并 且用肿瘤坏死因子α (TNF-α )孵育24至48小时的时间段。
[0033] 根据另一个实施方案，从所述方法收回的细胞用于自体、同种异体或单倍同一性 (haploidentical)移植。
[0034] 根据另一个实施方案，所述方法中的收回的细胞进一步包含对活化诱导细胞死亡 (AICD)不敏感的免疫细胞。在又另一个实施方案中，对活化诱导细胞死亡（AICD)不敏感的 所述免疫细胞是T细胞。
[0035] 根据又另一方面，本发明公开另一种使用上述装置和试剂盒的方法。所述方法是 用于消除包含祖细胞移植体的组合物中的恶性细胞的方法。在所述方法中，提供了包含祖 细胞移植体的组合物并且然后使所述组合物与细胞凋亡诱导配体接触。根据另外的实施方 案，所述接触发生在本发明的装置内。
[0036] 根据另一个实施方案，使所述组合物与细胞凋亡诱导配体Fas配体（FasL)接触约 24小时的时间段。
[0037] 根据另一个实施方案，所述祖细胞移植体用作自体移植体。
[0038] 根据另一方面，本发明公开又另一种使用上述装置和试剂盒的方法。所述方法是 用于预防移植物抗宿主疾病（GvHD)同时保留移植物抗肿瘤（GvT)活性的方法。在所述方 法中，提供了包含细胞群体的样品，所述细胞群体包含HSPC细胞和免疫细胞。使所述群体 与细胞凋亡诱导配体接触，并且收回剩余细胞并且将其用于移植。根据另外的实施方案，所 述接触发生在本发明的装置内。
[0039] 根据另一个实施方案，使所述组合物与细胞凋亡诱导配体Fas配体（FasL)接触2 至16小时的时间段。
[0040] 本发明的另外的实施方案、特征、优点以及适用的完整范围将从下文给出的详细 描述和附图中变得清楚明白。然而，应注意，指示本发明的优选实施方案的详细描述仅是通 过说明方式给出的，这是因为本领域技术人员从这一详细描述中将会清楚明白在本发明的 精神和范围内的各种变化和修改。
[0041] 附图简述
[0042] 图1 :一组图示出了 UCB细胞对受体介导的体外细胞凋亡的敏感性。㈧使UCB细 胞的新鲜样品在不含趋化因子补体的培养基中孵育各个时间段（η = 35)并且使所述新鲜 样品暴露于50ng/ml FasL低聚物（η = 21)和20ng/ml TNF-α (η = 18)。细胞凋亡由单 核细胞（MNC)和门控CD34+祖细胞中的膜联蛋白-V摄取来测定。（B)Fas和TNF受体在新 鲜的UCB单核细胞、门控CD34+以及分离的谱系阴性（lin_)祖细胞中的表达。（C)在同源 配体（η = 15-21)的影响下，在表达Fas和TNF受体的门控⑶34+祖细胞中，以时间的函数 测量细胞凋亡。（D)用同源配体（η = 6)孵育的，表达Fas和TNF受体的MNC和门控CD34+ 祖细胞中的增殖速率。增殖使用ModFit软件由CFSE稀释测量。（E)Fas和TNF受体在新 鲜的UCB样品（η = 8-13)中的T细胞（⑶3+)、B淋巴细胞（⑶19+)以及髓样细胞（⑶33+) 中的表达。（F)由在FasL和TNF-α (n = 6-14)中暴露48小时的，包括单核细胞/巨噬细 胞（CD14+)的谱系阳性UCB子集中的膜联蛋白-V摄取测定的细胞凋亡。
[0043] 图2 :图2Α是方案并且图2Β至图2G是示出UCB祖细胞对受体介导的细胞凋亡具 有抗性的图。（Α)用两次25 μ g/g白消安的剂量调节NOD. CID小鼠并且在2天后将同等数量 的在不同条件下孵育的UCB细胞移入所述小鼠。在12周之后，使用选择性人和鼠抗-CD45 抗体测量骨髓中的人嵌合。（B)用来自同一 UCB单元的50ng/ml FasL和20ng/ml TNF- a 在培养基中孵育24小时之后的新鲜的UCB细胞的移入。数据表示7种不同的UCB样品。 (C)用来自同一 UCB单元（表示6个UCB样品）的FasL和TNF a在培养基中孵育48小时 之后移入。（D)用来自同一 UCB单元（表示5个UCB样品）的FasL和TNF a在培养基中孵 育72小时减少了移入。（E)在培养基中用FasL和TNF-a (n = 4-7)孵育48小时之后的单 核细胞（MNC)、门控CD34+以及分离的谱系阴性（lir〇祖细胞的增殖速率。（F)由碘化丙啶 (η = 5-8)的核结合确定的处于细胞周期G0/G1期的有丝分裂期静止的UCB子集的分数。 (G)在将103个UCB细胞铺在间充质干细胞层上5周之后并且随后转移到半固体甲基纤维 素培养物中测定的长期培养起始细胞（LTC-IC)频率。FasL(50ng/ml)和TNF-α (20ng/ml) 存在于整个培养阶段并且间隔1周就通过更换一半培养基（η = 8-13)来更新。数据表示 一个UCB单元的比较性培养条件。
[0044] 图3 :图3B是方案并且图3A和图3C是示出UCB细胞在死亡配体中的暴露提高体 外祖细胞和骨髓体内分化的频率的图。（A)谱系标记物在含有以下的新鲜的UCB细胞中的 表达：祖细胞（⑶34)、T细胞（⑶3)、B淋巴细胞（⑶19)以及髓细胞（⑶33)。活细胞的组合 物在暴露于50ng/ml FasL和20ng/ml TNF-a孵育24小时和48小时之后发生改变，从而 增大祖细胞（η = 17-31)的分数。（B)在孵育各个时间段之后，死亡细胞通过ficoll梯度离 心来消除并且将同等数量的活细胞铺在用干细胞因子（SCF)、白细胞介素-3 (IL-3)以及粒 细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)刺激的半固体甲基纤维素培养物内。集落形成细 胞（CFU，每10 3个活细胞表达）的频率在14天之后测定。（C)在新鲜的UCB样品（对照） 中和在培养基中用FasL和TNF-a (n = 12-27)孵育之后的相对CFU频率。
