检测人老龄化的多肽标志物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新筛选出的用于检测人老龄化的多肽标志物及其筛选方法。所述多肽标志物的肽段序列为LDELRDEGK和/或VFDEFKPLVEEPQNLIK。筛选方法，是采用不依赖常规标物的非标记HPLC-MS/MS定量醛修饰高风度蛋白肽段的方法以筛选出合适的肽段用于HPLC-MS检测以预警老龄化。
【专利说明】检测人老龄化的多狀标志物
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质组学技术的应用，具体地说，涉及一种应用蛋白质组学技术研究检测人老龄化的多肽标志物。
【背景技术】
[0002]衰老(Aging)通常是指在正常状况下生物发育成熟后，随年龄增加自身机能减退，内环境稳定能力与应激能力下降，结构、组分逐步退行性变，趋向死亡，不可逆转的现象。
[0003]衰老机制的研究，现代已经从整体水平、器官水平发展到细胞水平、分子水平。总的说来，整体水平的衰老变化是机体全身性变化的反映，也就是通常所讲的老征(SenileSymptoms)现象，以及机体的形态结构与生理功能方面的退行性变化。近年来衰老在细胞水平、分子水平变化的研究也取得了很快的进展，总的看法是细胞及其细胞膜、细胞器、细胞核都在衰老过程中表现出明显的增龄变化，同时细胞间质也随增龄而逐步老化。目前国内外对衰老机制开展的多方面研究都有很大的进展，已有多个解释衰老过程的理论被提出，但还尚未有某个单一理论被广泛的接受。例如，老龄化的过程被归因于分子的交联、免疫功能的改变、自由基引起的损伤、与衰老有关的基因以及最近提出的端粒学说。衰老作为一个显著的生理过程，仍然是个人类认知中的未解之谜，也许该过程本就难以用单一的理论加以解释，目前人们更倾向于认为老龄化的过程是由多个因素共同影响的结果。我国的老年病研究起步较晚，但却面临着人口基数大，人口增长速度快等严峻的形式。1994年我国老年人人口比例占人口总数的8.8%，到了 1999年10月这个比例已增长至10%，全国进入老龄化社会。目前，我国老年人绝对数已达到I亿以上，预计到2030年将达到3.75亿，占人口总数的24.75%。面对我国快速进入老年型国家的局面，我国老年性痴呆及相关疾病的患病率已经超过10%，即已经超过千万的患者，占世界首位，其中老年性痴呆患者已经超过600万。由于这类疾病的发病机制尚不清楚、早期诊断困难且病因复杂。随着人口老龄化的进一步加剧，老年性疾病在50年内将可能增加一倍，因此研究老年性痴呆及相关疾病的生物标志物就成为了刻不容缓的迫切任务。
[0004]已经有研究的衰老生物标志物，例如肿瘤抑制因子P16(INK4a)、Prelamin A、端区，端粒、晚期糖基化终产物(AGEs)等，还有一些其它生物标志物，如视网膜上皮细胞色素retinal pigment epithelium(RPE)、TNF-alpha 的合成量、长醇等。
[0005]在交联学说中，比较关键的一个反应是美拉德反应。该反应是还原糖与蛋白氨基酸侧链的氨基之间进行的反应，该反应会通过一系列复杂的过程最终引发蛋白的交联。在美拉德反应的早期阶段，首先会通过形成希夫碱进而经过重排形成Amadori产物(早期糖基化产物)，在这一过程中，美拉德反应是可逆的。接下来经过缩合、二聚、交联等一系列复杂的反应过程，最终形成了晚期糖基化终产物(AGEs)，且反应发展到这个阶段不再是不可逆的。有研究表明AGEs在体内的积累与老龄化疾病相关。而美拉德反应也可以发生在醛类物质与蛋白氨基酸侧链的氨基之间，因为醛类物质与还原糖类似，都具有作为亲电试剂的甲酰基，从而被氨基的孤对电子进攻发生修饰，而最终导致蛋白功能的丧失，宏观上即表现为“衰老”。
[0006]在生理条件下，各种内源或外源性的醛类物质可以通过氨基脲敏感胺氧化酶(SSAO)催化伯胺产生。SSAO酶广泛分布在不同的组织中，特别是在血管平滑肌细胞和脂肪组织中有更多的分布。该酶能催化各种胺形成的醛(包括甲醛、丙酮醛等)和过氧化氢。且有文献报道在老龄化相关疾病中，SSAO酶在老龄化疾病中活性显著上调，从而可更有效率地去催化产生甲醛，因此推测催化生理底物甲胺和氨基丙酮所产生的甲醛及丙酮醛也会相应上调，这也就是为什么会有不合符年龄趋势的“早衰”现象的产生。而接下来，产生的甲醛和丙酮醛等醛类物质就可以通过美拉德反应对蛋白进行修饰，使蛋白最终因为交联而丧失功能。因此，在本发明中发明人借助人血清白蛋白(HSA)建立了一个体外蛋白被交联的模型，用以寻找人老龄化生物标志物。
【发明内容】
[0007]本发明的技术目的是提供一种新筛选出的用于检测人老龄化的多肽标志物。
[0008]本发明的另一个目的是提供一种基于质谱的不依赖常规标品非标记的蛋白质组学方法，用以筛选人类老龄化程度的生物标志物。
[0009]本发明的技术方案是:
[0010]检测人老龄化的多肽标志物，肽段序列为LDELRDEGK (如SEQ ID N0.1所示)和/或 VFDEFKPLVEEPQNLIK (如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0011]所述多肽标记物来源于人血清白蛋白。本发明的多肽标志物的筛选方法，是采用不依赖常规标物的非标记HPLC-MS/MS定量醛修饰高丰度蛋白肽段的方法以筛选出合适的肽段用于HPLC-MS检测以预警老龄化。具体步骤为:
[0012]首先基于人血清白蛋白HSA建立体外模拟老龄化模型，采用18O标记方法考察小分子醛类物质对人血清白蛋白的修饰情况；将酶切后的空白对照组样品进行18O标记，与采用16O平行处理的反应组样品l:l(v/v)混合，进行HPLC-MS检测；分析不同孵育时间、不同浓度甲醛/丙酮醛溶液对标准HSA的修饰程度；通过对HSA肽段的定量分析，找到一组对醛不敏感的肽段，在其中选择最不易被醛修饰的肽段AAFTECCQAADKAACLLPK作为内标肽段，将易被醛修饰的肽段与内标肽段峰面积之比用以衡量醛敏感肽的修饰程度；从而筛选出与甲醛/丙酮醛共育具有浓度、时间相关性的醛敏感肽段；接下来，将这些肽段用正常人血浆样品，在与标准蛋白相同的体外孵育条件下进行验证；继而在不同年龄段人群的临床血浆样本中验证醛敏感肽段，经检测最终获得2条肽段VFDEFKPLVEEPQNLIK和LDELRDEGK为生物标志物用于预警老龄化。
[0013]本发明以人血衆中的最高丰度蛋白，人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA),为研究对象，首先建立、优化HSA与不同浓度的小分子醛类物质(甲醛、丙酮醛)溶液体外模拟体内发生非酶糖化(醛化)的反应(Maillard反应)，建立老龄化肽类生物标志物的体外筛选模型，采用18O标记方法研究醛对HSA的修饰作用，筛选出一组随醛浓度增大或反应时间延长而消耗程度加剧的HSA肽段作为老龄化的生物标志物候选物。
[0014]继而在此基础上，将体外模型筛选出的生物标志物候选物以复杂蛋白体系进行验证。仿照体外模型取 多例健康人血浆混合后与不同浓度的醛(甲醛、丙酮醛)共同孵育，分别考察各候选肽段在复杂蛋白体系中的表现。最后将有望成为潜在生物标志物的肽段候选物应用于实际临床样本进行验证，从而筛选出一组符合临床规律的肽类生物标志物以期待用于衡量人类衰老程度。
[0015]本发明的筛选方法选择了高丰度蛋白作为研究对象。美拉德反应属于非酶催化的化学反应，不具有选择性。因此发明人认为外周血高丰度蛋白有更高的概率被带有甲酰基的小分子醛类物质所修饰，而修饰的程度则反映体内尚未代谢掉的游离醛的水平，且体内醛分子的水平关系到蛋白被修饰的程度，即功能丧失的程度，因而可以比宏观上表现出的衰老更为敏锐，同时规避了低丰度蛋白在检测上的困难，包括难以达到准确定量等不利因素。这一策略不同于在过往的研究中，研究者们普遍认为功能性蛋白为低丰度蛋白，而生物标志物也会来自低丰度蛋白的传统思路。
[0016]本发明筛选并验证得到了一组有效、典型的醛敏感肽段，这既弥补了单一生物标志物特异性不高、准确性欠佳等问题，又创新性的提出了用HSA自身酶切得到醛不敏感肽段作为内标，以醛敏感肽段和内标肽段峰面积之比作为修饰程度指标，这一新方法巧妙地解决了真实人群样本中存在较大个体差异，而使得相对定量存在较大困难的问题。本发明提出了定量肽类生物标志物作为临床评价人类衰老程度的新策略，获得了表征衰老的相关指标。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1不同胰蛋白酶与HSA的比例对酶解效率的影响；
[0018]图2不同酶解时间对酶解效率的影响；
[0019]图3不同尿素浓度对标记比例的影响:A)酶切后HSA肽段在不同尿素浓度下标记比例的平均值；B)标记比例值最低的4个肽段，其标记效率对尿素浓度的变化趋势；
[0020]图4标记缓冲液pH值、浓度以及酶切终止方式对标记比例的影响:A)标记缓冲液PH值对标记比例的影响；B) KH2PO4-K2HPO4浓度对4个标记比例最低的肽段的影响；
[0021 ] 图5标记时间对标记效率的影响；
[0022]图6优化条件下51个可被稳定检测的HSA肽段标记效率的分布情况；
[0023]图7肽段离子m/z=977.4作为内标离子在老龄化体外模型中的验证；
[0024]图8HSA与不同浓度醛溶液发生交联反应的情况:A) HSA肽段与醛溶液共育10天后各肽段的160/180峰面积之比；B) HSA肽段与醛溶液共育20天后各肽段的160/180峰面积之比；C)HSA肽段与醛溶液共育30天后各肽段的160/180峰面积之比；
[0025]图9软件模拟内标肽段与醛敏感肽段在HSA空间结构中的位置:红色部分为内标肽段；蓝色部分为醛敏感肽段；
