反馈抗性α-异丙基苹果酸合酶的制作方法

反馈抗性α-异丙基苹果酸合酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％、优选≥97％、特别优选≥98％、非常特别地优选≥99％、极其优选100％相同，其中SEQ ID NO:2在553位或在该氨基酸序列的相应位置具有除L-酪氨酸以外的蛋白原氨基酸，本发明涉及一种包含所述核苷酸序列的微生物，也涉及使用这种微生物生产精细化学品的方法。
【专利说明】反馈抗性a-异丙基苹果酸合酶
[0001] 本发明涉及一种分离的核巧酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与 SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列至少>90%、>92%、>94%、>96%、>97%、>98%、>99% 或100%、优选> 97%、特别优选> 98%、非常特别地优选> 99%、极其优选100%相同，其 中SEQ ID NO:2在553位或在所述氨基酸序列的相应位置具有除k酪氨酸W外的蛋白原 氨基酸（proteinogenic amino acid),本发明涉及一种包含所述核巧酸序列的微生物，也 涉及使用该种微生物生产精细化学品的方法。
[0002] 精细化学品，其尤其包括氨基酸、有机酸、维生素、核巧和核巧酸，用于人类医学、 制药产业、化妆品、食品产业和动物饲料。
[0003] 大量该些化合物是通过棒状细菌菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)发酵产生的。由于其非常重要，改进该产生方法的工作一直在进行。方法改进 可W涉及发酵措施，例如，揽动和供给氧气，或者营养培养基的组成，例如，发酵期间的糖浓 度，或者通过譬如离子交换层析给出产品形式的步骤，或者微生物本身的内在性能。
[0004] 诱变、筛选和突变选择的方法被用来改进所述微生物的性能。用该种方式，获得 的菌株耐抗代谢物，例如亮氨酸类似物4-氮亮氨酸或5, 5, 5-H氣亮氨酸，并产生化合物， 例如k氨基酸，如L亮氨酸。举例来说，可提及参考文献化salone et al. (Research in Microbiology 148:613-623 1997)〇
[0005] 若干年来，重组DNA技术的方法已用于k氨基酸-生产菌株谷氨酸棒杆菌的改 进，其中，例如增强或减弱单个氨基酸生物合成基因，并研究对化合物产生的影响。
[0006] 可在"Han化ook of Corynebacterium glutamicum"巧ds. : L. Eggeling and M. Bott, CRC Press,Taylor&Francis, 2005)、Journal of Biothechnology(主 编；A. Piihler)特干Ij,标题为 "A New E；ra in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" (Journal of Biotechnology 104/1-3, (2003))、和 T. Sch巧er(总编 牵茸)的书"Microbial Production of L Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, Springer Verlag, Berlin, Germany, 2003)中找至Li谷氨酸 棒杆菌生物学、遗传学和生物技术的综述。
[0007] 在 Ikeda 和 Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)) . EPl 108790 和 Kalinowski 等(Journal of Biotechnologyl04/l-3,（2003))中描述了谷氨酸棒杆菌基因组的核巧酸序列。
[0008] 在国家医学图书馆的国家生物技术信息中也（NCBI)炬ethesda，Maryland, USA)、 日本DNA数据库值DBJ，Mishima，Japan)或者欧洲分子生物学实验室的核巧酸序列数据库 ^ide化erg, Germany or Cambridge, UK)中也有谷氨酸棒杆菌基因组的核巧酸序 列。
[0009] 尤其通过如下细节描述来自谷氨酸棒杆菌的编码a-异丙基苹果酸合酶的IeuA 基因：
[0010] a -异丙基苹果酸合酶（IPMS，EC = 2. 3. 3. 13)催化己醜-CoA的己醜基与3-甲 基-2-氧代下酸盐（醋）（2-氧代异戊酸盐（醋），丽基异戊酸盐（醋））的缩合，用于 3-駿基-3-轻基-4-甲基戊酸盐（醋）（2-异丙基苹果酸盐（醋））的形成。IeuA基因 包含1851碱基对（bp)，并编码分子量为68187的多肤。对于催化生物合成路径第一步 的酶很普遍，a-异丙基苹果酸合酶受终产物亮氨酸的反馈调节（Pat純et al., Applied !Environmental Microbiology 60:133-140(1994))。并且，在二价阳离子尤其是锋离子存 在的情况下，该酶受辅酶 A 的抑制扣 Im et al., Journal of Bacteriology 110(3) :1118-1126(1972) ；Tracy and Kohlhaw, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 72 巧）：1802 - 1806 (197巧）。
[0011] 根据NCBI数据库的详情，编码来自谷氨酸棒杆菌的a异丙基苹果酸合酶的IeuA 基因的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示，由其编码产生的a -异丙基苹果酸合酶的氨基酸 序列如SEQ ID N0:4所示。在SEQ ID N0:3中位于上游和下游的核巧酸序列另有报道。
[0012] 本发明的目的是提供一种用于产生丽异己酸或k亮氨酸的发酵方法，所述方法 具有提高的产量或者在细胞内和/或培养基中有更高的产物终浓度。
[0013] 本发明的另一目的是提供一种W该样的方式被修饰的细胞，即使存在高的细胞内 浓度的亮氨酸，也能够产生丽异己酸或亮氨酸。