[0045] 图4 :图4Α是方案并且图4Β至图4D是示出UCB细胞上的死亡配体的组合作用的 图。（A)Fas的表达通过用20ng/ml TNF-a孵育24小时来刺激并且随后在存在和在不存在 50ng/ml FasL的情况下将细胞另外孵育24小时。（B)在各种孵育条件（η = 6-9)下，在单 核细胞（MNC)和门控⑶34+祖细胞中的Fas表达。（C)在补充和未补充FasL (η = 5-12)的 情况下，用TNF- α孵育48小时期间Fas阳性MNC、门控CD34+以及分离的谱系阴性（lin_) 祖细胞的细胞凋亡。（D)在通过ficoll离心消除死亡细胞之后增加各个孵育（η = 7-15)之 后的大量细胞悬浮液中的CFU频率。
[0046] 图5 :图5C是方案并且图5A、图5B以及图?是示出死亡配体在UCB细胞的离体 扩展期间提高祖细胞频率的图。（A)CD34+祖细胞在临床批准的方案下在液体培养物中免疫 磁性分离和扩展3周。CD34+祖细胞的分数与新鲜的UCB样品相比较在扩展期间（η = 4) 增加并且在第三周最后一周培养期间补充50ng/ml FasL之后进一步增加。（Β)在扩展3周 (η = 4)之后培养物中CD34+细胞的绝对数量标准化成103个总细胞。（C)将同等数量的新 鲜的和扩展的UCB细胞（来自相同样品）移入到用两个25 μ g/g白消安剂量调节的N0D. SCID小鼠（H2Kg7)体内。（D)在12周之后在骨髓和脾中测定人造血嵌合。数据表示6个独 立的UCB单元，将新鲜的细胞与最后第三周培养期间用和未用FasL的扩展的祖细胞进行比 较。
[0047] 图6 :图6A至图6F是示出死亡受体的表达和对简单培养期间mPB细胞的细胞凋亡 的敏感性的图。将冷冻保存2至7年的mPB样品解冻，去除过量的DMS0并且在存在和在不 存在50ng/ml FasL和29ng/ml TNF-α的情况下将细胞孵育4小时和16小时。（A)Fas和 TNF受体在单核（MNC)mPB细胞和门控⑶34+祖细胞中的表达（η = 7-11)。（B)Fas和TNF 受体表达在谱系阳性T细胞（⑶3)、B淋巴细胞（⑶19)以及髓细胞（⑶33)中的对比分析（η =7-11)。（C)Fas表达在培养16小时期间在所有子集中大体上下降（η = 5-9)。（D)培养 期间TNF-R2的上调在Β淋巴细胞（CD19)和髓细胞（CD33)中最显著（η = 7-11)。（Ε)在 存在和在不存在FasL和TNF- α的情况下，将解冻的mPB样品孵育4小时和16小时（η = 5-11)。由膜联蛋白-V结合测定细胞凋亡。（F)在用和未用死亡配体将解冻的mPB孵育4 小时和16小时之后的门控⑶34+祖细胞和⑶3+T细胞的细胞凋亡的对比率。
[0048] 图7 :图7A至7D是示出死亡配体预防冷冻保存的流动的外周血液（mPB)的移植体 内的GvHD的图。（A)经受以下的NOD. SCID小鼠的存活：用两个25 μ g/g剂量调节并且在2 天之后将1. 5 X 107个mPB细胞移入所述小鼠，所述mPB细胞在培养基中用50ng/ml FasL和 20ng/ml TNF α孵育4小时（每组中η = 10)。（B)来自用（η = 10)和未用（n = 7)FasL 预孵育的相同mPB样品的细胞的移植后第12周，在骨髓中测量人异种嵌合。（C)在存在和 在不存在FasL (η = 9)和TNFa (n = 10)的情况下，在培养基（n = 12)中孵育4小时之后 解冻细胞（η = 18)的接受者在移植后三周的体重。从12周的实验点来看，针对以下各项 评定移入了在培养基中并用FasL孵育的细胞的小鼠：(D)根据正常（0)和异常（1)参数评 定临床评分：1.皮肤病和毛发脱落，2.虚弱程度，3.爪垫角化过度以及4.腹泻；以及（E) 根据0-无浸润，1-略微浸润，2-片状浸润，3-弥漫性浸润，4-组织基础结构的恶化对肝组 织结构评分。
[0049] 图8 :图8B是方案并且图8A、图8C、图8D以及图8E是示出暴露在死亡配体中并 不会削弱抗原刺激和移植物抗肿瘤反应性的图。（A)将冷冻保存的mPB解冻并且用50ng/g FasL和20ng/g TNF-α将所述细胞孵育4小时或16小时。CD34+祖细胞、T细胞（CD3+)、B 淋巴细胞（CD19+)以及髓细胞（CD33+)在活细胞部分中的相对分布示出了这些子集对细胞 凋亡的不同敏感性。（B)用死亡配体将mPB样品孵育4小时或16小时，通过ficoll离心来 消除死亡细胞并且将同等数量的活细胞铺在半固体甲基纤维素培养物内。（C)集落形成活 性表达为mPB细胞在培养基中并用50ng/ml FasL或20ng/ml TNF- a (每组中n = 7-11) 孵育之后的集落形成细胞（CFU)频率。（D)在混合淋巴细胞反应（MLR)测定中，将用50ng/ g FasL孵育4小时的mPB与辐射的同种异体mPB刺激物共同孵育。由CFSE稀释测定反应 者的增殖并且使用ModFit软件来量化。（E)使NOD. SCID小鼠皮下接种人结肠癌HT29并且 向所述小鼠静脉输注在培养基中并用FasL预孵育4小时的3 X 107个mPB细胞。根据（mm3 =长度X宽度2X〇. 4)用卡尺测量的肿瘤生长率通过输注mPB细胞降低，而不管所述细胞 是否暴露于FasL。