[0026]图10混合血浆样品中甲醛/丙酮醛不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK在不同孵育时间与不同醛浓度下的160/180相对峰面积比例；
[0027]图1IHPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(甲醛)中的肽段LDELRDEGK ；
[0028]图12HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(丙酮醛)中的肽段LDELRDEGK ；
[0029]图13HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(甲醛)中的肽段YICENQDSISSK ；
[0030]图14HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(丙酮醛)中的肽段YICENQDSISSK ；
[0031]图15HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(甲醛)中的肽段ECCEKPLLEK ；
[0032]图16HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(丙酮醛)中的肽段ECCEKPLLEK ；
[0033]图17HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(甲醛)中的肽段TYETTLEK ；
[0034]图18HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(丙酮醛)中的肽段TYETTLEK ；
[0035]图19HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(甲醛)中的肽段AVMDDFAAFVEK ；
[0036]图20HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(丙酮醛)中的肽段AVMDDFAAFVEK ；
[0037]图21HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(甲醛)中的肽段VFDEFKPLVEEPQNLIK ；
[0038]图22HPLC-MS检测混合血浆样品老龄化体外模型(丙酮醛)中的肽段VFDEFKPLVEEPQNLIK ；
[0039]图23临床样品不同组别中检测目标肽段LDELRDEGK ；
[0040]图24临床样品不同组别中检测目标肽段VFDEFKPLVEEPQNLIK ；
[0041]图25老龄化肽类生物标志物候选物在HSA上空间位置。
【具体实施方式】
[0042]下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。
[0043]下面结合附图对本发明做进一步描述。
[0044]I材料与仪器
[0045]1.1 试剂(表 I)
[0046]表1试剂列表
[0047]
【权利要求】
1.检测人老龄化的多肽标志物，其特征在于:所述多肽标志物的肽段序列为LDELRDEGK 和 / 或 VFDEFKPLVEEPQNLIK。
2.根据权利要求1所述的多肽标志物，其特征在于:所述多肽标记物来源于人血清白蛋白。
3.权利要求1或2所述的多肽标志物的筛选方法，其特征在于:采用不依赖常规标物的非标记HPLC-MS/MS定量醛修饰高丰度蛋白肽段的方法以筛选出合适的肽段用于HPLC-MS检测以预警老龄化。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于:首先基于人血清白蛋白HSA建立体外模拟老龄化模型，采用18O标记方法考察小分子醛类物质对人血清白蛋白的修饰情况；将酶切后的空白对照组样 品进行18O标记，与采用16O平行处理的反应组样品l:l(v/v)混合，进行HPLC-MS检测；分析不同孵育时间、不同浓度甲醛/丙酮醛溶液对标准HSA的修饰程度；通过对HSA肽段的定量分析，找到一组对醛不敏感的肽段，在其中选择最不易被醛修饰的肽段AAFTECCQAADKAACLLPK作为内标肽段，将易被醛修饰的肽段与内标肽段峰面积之比用以衡量醛敏感肽的修饰程度；从而筛选出与甲醛/丙酮醛共育具有浓度、时间相关性的醛敏感肽段；接下来，将这些肽段用正常人血浆样品，在与标准蛋白相同的体外孵育条件下进行验证；继而在不同年龄段人群的临床血浆样本中验证醛敏感肽段，经检测最终获得2条肽段VFDEFKPLVEEPQNLIK和LDELRDEGK为生物标志物用于预警老龄化。
【文档编号】G01N30/02GK103694342SQ201310560354
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】邓玉林, 张玫 申请人:北京理工大学