[0014] 本发明的另一目的是基于用于发酵的碳底物量提高丽异己酸或亮氨酸的产量。
[0015] 本发明的
【发明者】令人梅讶地证实a-异丙基苹果酸合酶的一个突变引起丽异己 酸和亮氨酸产生的提高。不希望被任何理论束缚，本发明人推测该个突变降低或者甚至消 除了所述酶的反馈抑制，即通过产物结合至所述酶介导的酶活性的下降。
[0016] 表述"亮氨酸"与"k亮氨酸"同义使用，也包括它的盐，例如k亮氨酸盐酸盐， 心亮氨酸硫酸盐或者巧盐。类似地，表述丽异己酸化IC)也包括它的盐，例如巧-KIC、 钟-KIC或轴-KIC。
[0017] 本发明涉及一种分离的核巧酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与 SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列至少>90%、>92%、>94%、>96%、>97%、>98%、>99% 或100%、优选> 97%、特别优选> 98%、非常特别地优选> 99%、极其优选100%地相同， 其中SEQ ID NO:2在553位或在该氨基酸序列的相应位置具有除k酪氨酸W外的蛋白原 氨基酸。
[0018] 在一个优选实施方案中，由本发明的核巧酸序列编码的氨基酸序列在553位或者 相应位置具有选自谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、半脫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、 谷氨醜胺和天冬醜胺的氨基酸，特别优选选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸。
[0019] 在一个优选实施方案中，由本发明的核酸序列编码的氨基酸序列在553位或相应 位置具有k天冬氨酸。
[0020] 在一个优选实施方案中，本发明的核酸序列是在1657位或相应位置具有鸟嘿岭 的核酸序列，如SEQ ID NO:5所示。
[0021] 表述"相应于所述氨基酸序列的553位的位置"或者"氨基酸序列的553位的同 等位置"是指，通过在编码的多肤的N-末端区域（基于SEQ ID NO: 2的553位）插入或缺 失一个编码氨基酸的密码子，在插入的情况下位置表述和长度表述形式上增加一个单位， 或者，在缺失的情况下，减少一个单位。同样地，通过在编码的多肤的C-末端区域（基于 553位）插入或缺失一个编码氨基酸的密码子，在插入的情况下长度表述形式上增加一个 单位，或者，在缺失的情况下，减少一个单位。该种同等位置可W通过比对"的形式比 较氨基酸序列而容易鉴定，例如使用Clustal W程序（Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994))或者 MAFFT 程序化 atoh et al., Genome Information 2005 ； 16 (I),22-33)〇
[0022] 该些插入和缺失不实质上影响酶活性。"不实质上影响"指所述变体的酶活性与 具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的多肤的活性相差最多10%、最多7. 5%、最多5%、最多 2. 5%或最多1%。
[0023] Koh 化 aw 等（Methods in Enzymology 166:423-9 (1988))描述了 一种用于确 定异丙基苹果酸合酶的酶活性的方法；所述测试基于测量用CoA还原DTNB化5'-二硫 代-(2-硝基苯甲酸），Ellman'S试剂）形成的硫代硝基苯甲酸盐（醋）（TNB)引起的412皿 处的消光变化。
[0024] 本发明相应地也涉及包含该种序列和编码SEQ ID NO: 2或6的多肤变体的核巧酸 序列和核酸分子，其包含一个或多个插入或缺失。优选地，所述多肤包含最多5个、最多4 个、最多3个或最多2个氨基酸插入或缺失。
[0025] 优选分离自棒杆菌属的微生物，特别是谷氨酸棒杆菌的编码异丙基苹果酸合酶的 可复制核巧酸序列，其中由其编码的蛋白质序列在相应于SEQ ID N0:2的553位的位置包 含除k酪氨酸W外的蛋白原氨基酸。
[0026] 进一步地，特别优选编码异丙基苹果酸合酶并分离自棒杆菌属的微生物，特别是 谷氨酸棒杆菌的可复制核巧酸序列值NA)，其中相关氨基酸序列在553位包含k天冬氨酸， 如 SEQ ID NO:6 所示。
[0027] 本发明进一步涉及编码异丙基苹果酸合酶并分离自棒杆菌属微生物，特别是谷氨 酸棒杆菌的可复制核巧酸序列值NA),所述核巧酸序列的碱基序列在1657位包含鸟嘿岭， 如 SEQ ID NO:5 所示。
[0028] 本发明进一步涉及质粒和载体，所述质粒和载体包含本发明的核巧酸序列，W及 任选地在棒杆菌属微生物中复制或适合于棒杆菌属微生物。
[0029] 本发明进一步涉及包含本发明的核巧酸序列、载体和多肤的棒杆菌属微生物。
[0030] 本发明进一步涉及包含由本发明的核巧酸序列编码的氨基酸序列的多肤。一个实 例性多肤如SEQ ID N0:6所示。
[0031] 在一个特别优选实施方案中，本发明的多肤或由本发明的核巧酸序列编码的多肤 或者本发明的微生物包含的多肤是修饰的IPMS，其相对于野生型酶具有降低的反馈抑制， 即所述酶比野生型酶更少受其产物之一或代谢中形成的代谢物例如KIC或k亮氨酸的抑 制。
[0032] 本发明优选进一步涉及包含本发明的核巧酸序列、载体和/或多肤的棒杆菌属微 生物，并且在所述微生物中，编码异丙基苹果酸合酶的核巧酸序列优选W过表达的形成存 在。
[0033] 本发明进一步特别优选涉及包含本发明的核巧酸序列的棒杆菌属微生物，其中编 码异丙基苹果酸合酶的核巧酸序列优选W过表达的形式存在，其中相关氨基酸序列在553 位包含L天冬氨酸，如SEQ ID NO:6所示。
[0034] 为了产生本发明的编码特征在于SEQ ID N0:2的553位存在氨基酸置换的a-异 丙基苹果酸合酶的核巧酸序列，采用现有技术中描述的诱变方法。