[0050] 图9 :图9A和图9E是方案并且图9B至图9D和图9F至图9H是示出细胞凋亡敏 感细胞的预移植耗尽预防GvHD的图。（A-D)FasL介导消除预敏化的GvHD效应物。（A)间 隔3天就用10 7个H2Kd脾细胞将H2Kb小鼠免疫两次。在第二次免疫之后三天，在培养中并 用50ng/ml FasL将脾细胞（imH2Kb)培养24小时。⑶在培养基（η = 6)中并用50ng/ml FasL(n = 5)将从H2Kd免疫的H2Kb小鼠收获的脾细胞孵育24小时。在门控CD4+和CD8+T 细胞子集中分别由膜联蛋白-V和7-AAD摄取测量细胞凋亡和死亡。（C)经过两次免疫的脾 细胞显示出与第三方刺激物（H2K k)相比较对辐射的（3000rad)同种异体刺激物（H2Kd)增 加的反应。通过用FasL孵育24小时明显压制了异体反应，同时保持对第三方刺激物的反 应性。由CFSE稀释（η = 5个单独孵育）测定增殖指数。（D)在培养基中并用FasL离体孵 育之后，将来自免疫的供体的活脾细胞（1. 5X106)过继转移到经亚致命性辐射的（650rad) F1接受者体内（H2Kb - H2Kb/d)。存活差异通过在第+7天施用10 μ g脂多糖（LPS)(每组 中η = 8)来极化。（E-H) FasL介导耗尽未受刺激的供体脾细胞。（E)向经亚致命性辐射的 (650rad)Fl接受者（H2Kb/d)输注在培养基中并用FasL预孵育24小时的半同种异体脾细 胞（H2K b)。（F)在培养基（n-7)中并用50ng/ml FasL(n-9)将未受刺激的脾细胞孵育24小 时以用于测量门控CD4+和CD8+T细胞子集中的细胞凋亡。（G)用和未用FasL孵育24小时 的未受刺激的脾细胞（H2K b)对辐射的同种异体刺激物（H2Kd)作出反应。（H)在培养基（η =10)中并用FasL (η = 10)离体孵育之后，将来自未受刺激的供体的活脾细胞（1. 5 Χ106) 过继转移到经亚致命性辐射的（650rad)Fl接受者体内（H2Kb - H2Kb/d)。在第+7天，用 10 μ gLPS (静脉）攻击小鼠。
[0051] 图10 :图10A至图10E是示出Fas介导的对未受刺激的脾细胞的耗尽降低单倍 同一性和同种异体免疫细胞的GvHD活性的图。向经亚致命性辐射的^50rad)Fl接受者 (H2K b/d)输注在培养基中并用FasL预孵育24小时的不同数量（1. 5至4. 5X 106)的半同种 异体脾细胞。（A)用和未用FasL孵育的脾细胞的接受者根据以下正常（0)和异常（1)参数 来临床评分：1.皮肤病和毛发脱落，2.虚弱程度，3.爪垫角化过度以及4.腹泻。（B)用和 未用FasL孵育（每组中η = 5-10)的不同数量的供体脾细胞的接受者的体重损失。（C-D) 在用和未用FasL孵育24小时（每组中η = 6-10)之后，将3Χ 106个脾细胞的单倍同一性 移植体与同种异体移植体（H2Kb -H2Kd)相比较。在一周之后测量临床评分（C)和体重损 失（D)。（E)具有T和B淋巴细胞的脾内容物在辐射之后的第一周期间（每组中η = 5)逐 渐减少。脂多糖（LPS)攻击的幸存者显示出对这些子集的标记的刺激（在LPS输注之后2 天），所述标记的刺激通过用FasL对未受刺激的脾细胞进行预处理（n-7)来削弱。
[0052] 图11 :图11C是方案并且图11A、图11B以及图11D至图11F是示出Fas交联改善 NOD. SCID小鼠体内的GvHD的图。（A)在培养基中并用50ng/ml FasL孵育的脾细胞显示出 不同水平的自发性细胞凋亡（淡色条）和Fas介导的细胞凋亡（暗色条）。在孵育24小时 和48小时（η = 7-9)之后，通过门控⑶4+和⑶8+T细胞子集上的膜联蛋白-V摄取来测量细 胞凋亡。⑶活的⑶4+和⑶8+Τ细胞、⑶4+⑶25+调控Τ细胞以及Β淋巴细胞（Β220+)在培养 基中并用FasL孵育48小时之前和之后的分数分布。（C)将来自C57BL/6供体在培养基中 并用50ng/ml FasL孵育的以下脾细胞输注到同种异体NOD. SCID小鼠体内（H2Kb -H2Kg7): 分别预孵育24小时和48小时的3 X 106个和107个原初脾细胞。（D)输注了在对照培养基 (η = 9)中并用50ng/ml FasL(n = 10)预孵育的脾细胞的NOD. SCID小鼠的存活。通过静 脉注射10 μ g LPS会促发致命的GvHD。在3周后根据胃肠道受累（GI) (E)和体重损失（F) 评价小鼠的临床评分。
[0053] 图12 :图12A是方案，图12B至图12C是图并且图12D是示出消除单倍同一性骨髓 移植体内的Fas敏感的原初免疫细胞的图形图片。（A)将5X10 6个BMC(H2Kb，CD45. 1)和 不同数量的供体脾细胞（H2Kb、⑶45. 2、GFP)移入以850rad辐射的F1接受者（H2Kb/d)。在 移植后3周，根据胃肠道受累（GI)和体重损失（C)来评定在培养基中并用FasL孵育48小 时（每组中η = 8)的脾细胞的接受者的临床评分（B)。（D)在移植后3周，处死小鼠来在 组织学上针对以下各项评价在培养基中并用FasL孵育（η = 5)的3Χ106个脾细胞的接受 者的皮肤和肝：〇_无浸润，1-略微浸润，2-片状浸润，3-弥漫性浸润，4-组织基础结构的恶 化。
