专利名称：延胡索酸酶转化底物生产l-苹果酸的技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用延胡索酸酶转化底物生产L-苹果酸(下称LMA)的技术。
L-苹果酸主要应用于食品工业，它是一种优良的酸味剂和保鲜剂，在各种果子酒，果子露、乳酸菌发酵饮料、人造奶油中添加LMA可保持天然果汁的风味。LMA由于其特殊的酸味特点(酸味刺激较为缓慢，保留时间较长)越来越为许多消费者所偏爱，近年来在食品工业上的应用有逐渐取代柠檬酸的趋势。LMA直接参与人体的新陈代谢，可用于治疗贫血、肝功能不全和肝衰竭等疾病辅助剂，在医药工业上有重要的应用价值。此外，LMA在印染工业和建筑业上也有其特殊用途。因此，当前国际市场上对LMA的需求量逐渐地增加。
早在1921年，Yuill就报道过，在培养黄曲霉菌时，有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生；1951年，Kitaharo等报道了核盘菌的苹果酸发酵试验，1953年，Goodin报道了短密青霉具有产生苹果酸的能力；日本学者从50年代末起，对苹果酸发酵进行了大力研究，阿部重雄等研究的发酵法生产苹果酸最高浓度达50g/l。目前，苹果酸的生产方法主要有以下几种①马来酸或延胡索酸通过水合反应的化学合成法；②以延胡索酸为原料的酶转化法；③直接发酵法(包括混合发酵和一步发酵技术)和固定化法。但是从相关资料检索表明目前LMA采用固定化酶法和发酵法，其中(1)固定化法不足之处LMA生产之前先进行细胞培养、过滤或离心、洗涤、细胞破碎，获得延胡索酸酶，然后再进行包埋等，工艺操作程序繁杂。而且由于延胡索酸酶离开生物体又易于变性失活，造成转化不彻底，残余底物量大，易于超标，产品出口受到限制。所以固定化技术对环境条件要求较高，成本居高不下，影响工业化生产；(2)发酵技术中的混合发酵法劣势生产LMA时采用两个菌株混合发酵，因为各菌株要求的营养和培养条件不同而使生长和合成代谢不易控制，致使转化率和LMA产量均不高，最终也难以实现大规模工业化生产；(3)一步发酵法的缺点是在培养基中接入菌种的同时加入底物(延胡索酸)进行共同发酵，由于菌体生长、延胡索酸酶合成及底物转化为LMA三个阶段的生物学过程各自都需要最适的营养和培养条件，因为在一个培养液中同时发酵和转化而得不到满足和难以控制，造成LMA合成水平低(8.5％)，转化率不高(88％)、生产周期长(90h)、成本高，限制工业化生产。(4)目前国内外也见到纯细胞转化延胡索酸为LMA的报导，但该法不足之处发酵结束后，需将发酵液离心或过滤、细胞洗涤、重新悬浮、再与延胡索盐溶液混合，调节pH，转化操作工艺繁琐，转化条件不成熟，因此转化率低(90.8％)、LMA合成水平低(10.96％)、发酵周期长(96h)、成本仍然居高不下。
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供高效转化底物为LMA的新技术。
本发明通过以下技术方案实现首先将延胡索酸溶于NH4OH溶液中，制备成延胡索酸铵溶液(底物)；将霉菌接入培养基后，进行培养、繁殖，合成延胡索酸酶，当发酵液菌体内酶活达到120-200u/100ml时，将不经离心、洗涤，重悬浮和过滤的发酵液与底物一一延胡索酸铵溶液按1∶0.5-1.2直接混合，调节pH7.2-8.0，控制搅拌转速60r/min，保持温度30℃，经20h转化即完成LMA的合成。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
附
图1中，首先将延胡索酸溶于NH4OH溶液中，制成延胡索酸铵溶液(底物)；其次利用常规的培养基培养，培养菌种种子，然后移入大罐进行发酵培养，当发酵液菌体内酶活达到产酶高峰期后(120-200u/100ml)，将发酵液与延胡索酸铵溶液按1∶0.5-1.2混合，在pH7.2-8.0、搅拌转速60r/min、温度30℃的条件下进行混合转化，即完成LMA的合成。
实施例1
首先取30公斤的延胡索酸溶于30立升40％NH4OH溶液中，制成延胡索酸铵溶液；培养菌种种子，然后移入大罐进行发酵培养，当发酵液菌体酶活达到120u/100ml时，将发酵液与底物——延胡索酸铵溶液混合，混合比例为1∶0.5，调节pH8.0，搅拌转速60r/min，边加边搅拌，温度保持30℃，酶对底物作用时间20h，即完成LMA的合成。
实施例2首先取30公斤的延胡索酸溶于30立升50％NH4OH溶液中，制成延胡索酸铵溶液；培养菌种种子，然后移入大罐进行发酵培养，当发酵液酶活达到140u/100ml时，将发酵液与底物——延胡索酸铵溶液混合，混合比例为1∶0.8，调pH7.5，搅拌转速60r/min，边加边搅拌，温度保持30℃，酶对底物作用时间20h，即完成LMA的合成。
实施例3首先取30公斤的延胡索酸溶于30立升60％NH4OH溶液中，制成延胡索酸铵溶液；培养菌种种子，然后移入大罐进行发酵培养，当发酵液酶活达到200u/100ml，将发酵液与底物——延胡索酸铵溶液混合，混合比例为1∶1.2，调pH7.2，搅拌转速60r/min，边加边搅拌，温度保持30℃，酶对底物作用时间20h，即完成LMA的合成。
本发明主要优点和效益(1)本发明是单菌发酵，培养方式采用菌种培养和底物转化分开进行，菌种生长和延胡索酸酶合成过程无底物的干扰，使延胡索酸酶大量合成(增加2-3倍)，加入底物的数量可以根据产酶量由旧工艺10％增加到25-33％，由于满足各自生物学阶段的最适条件，发酵周期由原来的90h缩短至35h。(2)转化技术发酵液(含菌体酶)与底物溶液直接混合，免去纯细胞转化法中的离心、洗涤、细胞重新悬浮或细胞包埋等繁琐工艺，操作简便，工艺简单，耗能少，周转率高。(3)酶对底物转化过程可以在最优化条件下进行，没有其他生物学反应的干扰，转化率高，由旧工艺的88％提高到100-106％，LMA产量可达30％以上。(4)由于转化彻底，残留延胡索酸少、产品质量符合出口标准。
权利要求
1.一种利用延胡索酸酶转化底物生产L-苹果酸的技术，其特征在于首先将延胡索酸溶于NH4OH溶液中制备成延胡索酸盐溶液，按1∶0.5-1.2的比例直接与含有足够延胡索酸酶的发酵液混合转化，制备L-苹果酸。
2.根据权利要求1所述的生产技术，其特征在于发酵液中菌体细胞内含延胡索酸酶为120-200u/100ml。
3.根据权利要求1所述的生产技术，其特征在于发酵液与延胡索酸盐溶液混合前不经离心、洗涤，重悬浮和过滤，混合时边加边搅拌，控制搅拌转速60r/min，调节pH至7.2-8.0，温度保持在30℃，转化时间20h。
全文摘要
本发明涉及利用延胡索酸酶转化底物生产L－苹果酸(下称LMA)的技术。本发明将延胡索酸溶于浓度为40－60％NH
文档编号C12P7/40GK1523115SQ0315922
公开日2004年8月25日 申请日期2003年9月4日 优先权日2003年9月4日
发明者施巧琴, 吴松刚, 周晓兰, 谢必峰, 黄建忠 申请人:福建师范大学