[00巧]可采用体外方法诱变，例如，突变寡核巧酸（T. A. Brown:Gentechnologie fiir Einsteiger[初学者遗传工程],Spektrum Akademischer Verlag,Heide化erg, 1993)或 Newton和 Gr址am 的手册（PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heide化e;rg, 1994)中描述 的聚合酶链式反应（PCR)。
[0036] 可在现有技术和已知的遗传和分子生物学教科书中找到更多的生成突 变的操作指南，例如，Knippers编的教科书（；"Molekulare GeneUk"[分子遗传 学],6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995)、Winnacker 编 的（"Gene und Klone"[基因和克隆]VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim,Ge;rma ny, 1990)或者 Hagemann("Allgemeine GeneUk"[普通遗传学],Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)〇
[0037] 当采用体外方法时，采用聚合酶链式反应从野生型菌株的分离的全长DM扩 增现有技术中描述的IeuA基因，任选克隆至合适的质粒载体中，接着所述DNA接受 诱变过程。采用聚合酶链式反应（PCR)扩增DNA序列的操作指南可由本领域技术人 员发现于 Gait 编的手册；Oligonucleotide Synthesis = A Practical ApproachQ化 Press,0xford,UK,1984)和 Newton 和 Graham 的；PCR(Spektrum Akademischer Verlag, Heide化erg, Germany, 1994)。接着分离、研究并测序合适的IeuA等位基因。 用于该目的的操作指南可在例如Kalinowski等（Mole州Iar and General Genetics 224:317324(1990))、Kalinowski 等（Mole州Iar Microbiology 5:1197-204(1991))或 Follettie 等（Journal of Bacteriology 175, 4096-4103(1993))中找到。测序的操作 指南可在例如 Sanger 等（Proceedings of the ^tional Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, (1977))中找到。
[0038] 因此本发明涉及一种编码异丙基苹果酸合酶的分离的多核巧酸，所述分离的多核 巧酸包括具有SEQ ID N0:5所示的核巧酸序列的多核巧酸。
[0039] 本发明进一步涉及一种编码异丙基苹果酸合酶的分离的多核巧酸，所述分离的多 核巧酸包括SEQ ID N0:5所示的核巧酸序列或由其组成。
[0040] 出现于例如微生物的生物中的核巧酸序列的生物化学或化学结构详情尤其 可在 Berg 等的教科书"Biochemie"[生物化学](Spektrum Akademischer Verlag Heide化erg, Berlin, Germany, 2003 ;ISBN 3-8274-1303-6)中找到。
[0041] 在一个优选实施方案中，表述"核巧酸序列"或"氨基酸序列"是指来自包括DM、 RNA和其修饰形式的组的核酸分子，或者包括特定序列例如与另一序列融合或由其组成的 多肤。
[0042] 如果所述核巧酸序列由具有核碱基或碱基腺嘿岭（A)、鸟嘿岭（G)、胞嚼巧似和 胸腺嚼巧（T)的脱氧核糖核巧酸单体组成，则其描述为脱氧核糖核巧酸序列或脱氧核糖核 酸值NA)。如果所述核巧酸序列由具有核碱基或碱基腺嘿岭（A)、鸟嘿岭佑)、胞嚼巧（C)和 尿嚼巧扣）的核糖核巧酸单体组成，则其描述为核糖核巧酸序列或核糖核酸（RNA)。在所述 核巧酸序列中，所述单体通过3' - 5'磯酸二醋键相互共价结合。
[0043] 从化学角度来看，基因是核巧酸序列。编码蛋白质/多肤的核巧酸序列在本文与 表述"基因"同义使用。"基因"和"编码区域"该两种表述同义使用，"蛋白质"和"多肤"该 两种表述也同义使用。
[0044] "蛋白原氨基酸"是指出现在天然蛋白质，即来自微生物、植物、动物和人类的蛋白 质中的氨基酸。它们作为蛋白质的结构单元，其中它们通过肤键相互连接。
[0045] 如果下文中提到蛋白原k氨基酸，是指一或多个选自k天冬氨酸、k天冬醜胺、 k苏氨酸a-丝氨酸a-谷氨酸a-谷氨醜胺a-甘氨酸a-丙氨酸a-半脫氨酸a-额氨 酸、k甲硫氨酸、k异亮氨酸、k亮氨酸、k酪氨酸、k苯丙氨酸、k组氨酸、k赖氨酸、 k色氨酸、k精氨酸、k脯氨酸，和任选地，k砸半脫氨酸和k化咯赖氨酸的氨基酸（包 括其盐）。所述k氨基酸也包括心高丝氨酸。特别优选的k氨基酸是心亮氨酸。
[0046] 过表达通常是指与起始菌株（亲本菌株）或野生型菌株（如果其为起始菌株的 话）相比，核糖核酸、蛋白质（多肤）或酶的细胞内浓度或活性升高。起始菌株（亲本菌 株）是指实施引起过表达措施的菌株。
[0047] 在过表达中，优选重组过表达的方法。该包括使用体外提供的DNA分子产生微生 物的所有方法。该样的DNA分子包括，例如，启动子、表达盒、基因、等位基因、编码区等。该 些经由转化、接合、转导或类似方法转变成期望的微生物。
[0048] 能够通过测量由所述基因转录的mRNA的量、通过确定多肤的量、和通过确定酶活 性证实表达或过表达的程度。