[0054] 图13 :图13Α是图和FACS扫描，图13Β和图13D是FACS扫描并且图13C是示出 在选择性耗尽单倍同一性骨髓移植体内的Fas敏感的原初免疫细胞之后的免疫重建的图。 (A)将5X 106个BMC(H2Kb，⑶45. 1)和不同数量的供体脾细胞（H2Kb、⑶45. 2、GFP)移入以 850rad辐射的F1接受者（H2Kb/d)。在移植后3周（η = 5)，在外周血液中测定供体（H2Kb) 和宿主（H2Kb/d)嵌合。在移植后3周将小鼠处死来确定：(B)脾重建的主要贡献来自骨髓 (⑶45. 1，GFP_)，其中在这个时间点几乎已不存在输注的脾细胞（⑶45. 2，GFP+)。数据表示5 个单独的测量。（C)MLR测定中对第三方（H2Kk)辐射的刺激物（反应者：刺激物比率是1 :3) 的反应。从针对在培养基中并用FasL孵育（η = 4)的未受刺激的脾细胞的接受者的CFSE 稀释来测定增殖。（D)在移植到经亚致命性辐射的^50rad)野生型接受者之后24小时肠 系膜淋巴结内的GFP+供体脾细胞。数据表示4个单独的测量。
[0055] 图14 :图14A、图14C以及图14E是方案并且图14B、图14D以及图14F是示出 FasL介导的对未受刺激的淋巴细胞的耗尽支持造血细胞移入的图。（A)在存在和在不存在 50ng/ml FasL的情况下，将全骨髓细胞（wBMC)孵育24小时，并且将2 X 106个细胞移入到 经亚致命性辐射的（800rad)同种异体宿主体内（H2Kd -H2Kb)。（B)3周的外周血液嵌合 并未受到使用FasL的预孵育（η = 6)的影响。（C)在培养基（η = 5)中并用FasL (η = 6) 预孵育24小时之后，向106个谱系阴性BMC (η = 7)到辐射的（800rad)同种异体宿主的移 植（H2Kd - H2Kb)补充106个来自F1供体（H2Kb/d)无 GvHD活性的脾细胞。⑶脾细胞的添 加改进了造血细胞移入，而不管是否暴露于FasL。（E)通过将5X105个lirTBMC移植到以 750rad辐射的同种异体接受者体内（H2K d - H2Kb)(对照，η = 6)来诱导混合嵌合。在10 天之后，向小鼠输注同种异体（H2Kd)的106个淋巴细胞（DLI)。（F)与未接受淋巴细胞输注 的小鼠（对照）相比较，供体嵌合水平在培养基中并用FasL预孵育24小时（n = 6)的DLI 之后3周上升。
[0056] 图15 :图15A、图15C、图15E以及图15G是方案并且图15B、图15D、图15F以及图 15H是示出FasL耗尽的未受刺激的淋巴细胞的移植保留移植物抗宿主活性的图。（A)向携 带皮下同种异体（H2K d)CT26结肠癌肿瘤的NOD. SCID小鼠（H2Kg7)输注（在植入肿瘤后1 天）来自5周龄宿主匹配的NOD供体（H2Kg7)的1. 5X107个脾细胞。（B)淋巴细胞的输注将 压制NOD. SCID小鼠体内的肿瘤生长（η = 10)，而不管是否在培养基中并用FasL预孵育24 小时（n-8)。（C)以亚致命性福射（750rad)携带MHC-匹配的皮下成神经细胞瘤（Neur〇-2a， Η2Γ)肿瘤的H2KVj、鼠并且将来自同种异体供体（H2Kb)的2X106个谱系阴性骨髓细胞移入 所述小鼠体内。（D)来自F1供体（H2K b/d)的无 GVH活性的淋巴细胞的输注对肿瘤生长不具 有显著影响（η = 17)。在培养基中孵育24小时的同种异体脾细胞（H2Kb)的输注降低了肿 瘤生长率（η = 10)，但80%的小鼠因严重的GvHD而在3周内死亡。用FasL预孵育的脾细 胞的输注同等减少肿瘤生长，但所有小鼠都是存活的（η = 11)。（E)向经亚致命性辐射的 (750rad)BALB/c小鼠输注5Χ106个同基因（H2K d)骨髓细胞与2Χ105个Α20成淋巴细胞瘤 (H2Kd)的混合物。在培养基中并用FasL将细胞混合物预孵育24小时。（F)在培养基中孵 育的骨髓细胞和A20细胞的接受者发展成带来致命后果的弥散性肿瘤（η = 10)，而用FasL 预孵育的细胞的接受者将存活下来（η = 10)。（G)在培养基中并用50ng/ml FasL蛋白孵 育48小时之后，用来自同基因 NOD供体（H2Kg7)的5X107个骨髓细胞过继转移以650rad 辐射的免疫缺损的NOD. SCID小鼠（H2Kg7)。在两次测量空腹血糖水平均超过200mg/dl之 后认为是高血糖症。（H)在培养基中并用FasL蛋白预孵育（η = 10)的全骨髓细胞的过继 转移之后的1?血糖症的发展。
[0057] 发明详述
[0058] 在一个实施方案中，本发明公开一种用于选择抗细胞凋亡信号传导细胞的装置。 在另一个实施方案中，抗细胞凋亡信号传导细胞选自包括以下的组：干细胞、祖细胞以及免 疫细胞。在另一个实施方案中，本发明的免疫细胞是T细胞的子集。在另一个实施方案中， 本发明的细胞是造血细胞。在另一个实施方案中，本发明的细胞基于表面表型例如CD34+ 来鉴别。在另一个实施方案中，抗细胞凋亡信号传导细胞是本发明的细胞。
[0059] 在另一个实施方案中，抗细胞凋亡信号传导细胞对TNF-α具有抗性。在另一个 实施方案中，抗细胞凋亡信号传导细胞对Fas配体具有抗性。在另一个实施方案中，抗细 胞凋亡信号传导细胞对TRAIL具有抗性。在另一个实施方案中，抗细胞凋亡信号传导细胞 对Tweak具有抗性。在另一个实施方案中，抗细胞凋亡信号传导细胞对TNF-α、Fas配体、 TRAIL、Tweak或其任何组合具有抗性。
[0060] 在另一个实施方案中，本发明提供克服与用于鉴别干细胞或"干细胞性"的细胞染 色的方法相关联的障碍和不准确性的方法和装置。在另一个实施方案中，现有技术通常提 供用于鉴别干细胞的方法，其中本发明提供用于从培养物选择干细胞的手段，其中所述培 养物包含包括非干细胞的各种细胞类型。在另一个实施方案中，选择在一个步骤中进行。
