专利名称：一种多肽食盐替代物及其制备方法
技术领域：
本发明属于食品领域，涉及一种多肽食盐替代物及其制备方法，具体涉及大豆蛋白的酶解、目标多肽的分离纯化和测序技术及目标多肽的咸度评定。
背景技术：
“民以食为天，食以味知先”。咸味是一种基础的食品风味。食盐是最基础的咸味剂，也是唯一具有重要生理功能的的味制剂，它可调节细胞与血液之间的渗透平衡和正常的水盐代谢。然而过多的食盐摄入会严重影响人类的健康，引起一系列的疾病。据研究表明，长期高钠饮食容易产生钠的滞留，而钠的滞留会导致肾脏病及心血管疾病。随着生活水平的提高，人们越来越注意饮食的健康，因而开发一种新型的咸味剂迫在眉睫。本发明采用大豆蛋白作为原料，制得具有咸味的多肽，能够部分替代食盐从而减少钠离子的摄入，使人们的饮食更加安全健康，具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽食盐替代物。本发明的另一目的在于提供一种多肽食盐替代物的制备方法。本发明制备的多肽食盐替代物既能拥有食盐的咸味，同时又能降低钠离子的摄入，避免了由于高钠饮食引起的一系列的疾病，因而更符合现代人的健康饮食观念。本发明的目的可以通过以下技术方案实现一种多肽食盐替代物，其在于由包括下述步骤的方法制成(1)制备酶解液将大豆蛋白制成水溶液、并水浴反应后；加入Alcalase酶酶解并灭活，调节PH值后，再加入胃蛋白酶酶解并灭活，离心留上清；(2)分离纯化目标多肽将步骤(1)制备的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖层析柱中进行脱盐及初步分离，收集具有咸味的组分；然后将目标溶液浓缩并进行G-15葡聚糖凝胶层析，再次收集具有咸味的组分；将经G-15葡聚糖层析收集的咸味多肽混合物放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干粉；将冻干粉使用反相高效液相色谱仪进行进一步分离纯化，得到纯净的咸味多肽。上述的多肽食盐替代物，其在于所述的多肽食盐替代物氨基酸序列为Gly-Lys。上述的多肽食盐替代物，其在于步骤(1)中制成的大豆蛋白水溶液的浓度为8 15g/L，水浴条件为80 85°C反应15 20min ；Alcalase酶酶解反应条件为42 47°C反应100 120min ；胃蛋白酶酶解反应条件为46 50°C反应100 120min ；两次酶解反应后灭活条件为95 100°C灭活15 20min ；Alcalase酶酶解反应后将反应溶液的pH值调成 1. 0。上述的多肽食盐替代物，其在于步骤⑴制备酶解液的过程中，大豆蛋白与 Alcalase酶的质量体积比(g/ml)为1 0. 05 0. 07，大豆蛋白与胃蛋白酶的质量比为 1 0. 03 0. 05。
上述的多肽食盐替代物，其在于步骤O)中进行G-25葡聚糖层析和G-15葡聚糖层析时的洗脱速度为lml/min，用反相高效液相色谱仪进行进一步分离纯化时的B液为乙 If+0.01% TFA(v/v/% )，洗脱梯度为30%~ 60% B，洗脱时间:60min。上述的多肽食盐替代物的制备方法，其在于包括以下步骤(1)制备酶解液称取大豆蛋白溶于水中制成8 15g/L的溶液，将溶液在80 85°C水浴条件下反应15 20min，冷却后加入Alcalase酶于42 47°C反应100 120min， 95 100°C灭活15 20min ；调至pH为1. 0后，加入胃蛋白酶于46 50°C反应100 120min，95 100°C灭活15 20min，离心保留上清液；其中大豆蛋白与Alcalase酶的质量体积比(g/ml)为1 0.05 0.07，大豆蛋白与胃蛋白酶的质量比为1 0. 03 0. 05 ；(2)分离纯化目标多肽将步骤(1)制备的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖层析柱中进行脱盐及初步分离，收集具有咸味的组分；然后将目标溶液浓缩并进行G-15葡聚糖凝胶层析，再次收集具有咸味的组分；将经G-15葡聚糖层析收集的咸味多肽混合物放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干粉；将冻干粉使用反相高效液相色谱仪进行进一步分离纯化，得到咸味多肽。上述的多肽食盐替代物的制备方法，其在于所述的步骤O)中步骤O)中进行 G-25葡聚糖层析和G-15葡聚糖层析时的洗脱速度为lml/min，用反相高效液相色谱仪进行进一步分离纯化时的B液为乙腈+0.01% TFA(ν/ν/%)，洗脱梯度为30^-60% B，洗脱时间:60min。本发明通过单因素实验及正交实验确定大豆蛋白酶解的最适温度、pH、时间、最适酶添加量等条件。