[0049] 尤其可采用Nodhern印迹和定量RT-PCR的方法确定mRNA的量。在 定量RT-PCR中，在聚合酶链式反应前先进行逆转录。为此目的，可使用例如 Jungwirth 等人（FEMS Microbiology Letters 281, 190-197(2008))所描述的 Roche Diagnostics 的 LightCycler? 系统(Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannhei化Germany)。可通过I-维和2-维蛋白质凝胶分离并随后使用相 应评估软件在凝胶中光学鉴定蛋白质浓度来确定蛋白质的浓度。用于制备棒状细菌的蛋 白质凝胶和鉴定蛋白质的常用方法是化rmann等巧Iectro地oresis, 22:1712-23 (2001 ))描述的过程。也可通过用特异于待测蛋白质的抗体的Western-blot杂交（Sambrook et al., Molecular cloning:a laboratory manual. 2nd Ed.Cold Spring Harbor L油oratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)并随后用相应的确定浓度的软件光 学评估（Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39 ;Lottspeich, Angewan化e Qiemie 321:2630-2647(1999))来确定蛋白质浓度。采用T检验确定所得数据的统计学显著性 (Gosset, Biometrika 6 (1):1-25 (1908))〇
[0050] 现有技术中，为实现过表达，可采用许多方法。除了修饰控制所述基因表达的核巧 酸序列外，该些方法也包括增加拷贝数。
[0051] 可通过在微生物细胞质内复制的质粒增加拷贝数。为此目的，现有技术中描述了 用于大多数各种微生物群的大量质粒，使用所述质粒能够设定所述基因拷贝数的期望的增 力口。在例如 Tauch 等（Journal of Biotechnologyl04 (1-3), 27-40, (2003))、或 Stansen 等 (Applied and !Environmental Microbiology 71,5920-5928(2005))中描述了适合于棒杆 菌属的质粒。
[0052] 通过插入更多拷贝至微生物染色体中，拷贝数也能够额外增加至少一（1)个拷 贝。在例如专利文献WO 03/014330、WO 03/040373和WO 04/069996中描述了适合于棒杆 菌属的方法。
[0053] 基因表达也能够因多个启动子位于期望基因的上游或者启动子功能性地连接至 所述待表达基因并且用该种方式实现表达增加而额外增加。专利文献WO 2006/069711中 描述了该样的例子。
[0054] 可W通过抑制转录的蛋白质（阻遏蛋白）或促进转录的蛋白质（激活蛋白）控制 基因的转录。因此，为实现过表达，也可W增加激活蛋白的表达或降低阻遏蛋白的表达或者 关闭其表达或者消除阻遏蛋白的结合位点。
[00巧]延伸速率受密码子使用的影响；使用针对经常出现在起始菌株的转运（t)-RNA 的密码子能够增强翻译。此外，在许多微生物中（77%在大肠杆菌）经常发生的起始 密码子置换为密码子ATG能够显著增强翻译，因为在RNA水平，密码子AUG比例如密码 子 GUG 和 UUG 有效 2-3 倍（Khudyakov et al.，阳BS Letters 232(2) :369-71 (1988); Reddy et al. , Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17):5656-60(1985))。而且，由于已有描述起始密码子与侧翼区域之间的相互 影响（Stenstrom et al.,Gene273 (2):259-65(2001) ;Hui et al., EMBO Journal 3 (3) : 623-9 (1984))，所W起始密码子的序列环境也能够被优化。
[0056] 操作DNA、DNA消化和连接、转化和转化子筛选的操作指南尤其可在已知的 Sambrook 等的手册"Molecular CloningiA Laboratory Manual", Second Edition (Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中找到。
[0057] 本发明也涉及包含本发明的多核巧酸的载体。
[0058] Kirchner和Tauch (Journal of Biotechnology 104:287-299 (2003))描述了用于 谷氨酸棒杆菌的载体的选择。
[0059] 本发明进一步涉及本发明的微生物，其特征在于本发明的核巧酸序列整合进染色 体。使用本发明的载体，同源重组使得染色体上的DNA片段置换为通过所述载体被转运至 细胞内的本发明的多核巧酸。为了载体的环形DNA分子与染色体上的祀DNA之间的有效重 组，包含本发明的多核巧酸的待置换DNA区域的末端具有与祀位点同源的核巧酸序列；该 决定载体整合和DNA置换的位点。
[0060] 例如，本发明的多核巧酸可W在染色体的天然基因位点置换天然IeuA基因，或者 整合在另一基因位点。
[0061] 表达或过表达优选在棒杆菌属的微生物中进行。棒杆菌属内，优选基于如下种 类的菌株；有效棒杆菌（Corynebacterium e巧ciens),其中模式菌株保藏为DSM44549, 谷氨酸棒杆菌，其中模式菌株保藏为ATCC13032, W及产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes)，其中模式菌株保藏为ATCC6871。非常特别优选谷氨酸棒杆菌。
[0062] 谷氨酸棒杆菌种的一些成员在现有技术中也有其他名称。该包括例如菌株 ATCC13870,其被称为嗜己醜己酸棒杆菌（Corynebacterium acetoacido地ilum),菌株 DSM20137,其被称为百合棒杆菌（Corynebacterium Iilium)，菌株ATCC17965,其被称为 栖糖蜜棒杆菌（Corynebacterium melassecola),菌株ATCC14067,其被称为黄色短杆菌 炬revibacterium flavum),菌株 ATCC13869,其被称为乳发酵短杆菌炬revibacterium lactofermentum),和菌株ATCC14020,其被称为扩展短杆菌炬revibacterium divaricatum)。
[0063] 谷氨酸棒杆菌也使用表述"谷氨酸微球菌（Micrococcus glutamicus)"。有 效棒杆菌的一些成员在现有技术中也被称为嗜热产氨棒杆菌（Corynebacterium thermoaminogenes)，例如，菌株阳RM BP-1539。