[0061] 在详细地解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明并不限于其在以下 描述中所阐述的或通过实施例所列举的细节方面的应用。本发明能够具有其它实施方案或 能够以各种方式实践或执行。此外，应理解本文中采用的措辞和术语是出于描述的目的并 且不应视为具有限制性。
[0062] 在另一个实施方案中，本发明的装置包括容器，其中细胞凋亡诱导配体固定至所 述容器的内表面。在另一个实施方案中，本发明的装置包括容器，其中细胞凋亡诱导配体固 定至引入所述容器中的珠粒的表面。在另一个实施方案中，本发明的装置包括容器，其中细 胞凋亡诱导配体固定至所述容器中含有的珠粒的表面。在另一个实施方案中，本发明的装 置用于使用单个步骤选择干细胞。在另一个实施方案中，单个步骤包括在所述容器内孵育 异源细胞群体。在另一个实施方案中，孵育使所述细胞群体暴露于如本文所提供的细胞凋 亡配体。在另一个实施方案中，孵育导致抗细胞凋亡细胞如干细胞的存活以及细胞凋亡敏 感细胞类型的细胞凋亡性死亡。
[0063] 在另一个实施方案中，选择的抗细胞凋亡细胞（如干细胞）群体用于在治疗疾病 (例如但不限于：癌症、免疫疾病、抗化疗癌症或先天性或后天性免疫缺陷）的过程中的移 植。在另一个实施方案中，本领域技术人员可以容易地确定本发明的抗细胞凋亡细胞的使 用。
[0064] 在另一个实施方案中，所述容器由至少一种生物相容性材料构成。在另一个实施 方案中，生物相容性材料包括但不限于：聚丙烯、聚苯乙烯、硅酮、聚氯乙烯或其组合。在另 一个实施方案中，生物相容性材料根据参数来选择，所述参数例如但不限于：对促进细胞凋 亡诱导配体固定到所述生物相容性材料内表面或透明性的耐受性或能力。在另一个实施方 案中，生物相容性材料相对于在所述疗法的接受者或受益人体内引起任何不希望的局部或 系统性效应来说是惰性的，但在所述特定情况下会产生最适当的有益的细胞或组织反应， 并且最优化所述疗法的临床相关表现（美国专利5, 998, 024、美国专利6, 526, 984以及美国 专利4, 979, 959列举了生物相容性材料）。在另一个实施方案中，生物相容性材料包含涂布 有促进本发明的抗细胞凋亡细胞的存活的至少一层的疏水性聚合物。
[0065] 在另一个实施方案中，所述容器是袋子。在另一个实施方案中，所述容器是管柱。 在另一个实施方案中，所述容器是管。在另一个实施方案中，所述容器是瓶子。在另一个实 施方案中，所述容器是小瓶。在另一个实施方案中，所述容器室烧瓶。在另一个实施方案中， 所述容器是本领域已知的并且适合于所述装置的特定目标用途的任何其它接纳器。
[0066] 根据一个实施方案，所述装置包含引入了细胞群体的单个容器。在另一个实施方 案中，所述容器包括通过适于将全细胞从细胞碎片和蛋白质中分离出来的过滤设备而分开 的两个互锁腔室。在另一个实施方案中，将细胞群体引入到一个腔室中，在所述腔室中孵育 并且在孵育之后，过滤器可以用于进一步将选择的细胞从溶液中的细胞碎片和蛋白质中分 离出来。
[0067] 根据另一个实施方案，所述容器是管柱形式，其中孵育所述细胞群体，从而允许全 细胞或特别是干细胞附接到所述管柱上。在另一个实施方案中，在孵育之后，将丢弃剩余的 细胞碎片和蛋白质并且将所述选择的细胞与所述管柱分离。美国专利5, 098, 842和专利申 请US2011/0256581中已列举了这种管柱的使用。
[0068] 在另一个实施方案中，将肿瘤坏死因子（TNF)家族的成员用作用于选择抗细胞凋 亡细胞的细胞凋亡诱导剂。在另一个实施方案中，根据本发明使用的TNF家族的细胞凋亡 诱导配体是：TNF-a、FasL、Trail (Apo2配体）或Tweak(Apo3配体）。在另一个实施方案 中，促细胞凋亡剂是重组蛋白。
[0069] 在另一个实施方案中，生物活性细胞凋亡诱导配体是在其细胞凋亡诱导活性剂中 具有活性同时固定至容器的内表面的配体。在另一个实施方案中，生物活性细胞凋亡诱 导配体是包含能够结合各自受体并且以其固定形式诱导细胞凋亡的至少一个活性部分的 TNF-a，FasL、Trail 以及 Tweak 中的任一个。
[0070] 在另一个实施方案中，细胞凋亡诱导配体来源于哺乳动物来源。在另一个实施方 案中，细胞凋亡诱导配体是人细胞凋亡诱导配体。在另一个实施方案中，细胞凋亡诱导配体 是啮齿类动物细胞凋亡诱导配体。
[0071] 根据另一个实施方案，所述生物活性细胞凋亡诱导配体固定至所述容器的所述内 表面。在另一个实施方案中，所述生物活性细胞凋亡诱导配体固定至所述容器内的珠粒。在 另一个实施方案中，所述生物活性细胞凋亡诱导配体以允许所述配体与所述容器内含有的 细胞自由的相互作用的方式固定。
[0072] 本领域中已知许多用于将蛋白质固定至表面的方法。大多数固定方法涉及用适当 的物质来使所述表面改性或涂布所述表面来改变表面特性或提供用于结合蛋白质的官能 团。另一方面，在不改性的情况下，将蛋白质固定在裸表面上必须使用对特定表面具有特异 性的亲和性肽。在另一个实施方案中，固定通过利用与本发明的所述细胞凋亡诱导配体相 容的螯合剂来实现。在另一个实施方案中，本领域技术人员可以容易地鉴别合适的螯合剂。 在另一个实施方案中，螯合剂不但与本发明的所述细胞凋亡诱导配体相容而且维持其生物 活性。在另一个实施方案中，螯合剂不但与本发明的所述细胞凋亡诱导配体相容而且促进 其生物活性。