根据感官评定结果，通过多次试验确定葡聚糖凝胶层析流速等条件，反相高效液相色谱的最适进样量及B液的最适浓度梯度等条件，最终分离纯化得到咸味多肽。多肽食盐替代物的制备方法包括1.酶解液的制备称取大豆蛋白溶于蒸馏水中制成8 15g/L的大豆蛋白溶液， 加热使蛋白质的高级结构被破坏，解螺旋从而利于酶对其进行切割。接着加入Alcalase酶及胃蛋白酶，使其在最适的条件下对大豆蛋白进行定向切割。最后高速离心保留上清液去除杂质，得到多肽混合液。2.咸味多肽的分离纯化及测序首先将得到的多肽混合液经G-25葡聚糖凝胶层析，进行脱盐并去除一部分分子量大的多肽，然后经感官评定选出具有咸味或近似咸味的组分。这些组分再经G-15葡聚糖凝胶层析，得到分子量相近的多肽段。接着使用反相高效液相色谱仪对其进行分离纯化，再经感官评定得出具有咸味的多肽。最后采用蛋白质测序仪对分离得到的咸味多肽进行测序，得到其序列。即制得具有咸味的多肽。3.咸味多肽的感官鉴定采用“与对照的差异检验”法将呈梯度浓度的咸味多肽溶液与特定浓度的NaCl溶液进行比较，从而得到咸味多肽的咸度。本发明的有益效果本发明以大豆蛋白为原料，通过葡聚糖凝胶层析以及反相高效液相色谱的分离， 制得了纯净的咸味多肽，重复性高，结果精确可靠。本发明是我国首次对咸味肽进行研究。开发出的咸味肽在保证咸味的同时能降低钠离子的摄入，避免了由于高钠离子摄入而引起的一系列疾病，从而更加保健，深受广大消费者欢迎，具有很好的经济价值及市场前景。
本发明是首次研究对肉品加工既有调味作用又有改变其物化性质且对人的营养有益的食盐替代物。本发明是首次对天然资源进行酶解，并从中分离出咸味肽，更加安全可靠。
图1为咸味肽高效液相色谱图。
具体实施例方式实施例11.酶解液的制备1)称取Ig大豆蛋白溶于IOOml水中，在80 85°C条件下加热15 20min。2)冷却，加入Alcalase酶(诺维信)0. 06ml，在42 47 °C条件下反应100 120mino3)于95 100°C条件下加热15 20min，灭活。4)冷却，调节溶液的pH至1.0，加入胃蛋白酶0. 04g，于46 50°C下反应100 120mino5)于95 100°C条件下加热15 20min，灭活。6)使用高速离心机，在SOOOrpm条件下离心15 20min。保留上清液去除沉淀。
2.咸味多肽的分离纯化及测序1)吸取2ml多肽混合液加到G-25葡聚糖层析柱中，以lml/min的流速进行脱盐及初步分离，收集分离得到的组分。2)选取15 20名感官评定员对收集的组分进行感官评定，选出其中具有咸味的组分。3)重复G-25葡聚糖层析数次，收集足够量含有咸味多肽的组分。4)将收集的目标溶液进行旋转蒸发，浓缩从而提高咸味多肽的浓度。5)吸取2ml的浓缩液加到G-15葡聚糖层析柱中，以lml/min的流速进行进一步地分离，收集分离得到的组分。6)选取15 20名感官评定员对收集的组分进行感官评定，选出其中具有咸味的组分。7)重复G-15葡聚糖凝胶层析数次，收集足够量的目的肽混合物。8)将经G-15葡聚糖层析收集的咸味多肽混合物放入冷冻干燥干燥机中，进行冷冻干燥，得到冻干粉。9)将冻干粉使用反相高效液相色谱仪进行进一步分离纯化，通过多次的分离纯化，得到高纯度的咸味多肽。样品加样量为25ul、B液洗脱梯度为30% 60%8、洗脱时间:60min。B 液为乙腈 +0. 01% TFA (v/v/% )。10)使用蛋白质测序仪对咸味多肽进行测序，得到其氨基酸序列为Gly-Lys。
3.多肽咸度的鉴定采用“与对照的差异检验法”对多肽咸度进行鉴定，具体方法如下1)按质量百分含量计，配制浓度为0.6%的食盐溶液作为对照，浓度分别为
50.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%的咸味肽溶液作为样品。同时配制相同浓度的食盐溶液
作为盲样。2)将样品及盲样进行随机数字编码，将样品与对照以小组的形式呈递。每组中包括一个样品和一个对照，其中对照溶液标志出来。3)选取30 50名评价员对其进行评定，一次评定5个样品，评价6次。评定待测样品与对照之间的差异度，并打分。每个分值对应相对的差异程度。4)将最终的结果进行方差分析，得到与浓度为0. 6%的食盐溶液咸度相当的样品溶液浓度，从而得到咸味多肽的咸度。评定结果如下样品类别溶液评定说明1.你将成对分别评定5个样品，每一对的第一个评定是对照，记录样品编号；2.评定样品的咸度，并用如下尺度表示样品与对照间的差异程度，将你认为最能表达与对照样差异程度的尺度值填入评定结果。-3——比对照咸味极淡-2——比对照咸味很淡-1——比对照咸味较淡0——咸度与对照并无差异1——比对照较咸2——比对照很咸3——比对照极咸表1采用“与对照的差异检验法”对多肽咸度进行鉴定的鉴定结果