[0064] 用于引入反馈抗性IPMS的措施的微生物或菌株（起始菌株）优选已经具有分 泌KIC或k亮氨酸至外周营养培养基并在其中累积的能力。对此步骤，在下文中也使用 术语"产生"。特别地，用于过表达措施的菌株具有在细胞内或营养培养基中在（《表示最 多）《120小时、《96小时、《48小时、《36小时、《24小时或者《12小时内累积（> 表示至少）>0. l〇g/l、〇. 25g/l、>0. 5g/l、> 1.0g/l、> 1.5g/l、>2. 0g/l、>4g/l 或者 >l〇g/l心亮氨酸或KIC的能力。起始菌株优选是通过诱变和筛选、重组DNA技术或两种 方法组合产生的菌株。
[0065] 本领域技术人员能够理解也可W获得适合本发明的措施的微生物，其中在野生菌 株中，例如在谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC 13032或者菌株ATCC 14067中，首先插入本发明 SEQ ID N0:5的多核巧酸，接着通过现有技术中描述的其他遗传措施引起所述微生物产生 期望的KIC或者心亮氨酸。
[0066] 该群细菌的菌株系统分类信息尤其可在Seiler (Journal of General Microbiology I 29, 1433-1477 (1983)). Kinoshita(1985, GIutamic Acid Bacteria, p. 115-142. In :Demain and Solomon(ed) , Biology of Industrial Microorganisms. "The Benjamin/Cummins Publishing Co. , London, UK), K泣mpfer 和 Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42,989-1005 (1996))、Liebl 等(International Journal of Systematic Bacteriology 41,255-260(1991))和 US5,250,434A 中找到。
[0067] 具有"ATCC"名称的菌株可从美国典型培养物保藏中也（Manassas, VA，USA)获得。 具有"DSM"名称的菌株可从德国微生物保藏中也值SMZ，Brunswick, Germany)获得。具有 "NRRL"名称的菌株可从美国北方农业研究所培养物保藏中也（ARS，Peoria, Illinois, U巧 获得。具有"阳RM"名称的菌株可从日本高级工业科学技术研究所（AIST Ts址Uba Central 6, l-1-lHigashi, Tsukuba 扣araki, Japan)获得。
[0068] 分泌或产生KIC的菌株基于例如：
[0069] 谷氨酸棒杆菌，菌株ATCC13032，
[0070] 黄色短杆菌，菌株ATCC 14067和
[0071] 乳发酵短杆菌，菌株ATCC 13869。
[0072] 另外，与产生丽异己酸联合，优选W下核巧酸序列的一个或多个基因（过）表达， 所述核巧酸序列编码生物合成丽异己酸的酶，选自：
[0073] a)编码己醜乳酸合酶（IlvBN，EC No. :4. 1. 3. 18)亚基的多核巧酸（ilvB基因和 ilvN基因）
[0074] b)编码异构还原酶（IlvC，EC No. : 1. 1. 1. 86)的多核巧酸（ilvC基因）
[00巧]C)编码二轻基酸脱水酶（Ilv化EC No. :4. 2. 1. 9)的多核巧酸（ilvD基因）
[007引 d)编码转氨酶（IIvE, EC No. :2.6. 1.蝴的多核巧酸（iIvE基因）
[0077] e)编码异丙基苹果酸合成酶（LeuA，EC No. : 2. 3. 3.蝴的多核巧酸（IeuA基因）
[0078] f)编码异丙基苹果酸脱氨酶（LeuB，EC No. : 1. 1. 1. 85)的多核巧酸QeuB基因）
[0079] g)编码异丙基苹果酸异构酶（LeuC，EC No. : 4. 2. 1. 33)大亚基的多核巧酸QeuC 基因）
[0080] h)编码异丙基苹果酸异构酶（Le加，EC No. :4. 2. I. 3?小亚基的多核巧酸QeuD 基因）
[0081] 其中特别优选用于a -丽异己酸化IC)的ilvBN、ilvC、ilvD、leuA、leuB、IeuC和 IeuD基因。
[0082] 本发明提供一种产生1(1(：或心亮氨酸的微生物，其中所述微生物由于使用本发明 SEQ ID NO: 5的多核巧酸而具有反馈抗性a-异丙基苹果酸合酶。
[0083] 用于生产精细化学品KIC或k亮氨酸的发酵方法包括如下步骤：
[0084] a)在培养基中发酵权利要求7至12任一项的微生物的一种，
[0085] b)在培养基中累积KIC或心亮氨酸，其中获得发酵液。在该种情况下，优选从所 述含有精细化学品的发酵液中获得所述精细化学品或含有液体或固体精细化学品的产物。
[0086] 如关于丽异己酸生产的实施例4所示或关于L亮氨酸生产的实施例5所示，使用 本发明的方法比各个起始菌株在产量上有显著增加（实施例4，KIC ;0. 027g/g VS. 0. 012g/ g ;实施例 5,亮氨酸；0. 041g/g vs. 0. 002g/g)。
[0087] 此外，特别优选本发明的微生物生产KIC或心亮氨酸，更优选分泌KIC或 k亮氨酸至培养基中。为了产生期望的有机化合物，产生的微生物可W连续培养（例 如W005/021772中所述）或者W分批方法（分批培养或分批方法）或补料分批或重复 补料分批方法不连续培养。在Chmiel的教科书炬ioprozesstechrdk 1. EinfiArung in die Biove;rf址renstechnik[生物技术进展 1.生物工程介绍](Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))或 Storhas 的教科书（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[生物反应器及外围设备](Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)) 中有已知培养方法常规类型的总结。