[0073] 在另一个实施方案中，细胞凋亡诱导配体的固定通过以下来实现：物理吸附、 His-6离子与Ni+离子之间的相互作用、一对异二聚亮氨酸拉链的卷曲螺旋缔合、SH基团的 化学吸附、醛与氨基之间的Schiff碱键连、转谷氨酰胺酶（TGase)的酰基转移反应、链霉亲 和素-生物素之间的亲和力、FLAG与抗-FLAG抗体之间的亲和力、谷胱甘肽与GST之间的 亲和力或融合了 PS-亲和性肽的蛋白质至亲水性聚苯乙烯的结合（美国专利6, 040, 182、美 国专利4, 885, 234、专利申请US 2010/0209945以及专利申请US 2006/0009623中列举了用 于固定的各种方法）。
[0074] 在另一个实施方案中，细胞凋亡诱导配体是全蛋白的衍生物或类似物。在另一个 实施方案中，细胞凋亡诱导配体是小有机分子。在另一个实施方案中，细胞凋亡诱导配体 是全蛋白的变体、衍生物、修饰型式或截短型式。在另一个实施方案中，FasL是人FasL如 SEQ ID N0:1中所阐述。在另一个实施方案中，本发明的人TNF-α包含SEQ ID N0:2。在 另一个实施方案中，本发明的人Trail包含SEQ ID NO :3。在另一个实施方案中，本发明的 人 Tweak 包含 SEQ ID N0 :4。
[0075] 本文公开的蛋白质通过重组或化学合成方法来产生。
[0076] 在另一个实施方案中，本文提供一种用于从异源细胞群体选择抗细胞凋亡细胞的 方法，其中所述异源群体包含抗细胞凋亡信号传导细胞和细胞凋亡信号传导敏感细胞。在 另一个实施方案中，所述方法包括将所述异源细胞群体引入所述装置中并且在其中进行孵 育。在另一个实施方案中，所述方法包括将所述异源细胞群体引入所述装置中并且在其中 进行孵育。
[0077] 在另一个实施方案中，如本文使用的术语"选择"是指异源细胞群体中仅选择的细 胞存活下来的一种方法。在另一个实施方案中，存活细胞是抗细胞凋亡信号传导细胞。
[0078] 在另一个实施方案中，抗细胞凋亡信号传导细胞是干细胞。在另一个实施方案中， 抗细胞凋亡信号传导细胞是对活化诱导细胞死亡（AICD)不敏感的免疫细胞。在另一个实 施方案中，抗细胞凋亡信号传导细胞是祖细胞。在另一个实施方案中，抗细胞凋亡信号传导 细胞是干细胞、对活化诱导细胞死亡（AICD)不敏感的免疫细胞、祖细胞或其任何组合。
[0079] 在另一个实施方案中，干细胞是脐带血干细胞。在另一个实施方案中，干细胞是流 动的外周血液干细胞。在另一个实施方案中，干细胞是骨髓干细胞。在另一个实施方案中， 干细胞是癌症干细胞。在另一个实施方案中，干细胞是神经干细胞。在另一个实施方案中， 干细胞是脐带血干细胞、流动的外周血液干细胞、骨髓干细胞、癌症干细胞、神经干细胞或 其组合。
[0080] 在另一个实施方案中，如本文使用的"对活化诱导细胞死亡（AICD)不敏感的免疫 细胞"是指在活化时免疫系统中未经历细胞凋亡的细胞。在另一个实施方案中，对活化诱导 细胞死亡（AICD)不敏感的免疫细胞是非活化T细胞。
[0081] 出于治疗目的收获干细胞要求提取含有干细胞（自体的或来自供体）的组织，并 且然后使所述干细胞与若连同干细胞一起移植则可能具有有害作用的其它细胞群体分离。
[0082] 在另一个实施方案中，短语"抗细胞凋亡"是"抗受体介导的细胞凋亡"。在另一个 实施方案中，本发明的细胞选择方法是一种用于对受体介导的细胞凋亡具有抗性的细胞类 型的单步骤阴性选择方法。在另一个实施方案中，本发明方法允许通过一次性使用所述装 置就同时分离支持临床移植结果的干细胞和免疫细胞，如下文所列举。
[0083] 根据另一个实施方案，可以用于本发明的方法的所述细胞群体来源于但不限于骨 髓、脐带血（UCB)以及祖细胞流动的外周血液（mPB)。然而，本领域技术人员清楚的是，所述 细胞群体还可以来源于含有抗细胞凋亡细胞的其它成体组织。在另一个实施方案中，所述 细胞群体来源于胚胎组织。
[0084] 在另一个实施方案中，异源细胞群体来源于器官或组织。在另一个实施方案中，异 源细胞群体来源于胚胎。在另一个实施方案中，异源细胞群体来源于包含胚胎细胞、干细 胞、免疫细胞或其任何组合的组织。在另一个实施方案中，异源细胞群体来源于骨髓。在 另一个实施方案中，异源细胞群体通过在骨髓基质通过活化和破坏分子锚流到外周血液 (mPB)中之后通过抽吸法或单采血液成分术（apheresis)来将所述骨髓基质机械地移出来 获得。在另一个实施方案中，异源细胞群体来源于外周血液。
[0085] 在另一个实施方案中，所述干细胞选自异源细胞群体。在另一个实施方案中，如本 文使用的短语"异源细胞群体"是指包含如上定义的干细胞和至少一种细胞凋亡敏感细胞 的细胞类型的混合物。在另一个实施方案中，所述异源细胞群体来源于任何生物体。在另 一个实施方案中，所述异源细胞群体来源于哺乳动物来源。在另一个实施方案中，所述异源 细胞群体来源于人来源。
[0086] 在另一个实施方案中，所述异源细胞群体包含谱系阳性细胞和干细胞的混合物。 在另一个实施方案中，如本文使用的"谱系阳性细胞"是指表达成熟细胞谱系标记物的细 胞。在另一个实施方案中，成熟细胞谱系标记物是分化簇（CD)蛋白。
[0087] 在另一个实施方案中，本发明的方法用于进行谱系耗尽。
[0088] 在另一个实施方案中，所述异源细胞群体是组织或其一部分。在另一个实施方案 中，所述异源细胞群体是细胞聚集体。在另一个实施方案中，所述异源细胞群体是单细胞悬 浮液。在另一个实施方案中，所述异源细胞群体是原代培养物。在另一个实施方案中，所述 异源细胞群体是细胞样品。在另一个实施方案中，所述异源细胞群体包含可用于本发明的 促细胞凋亡剂的蚁群。