权利要求
1.一种多肽食盐替代物，其特征在于由包括下述步骤的方法制成(1)制备酶解液将大豆蛋白制成水溶液、并水浴反应后；加入Alcalase酶酶解并灭活，调节PH值后，再加入胃蛋白酶酶解并灭活，离心留上清；(2)分离纯化目标多肽将步骤(1)制备的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖层析柱中进行脱盐及初步分离，收集具有咸味的组分；然后将目标溶液浓缩并进行G-15葡聚糖凝胶层析，再次收集具有咸味的组分；将经G-15葡聚糖层析收集的咸味多肽混合物放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干粉；将冻干粉使用反相高效液相色谱仪进行进一步分离纯化， 得到纯净的咸味多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽食盐替代物，其特征在于所述的多肽食盐替代物氨基酸序列为Gly-Lys。
3.根据权利要求1所述的多肽食盐替代物，其特征在于步骤(1)中制成的大豆蛋白水溶液的浓度为8 15g/L，水浴条件为80 85°C反应15 20min ；Alcalase酶酶解反应条件为42 47°C反应100 120min ；胃蛋白酶酶解反应条件为46 50°C反应100 120min ；两次酶解反应后灭活条件为95 100°C灭活15 20min ；Alcalase酶酶解反应后将反应溶液的PH值调成1. 0。
4.根据权利要求1所述的多肽食盐替代物，其特征在于步骤(1)制备酶解液的过程中， 大豆蛋白与Alcalase酶的质量体积比(g/ml)为1 0. 05 0. 07，大豆蛋白与胃蛋白酶的质量比为1 0. 03 0. 05。
5.根据权利要求1所述的多肽食盐替代物，其特征在于步骤( 中进行G-25葡聚糖层析和G-15葡聚糖层析时的洗脱速度为lml/min，用反相高效液相色谱仪进行进一步分离纯化时的B液为乙腈+0.01% TFA(v/v/% )，洗脱梯度为30% 60% B，洗脱时间60min。
6.权利要求1或2所述的多肽食盐替代物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备酶解液称取大豆蛋白溶于水中制成8 15g/L的溶液，将溶液在80 85°C水浴条件下反应15 20min，冷却后加入Alcalase酶于42 47°C反应100 120min，95 100°C灭活15 20min ；调至pH为1. 0后，加入胃蛋白酶于46 50°C反应100 120min， 95 100°C灭活15 20min，离心保留上清液；其中大豆蛋白与Alcalase酶的质量体积比 (g/ml)为1 0.05 0.07，大豆蛋白与胃蛋白酶的质量比为1 0. 03 0. 05 ；(2)分离纯化目标多肽将步骤(1)制备的大豆蛋白酶解液加入到G-25葡聚糖层析柱中进行脱盐及初步分离，收集具有咸味的组分；然后将目标溶液浓缩并进行G-15葡聚糖凝胶层析，再次收集具有咸味的组分；将经G-15葡聚糖层析收集的咸味多肽混合物放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干粉；将冻干粉使用反相高效液相色谱仪进行进一步分离纯化， 得到咸味多肽。
7.根据权利要求6所述的多肽食盐替代物的制备方法，其特征在于所述的步骤O)中步骤O)中进行G-25葡聚糖层析和G-15葡聚糖层析时的洗脱速度为lml/min，用反相高效液相色谱仪进行进一步分离纯化时的B液为乙腈+0.01% TFA(V/V/% )，洗脱梯度为 30% 60% B，洗脱时间60min。
全文摘要
本发明属于食品领域，具体公开了一种多肽食盐替代物及其制备方法，通过大豆蛋白的酶解、目标多肽的分离纯化及测序，最终制得具有咸味的多肽，制备工艺包括用Alcalase酶及胃蛋白酶对大豆蛋白进行定向切割得到多肽混合液；使用葡聚糖凝胶层析柱、反相高效液相色谱仪对目的多肽进行分离纯化；目标多肽的咸味评定。本发明采用天然的大豆蛋白作为原料，制得咸味多肽，能够部分代替食盐减少钠离子的摄入，避免了由于长期高钠饮食引起的一系列的疾病，因而会受到广大消费者的欢迎，具有很大的经济效益和广阔的市场前景。
文档编号A23L1/237GK102224921SQ20111012119
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月11日 优先权日2011年5月11日
发明者张雅玮, 彭增起, 郭秀云 申请人:南京农业大学