[0088] 要使用的培养培养基或发酵培养基必须恰当满足各菌株的需求。在美国细菌学会 的手册"Manual of Methods for General Bacteriology" (Washington D. C., USA, 1981)中 包含各种微生物的培养基的描述。术语培养培养基和发酵培养基或培养基是相互可换的。
[0089] 至于碳源，可使用糖和碳水化合物，例如葡萄糖、藏糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖浆、 来自甜菜糖或甘藏加工的含藏糖的溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素，油类和脂肪，例如豆 油、葵花油、花生油和挪子脂，脂肪酸，例如踪搁酸、硬脂酸和亚油酸，醇类，例如甘油、甲醇 和己醇，W及有机酸类，例如己酸或乳酸。
[0090] 对于氮源，可使用有机氮化合物，例如蛋白腺、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉 米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，例如硫酸馈、氯化馈、磯酸馈、碳酸馈和硝酸馈。氮源可 单独或作为混合物使用。
[0091] 对于磯源，可使用磯酸、磯酸二氨钟或磯酸氨二钟或相应的含轴盐。
[0092] 此外，培养基必须含有盐，例如W金属如轴、钟、镇、巧和铁的氯化物或硫酸盐形 式，例如硫酸镇或硫酸铁，其是生长必须的。最后，除了上述物质外，可使用生长必需物质例 如氨基酸，例如激素和维生素，例如硫胺素、生物素或泛酸。
[0093] 所述原料可W W单批形式添加到培养物中，或在培养过程中W合适的形式供给。
[0094] W合适的方式使用碱性化合物例如氨氧化轴、氨氧化钟、氨或氨水，或酸性化合 物，例如磯酸或硫酸，控制培养物的抑。所述抑通常调节到6. 0至8. 5,优选6. 5至8。为 了控制泡沫形成，可使用止泡剂，例如脂肪酸的聚甘油醋。为了保持质粒的稳定性，可向培 养基中加入合适的选择性作用物质，例如抗生素。优选在需氧条件下进行发酵。为了维持 所述需氧条件，将氧气或含氧气体混合物例如空气引入培养物。也可W使用富含过氧化氨 的液体。任选地，所述发酵在超大气压下进行，例如在0. 03至0. 2MI^超大气压下。培养的 温度通常为2(TC至45C，优选25C至4(TC，特别优选3(TC至37C。在分批或补料分批方 法的情况下，优选培养持续直到形成足够用于测量获得的希望的有机化合物的量。通常在 10小时至160小时内达到该个目标。在连续方法中，培养时间可能更长。由于所述微生物 的活性，所述精细化学品在发酵培养基和/或微生物细胞内出现富集（累积）。
[0095] 可在专利文献 US 5, 770, 409、US 5, 990, 350、US 5, 275, 940、W02007/012078、US 5, 827, 698、WO 2009/043803、US 5, 756, 345 或 US 7, 138, 266 中找到合适的发酵培养基的 例子；任选地，针对所用菌株的需要进行适当修改。
[0096] 通过离子交换层析优选阳离子交换层析分离心氨基酸，随后使用巧H丽柱后 衍生（如 Spackman 等所述（Anal}ftical Qiemistry 30:1190-1206(1958))所述），可 W分析k氨基酸W确定其在发酵过程中的一个或多个时间点的浓度。除了巧H丽，正 邻苯二酵也可用于柱后衍生。可在 Pickering(LC*GC(Magazine of Qiromatographic Science) 7化)，484-487 (1989))找到离子交换层析的综述文章。
[0097] 也可W进行柱前衍生，例如使用正邻苯二酵或异硫氯酸苯醋，并通过反相层析 (R巧优选高效液相层析（H化C)的形式分离所得到的氨基酸衍生物。例如，在Lin化Oth等 (Anal}ftical Qiemistry 51:11671174(1979))中描述了该种方法。
[0098] 进行光度（吸收，英光）检测。
[0099] 可尤其在Lottspeich和Zorbas的教科书"Bioanal}ft;Lk"[生物分析] by (Spektrum Akademischer Verlag, Heide化erg, Germany 1998)中找到关于氨基酸分析 的综述。
[0100] 通过离子交换层析优选阳离子交换层析，在化形式的例如使用0. 025N硫酸賴化 的苯己帰二己帰苯聚合物上分离丽酸和其他分泌产物，随后在215nm处（或者也可在230 或275nm)UV检测，可W分析a -丽酸例如KIC W确定其在发酵过程中的一个或多个时间点 的浓度。优选地，可使用REZEXRFQ-化St化Uit化柱（Phenomenex);分离相的其他供应 商（例如BioRad的Aminex)也可W。在供应商的相应使用实例中描述了类似分离。
[0101] 基于用存在本发明的启动子变体的微生物的方法或发酵方法，在选自浓度（每体 积形成的化合物）、产量（每碳源消耗形成的化合物）、形成（每体积和时间形成的化合物） 和特定形成（每细胞干重量或生物干重量和时间形成的化合物或每细胞蛋白质和时间形 成的化合物）或其他方法参数和其组合的一个或多个参数方面，本发明的方法或发酵方法 的效能提高至少0. 5%、至少1 %、至少1. 5%或至少2%。
[0102] 由于发酵的措施，获得含有期望的精细化学品优选氨基酸或有机酸的发酵液。
[0103] 接着，提供或生产或获得含有所述精细化学品的液体或固体形式的产物。
[0104] 在一个优选实施方案中，发酵液是指发酵培养基或营养培养基，其中微生物在一 定温度下培养一定时间。在发酵中使用的发酵培养基或培养基，包含确保产生期望的化合 物，通常确保生长和/或生存能力的所有物质或成分。
[0105] 当发酵完成，得到的发酵液相应包含
[0106] a)源于所述微生物的细胞生长的微生物的生物量（细胞物质），
[0107] b)发酵过程中形成的期望的精细化学品，
[010引 C)发酵过程中可能形成的有机副产物，和
[0109] d)没有被发酵消耗的使用的发酵培养基或原材料的成分，例如维生素，例如生物 素，或盐，例如硫酸镇。
[0110] 有机副产物包括由在发酵中使用的微生物生成并可能被分泌的除了各种期望的 化合物之外的物质。