[0089] 根据另一个实施方案，在所述装置内的孵育持续2小时至72小时。在另一个实施 方案中，在所述装置内的孵育持续2小时至4小时。在另一个实施方案中，在所述装置内的 孵育持续4小时至10小时。在另一个实施方案中，在所述装置内的孵育持续10小时至24 小时。在另一个实施方案中，在所述装置内的孵育持续12小时至36小时。在另一个实施 方案中，在所述装置内的孵育持续24小时至48小时。在另一个实施方案中，在所述装置内 的孵育持续36小时至72小时。在另一个实施方案中，在所述装置内的孵育持续48小时至 72小时。
[0090] 出人意料的是，诸位发明人发现不同的孵育时间与细胞凋亡诱导配体的不同组合 可能导致功能各异的临床效果。因此，孵育时间将根据具体用途，如本文以下所列举。
[0091] 根据另一个实施方案，本发明公开一种细胞选择试剂盒。在另一个实施方案中，所 述试剂盒包括进一步包括用于维持细胞凋亡诱导配体的完整性和活性的溶液的本发明的 装置。在另一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括根据本发明的方法来进行细胞选择的 带有说明书的插入件。在另一个实施方案中，用于维持细胞凋亡诱导配体的完整性和活性 的所述溶液是一种溶液。在另一个实施方案中，所述溶液是缓冲液或培养基，所述缓冲液或 培养基允许所述细胞凋亡诱导配体具有活性，同时还维持它们的完整性和结构。在另一个 实施方案中，所述溶液的成分根据所使用的细胞凋亡诱导配体来变化。在另一个实施方案 中，所述溶液包含蛋白酶抑制剂。在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂选自但不限于： 苯甲基磺酰氟、苄脒、胃蛋白酶抑制剂A、亮抑蛋白酶肽、抑肽酶、抗蛋白酶、EDTA、EGTA或其 任何组合。在另一个实施方案中，所述溶液包含缓冲液系统，所述缓冲液系统选自但不限 于：TRIS 缓冲液或 Glycing-NaOH (Uguw S.0·和 Apte S.P·，Pharmaceutical Technology: 2004年3月：86-113中列举了因蛋白质的稳定性和活性而影响缓冲液选择的不同条件）。
[0092] 在另一个实施方案中，所述溶液包含允许和/或促进细胞存活、细胞生长、细胞增 殖或其任何组合的元素。在另一个实施方案中，允许和/或促进细胞存活、细胞生长、细胞 增殖或其任何组合的元素包括：生长培养基、血清或抗菌剂。根据这个实施方案，所述溶液 允许维持细胞在所述试剂盒的所述装置内的活力。
[0093] 在另一个实施方案中，所述溶液包含允许干细胞增殖的因子。在另一个实施方案 中，允许干细胞增殖的因子选自但不限于生长因子、激素、酶或化学品。
[0094] 在另一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括另外的细胞凋亡诱导配体，所述另 外的细胞凋亡诱导配体添加至所述装置或所述溶液，从而使所述溶液选择性朝向本发明的 抗细胞凋亡细胞。
[0095] 在另一个实施方案中，本发明的试剂盒为添加至细胞群体的细胞凋亡诱导配体的 特性或浓度提供灵活性。根据这个实施方案，所述试剂盒包括各自含有不同的细胞凋亡诱 导配体的另外的容器。试剂盒的使用者根据所需用途选择细胞凋亡诱导配体的优选组合 (如本文以下所列举），将所述配体引入到所述装置中并且允许用所述配体来孵育。
[0096] 在另一个实施方案中，除了所述细胞凋亡诱导配体之外，本发明的试剂盒还提供 暂时的灵活性。如本文以下所列举，细胞凋亡诱导配体的不同组合、顺序施用或孵育时间会 导致不同的临床效果。试剂盒的使用者可以选择添加细胞凋亡诱导配体的所需顺序以及各 个配体在所述装置内的孵育期，从而实现选择的临床效果。
[0097] 根据另一个实施方案，本发明进一步公开一种用于改进造血干细胞和祖细胞 (HSPC)移植的临床效果的方法。在另一个实施方案中，提供了包含HSPC的细胞群体。在另 一个实施方案中，使所述细胞群体与本发明的装置内和在所述装置内孵育的细胞凋亡诱导 配体接触。在另一个实施方案中，收回存活细胞。在另一个实施方案中，将收回的细胞移植 在受试者体内。
[0098] 在另一个实施方案中，将同种异体脐带血引入到本发明的所述试剂盒的所述装置 中。根据这个实施方案，将FasL固定在所述容器的内表面上。在所述装置中将血液孵育少 于24小时。在孵育结束时，将TNF-α引入到所述装置中并且继续孵育24至48小时。在 第二次孵育之后，从所述装置提取细胞并且将所述细胞移植到患者体内。在另一个实施方 案中，在孵育结束与移植之间使用分离步骤，以便在溶液中将活细胞从细胞碎片和蛋白质 中分离出来。
[0099] 在另一个实施方案中，本方法的细胞群体来源于自体移植体。在另一个实施方案 中，本方法的细胞群体来源于同种异体移植体。
[0100] 根据另一个实施方案，本发明进一步公开一种用于消除组合物中的恶性细胞的方 法。在这种方法中，使所述组合物与细胞凋亡诱导配体接触并且用所述细胞凋亡诱导配体 进行孵育。在另一个实施方案中，所述组合物包含祖细胞移植体。
[0101] 在另一个实施方案中，所述细胞凋亡诱导配体是FasL。在另一个实施方案中，孵育 持续约24小时。诸位发明人在体内研究中已表明，出人意料的是，在约24小时内将FasL 添加至含有恶性细胞的移植体会消除恶性污染物并且改进存活率（图15E至图F)。
[0102] 根据另一个实施方案，这种消除技术有可能确保来自患有亚临床恶性疾病的表面 健康的供体的移植物中不存在恶性细胞。
[0103] 根据另一个实施方案，从癌症患者的骨髓中提取移植体并且将所述移植体引入到 本发明的装置中。根据这个实施方案，用固定的FasL将所述移植体孵育约24小时。在孵 育结束之后，将所选择的细胞返回移植到所述癌症患者体内。在另一个实施方案中，分离步 骤在移植之前，以便将选择的细胞从细胞碎片和蛋白质中分离出来。
[0104] 根据另一个实施方案，本发明进一步公开一种用于预防移植物抗宿主疾病（GvHD) 同时保留移植物抗肿瘤（GvT)活性的方法。根据这种方法，提供了样品。在一个实施方案 中，所述样品包括细胞群体。在另一个实施方案中，所述细胞群体包含HSPC。在另一个实施 方案中，所述细胞群体包含免疫细胞。在另一个实施方案中，所述细胞群体包含HSPC、免疫 细胞或其组合。根据一个实施方案，使所述细胞群体与细胞凋亡诱导配体接触。在另一个 实施方案中，从所述装置中收回存活细胞。在另一个实施方案中，将收回的细胞移植在受试 者体内。
[0105] 根据另一个实施方案，本发明的方法使得仅选择不诱导GvHD的T细胞子集。诸位 发明人出人意料地发现，在未同步进行T细胞敏化的情况下，用FasL短暂孵育2至16小时 会导致GvHD效应物的有效去除（图9)。根据这个实施方案，将实现支持造血祖细胞移入的 T细胞子集的存活，因为用FasL对移植的细胞的处理并不损害移入（图14)。
[0106] 在另一个实施方案中，对来自供体接种物的细胞凋亡敏感T细胞的选择性消除并 不会损害强有力的移植物抗肿瘤（GvT)反应的产生。
[0107] 根据另一个实施方案，本发明的方法可以用在本领域中已知遭受较高程度GvHD 的同种异体流动的外周血液移植体上。在这个实施方案中，将所述同种异体流动的外周血 液移植体引入到本发明的装置中。接着用固定的FasL将所述移植体孵育2至16小时的较 短时间。在孵育之后，收回剩余细胞并且将所述剩余细胞移植到患者体内。根据另一个实 施方案，分离步骤可以在移植之前，以便将选择的细胞从细胞碎片和蛋白质中分离出来。
[0108] 根据另一个实施方案，本发明的方法可以用于在供体淋巴细胞输注（DLI)之前选 择性耗尽未受刺激的T细胞。
[0109] 木艮据一些实施方案的重纟表汰
[0110] 在另一个实施方案中，本发明的蛋白质可以通过表达编码宿主细胞内的蛋白质的 多核苷酸分子来合成，所述宿主细胞例如用核酸分子转化的微生物细胞。
[0111] DNA序列编码蛋白可以使用本领域中熟知的各种方法来与产生它们的任何细胞 分离（参见例如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor, N.Y., (2001))。例如，编码野生型蛋白质的DNA可以使用基于已知序列 的核苷酸序列构建的特异性引物通过聚合酶链反应（PCR)由适当的微生物的基因组DNA、 质粒或粘粒扩增而来。合适的技术在本领域中是熟知的，例如在美国专利号4, 683, 195、 4, 683, 202、4, 800, 159 以及 4, 965, 188 中有所描述
[0112] DNA可以在扩增之前使用本领域中已知的各种方法来从细胞提取，参见例如Marek P. Μ^," Cloning and expression in Escherichia coli of Clostridium thermocellum DNA encoding p-glucosidase activity"，Enzyme and Microbial Technology 第 9 卷，第 8期，1987年8月，第474至478页。
[0113] 编码蛋白质的分离的多核苷酸可以克隆到载体如pET28a质粒中。
[0114] 在编码蛋白质的多核苷酸的分离和克隆之后，可以使用本领域中已知的方法通过 一个或多个碱基对处的修饰来引入一个或多个突变，所述方法例如像位点特异性诱变（参 见例如 Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985,82 :488-492 ;Weiner 等，Gene 1994,151 : 119-123 ;Ishii 等，Methods Enzymol. 1998,293 :53-71);盒式诱变（参见例如 Kegler-Ebo 等，Nucleic Acids Res. 1994 年 5 月 11 日；22 (9) :1593-1599);递归整体诱变（参见例如 Delagrave 等，Protein Engineering 1993,6(3) :327-331)以及基因位点饱和诱变（参见 例如美国专利申请号2009/0130718)。
[0115] 还熟知用于将多个突变引入到多核苷酸中的方法（参见例如Michaelian等， Nucleic Acids Res. 1992,20 :376 ;Dwivedi 等，Anal. Biochem. 1994,221 :425-428 ;Bhat Methods Mol.Biol. 1996,57 :269-277 ;Meetei 等，Anal.Biochem. 1998,264 :288-291 ;Kim 等，Biotechniques 2000,28 :196-198 ;以及国际专利申请
【发明者】S·亚科尼, N·阿斯肯纳西 申请人:塞莱克特生物技术有限公司