[0111] 从培养瓶或发酵容器收回发酵液，任选地收集发酵液，并用于提供含有所述精细 化学品的液体或固体形式的产物。因此也使用表述"获得含有所述精细化学品的产物"。在 最简单的情况下，从发酵容器收回的含有所述精细化学品的发酵液是获得的产物本身。
[0112] 通过选自如下的一种或多种措施实现期望的有机化合物从发酵液中浓缩或纯 化：
[0113] a)部分（〉0%至<80%)至完全（100%)或实质上完全（>80%、>90%、>95%、 > 96%、> 97%、> 98%、> 99% )去除水份，
[0114] b)部分（〉0%至<80%)至完全（100%)或实质上完全（>80%、>90%、>95%、 > 96%、> 97%、> 98%、> 99% )去除生物量，其中所述生物量任选地在去除前被失活，
[0115] C)部分（〉0%至<80%)至完全（100%)或实质上完全（>80%、>90%、>95%、 > 96 %、> 97 %、> 98 %、> 99 %、> 99. 3 %、> 99. 7 % )去除在发酵过程中形成的有机副 产物，和
[0116] d)部分（〉0%至<80%)至完全（100%)或实质上完全（>80%、>90%、>95%、 > 96%、> 97%、> 98%、> 99%、> 99. 3%、> 99. 7% )去除未被发酵消耗的所用发酵培 养基或原材料的成分。
[0117] W该种方式，分离具有期望含量的化合物的产物。
[0118] 部分（〉0%至<80% )至完全（100% )或实质上完全80%至<100% )去除水 份（措施a))也称为干燥。
[0119] 在所述方法的一种变形中，通过完全或实质上完全去除水、生物量、有机副产物和 所用发酵培养基的未消耗成分，成功获得纯的（按重量计> 80%，按重量计> 90% )或高 纯度（按重量计> 95%，按重量计> 97%，按重量计> 99% )产物形式的期望的有机化合 物，优选k氨基酸。对于a)、b)、c)或d)的措施，现有技术中有大量的技术指南。
[0120] 在使用棒杆菌属细菌生产KIC或k亮氨酸的方法的情况中，优选获得不含发酵液 任何成分的产物的方法。特别地，该些产物用于人类医学、制药产业，和食品产业。
[0121] 本发明的方法用于发酵生产KIC或k亮氨酸。
[0122] 本发明最后涉及本发明的微生物用于发酵生产KIC或k亮氨酸的应用。
[0123] 下文将参考示例性实施方案更详细描述本发明。
[0124] 实施例1
[01巧]产生置换载体地18mobsacB_leuA_Y553D
[0126]在 GeneArt (Life Technologies GmbH, Darmsta化,Germany)合成 812bp 长的置换 构建体（见SEQ ID N0:7)。该片段包含野生型IeuA基因的最后594bp(C末端）至ATCC13032 的IeuA基因下游区域20化P，还有用于克隆进地ISmobsacB载体所需的SphI和BamHI两个 切割位点。在该置换片段195位，IeuA基因3'末端上游，碱基T突变为碱基G-该将野生型 密码子TAC (编码氨基酸Y，酪氨酸）变为密码子GAC (编码氨基酸D，天冬醜胺）。在GeneArt 公司将所述片段克隆进入地ISmobsacB载体。GeneArt交付所得置换载体地18mobsacB_ leuA_Y553D，并用于产生实施例菌株（见实施例3)。
[0127] 实施例2
[0128] 产生谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032_Di IvE
[0129] 通过电穿孔用质粒地19mobsacB_DilvE转化谷氨酸棒杆菌菌株 ATCC13032 (Marienhagen et al., Journal of Bacteriology 187:7639 - 7646 (200巧）。根 据 Haynes 等的方法（FEMS Microbiology Letters 61:329-3:34(1989))进行电穿孔。
[0130] 质粒地ISmobsacB或地18mobsacB_DilvE不能在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中独立 复制，仅在其被整合进染色体（作为重组事件的结果）后才能保留在细胞内。通过将电穿孔 批次在添加了 ISmg^卡那霉素的LB琼脂上铺板，筛选具有整合了地18mobsacB_DilvE的 克隆（Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring 11油〇1'，爬巧￥〇'1^，1989)。生长的克隆在含有251113八卡那霉素的1^8琼脂平板上划线，并在 33C赔育16小时。为了筛选其中的质粒已被切除的突变体（作为第二次重组事件的结果）， 克隆在LB液体培养基（+5g^己酸钟）中非选择性地培养20小时，接着在含有10%藏糖的 LB琼脂上划线，并赔育24小时。
[0131] 除了卡那霉素抗性基因外，与起始质粒地ISmobsacB -样，质粒地18mobsacB_ DilvE还含有编码来自枯草芽抱杆菌炬acillus subtilis)的果聚糖藏糖酶sacB基因的 拷贝。藏糖诱导表达导致形成果聚糖藏糖酶，其催化果聚糖的合成，果聚糖对谷氨酸棒杆 菌是毒性产物。因此在有藏糖的LB琼脂（含有5g/l己酸钟）上，只有那些其中整合的 地ISmobsacB被再次切除了的克隆生长。在切除中，与质粒一起，ilvE的完整的染色体拷贝 或者内部带有缺失ilvE的不完整拷贝可被切除。
[0132] 测试了大约40至50个菌落的表型"在有藏糖时生长"和"在有卡那霉素时不生 长"。为了检测缺失的ilvE等位基因保留在了染色体中，按照Innis等人的标准PCR方法 (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)使用聚 合酶链式反应研究了大约20个具有表型"在有藏糖时生长"和"在有卡那霉素时不生长"的 菌落。在该种情况中，从菌落的染色体DNA扩增一段DNA片段，其携带缺失的ilvE区域的 周围区域。选择如下引物寡核巧酸用于PCR ;
[0133] ilvE-Xbal-fw 5' -gctctagagccaagcctagccattcctcaa-3'
[0134] ilvE-Xbal-rev 5' -gctctagagccagccactgcattctcctta-3'
[013引所述引物能够在具有完整ilvE基因座的对照克隆中扩增大约I. 4化大小的DNA 片段。在具有缺失的ar评RGH基因座的克隆中扩增大约0. 6化大小的DNA片段。
[0136] 在0. 8%强度琼脂糖凝胶中电泳鉴定扩增的DNA片段。从而能够显示菌株在染色 体上携带缺失的ilvE等位基因。所述菌株命名为谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DilvE，在生产 测试中（见实施例4)研究其产生异己酸的能力。
[0137] 实施例3
[0138] 产生谷氨酸棒杆菌ATCC13032_Di 1 vE_leuAY553D和谷氨酸棒杆菌ATCC13032_ leuAY553D 菌株
[0139] 用实施例1的质粒地18mobsacB_leuA_Y553D电穿孔转化实施例2的谷氨酸棒杆 菌菌株ATCC13032和谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032_DilvE。实施例2中详细描述了该方法。
[0140] 通过对多个具有表型"在有藏糖时生长"和"在有卡那霉素时不生长"的候选克隆 测序，证实密码子GAC (在553位编码天冬醜胺）置换了野生型密码子TAC (在553位编码 酪氨酸）。为此目的，首先制备具有如下引物的IeuA-IPCR片段（767bp长）：
[0141] leuAl(5' -GATCTATCTAGATTGAGGGCCTTGGGCATACG-3')和
[0142] leuA-2 巧--GATCTAGGATCCGCGACTACGAGGCTGTTATC-3')，用引物
[0143] leuA-3 巧'-GATCTATCTAGAAAGCTTAAACGCCGCCAGCC-3')测序。
[0144] 选择阳性候选克隆并在随后生产性能测验（实施例4和5)中测定。
[0145] 实施例4
[0146] 用谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DilvE和谷氨酸棒杆菌 ATCC13032_DilvE_leuAY553D 生产丽异己酸
[0147] 为了研究其产生丽异己酸的能力，每种情况下，在IOml测试培养基中于33C预培 养谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DilvE和谷氨酸棒杆菌ATCC13032_ DilvE_leuAY553D，1化。对于产生测试，用所得预培养物接种每IOml测试培养基，使得 起始0D600(600nm处光密度）为0. 1。每个克隆在H个摇瓶中测定，该样每个菌株由 总共九个摇瓶代表。测试培养基与Kei化auer等人描述的C抽II培养基（Journal Of Bacteriology (1993) 175:5593-5603)相同，但是每种情况中额外含有200mg/l氨基酸k亮 氨酸、k额氨酸和k异亮氨酸。为了简单起见，所述测试培养基的构成总结于如下表1。
[0148] 表1 ;在每种情况中添加了 200mg^氨基酸k亮氨酸a-额氨酸和k异亮氨酸的 C抽II培养基的构成
[0149]
【权利要求】
1. 分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID N0:2的氨 基酸序列至少彡90%、彡92%、彡94%、彡96%、彡97%、彡98%、彡99%或100%、优选 彡97%、特别优选彡98%、非常特别地优选彡99%、极其优选100%相同，其中SEQ ID NO: 2 在553位或在所述氨基酸序列的相应位置具有除L-酪氨酸以外的蛋白原氨基酸。
2. 权利要求1的核苷酸序列，其中其编码的所述氨基酸序列在553位或相应位置具有 选自谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和天 冬酰胺的氨基酸，特别优选选自谷氨酸和天冬氨酸。
3. 权利要求2的核苷酸序列，其中其编码的所述氨基酸序列在第553位或相应位置具 有L-天冬氨酸。
4. 权利要求2或3的核苷酸序列，其在1657位或相应位置具有鸟嘌呤，如SEQ ID N0:5 所示。
5. 载体，其包含权利要求1-3任一项的核苷酸序列，并且任选地适合于在棒杆菌属的 微生物中复制。
6. 多肽，其包含权利要求1-5任一项的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
7. 棒杆菌属微生物，其包含权利要求1-6任一项的核苷酸序列或多肽或权利要求5的 载体。
8. 权利要求7的微生物，其中权利要求1-5任一项的核苷酸序列以过表达形式存在。
9. 权利要求7或8的微生物，特征在于所述核苷酸序列整合进染色体。
10. 权利要求7-9任一项的微生物，特征在于其是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)〇
11. 权利要求7-10任一项的微生物，特征在于所述微生物具有产生精细化学品的能 力。
12. 权利要求11的微生物，特征在于所述精细化学品是L-亮氨酸或KIC。
13. 产生KIC或L-亮氨酸的发酵方法，包括如下步骤： a) 在培养基中发酵权利要求7-12任一项的微生物的一种， b) 在所述培养基中累积所述KIC或L-亮氨酸，其中获得发酵液。
14. 权利要求13的方法，特征在于其是选自分批方法、补料分批方法、重复补料分批方 法和连续方法的方法。
15. 权利要求13或14的方法，特征在于从所述含有精细化学品的发酵液获得所述精细 化学品或含有液体或固体精细化学品的产物。
16. 权利要求7-12任一项的微生物发酵产生L-亮氨酸或KIC的应用。
【文档编号】C12P13/06GK104302765SQ201380021912
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年4月12日 优先权日:2012年4月27日
【发明者】R·格斯特迈尔, I·维格拉贝 申请人:赢创工业集团股份有限公司