专利名称：一种快速检测食品中致病菌的方法
技术领域：
本发明涉及食品安全领域，具体地涉及一种能够快速检测食品中致病菌的检测方法。
背景技术：
致病菌是影响食品安全的重要生物因素，目前已经受到消费者和工业生产的广泛关注。和传统的基于培养的方法相比，PCR是检测生命物质的里程碑式发现。PCR技术可以在很短时间内将几个甚至一个目标序列扩增到几百万个拷贝。这样，对于致病菌检测提供了一种可靠、快速、特异的检测方法，理论上说只要存在一个致病菌的目标序列，PCR方法就可以检测出。然而，当把PCR应用于食品样品检测时(比如牛奶)，脂肪、蛋白质和其他的食品成分会强烈的抑制PCR反应。虽然PCR反应具有极强的扩增能力，但是它对于抑制物质非常的敏感。因此，为了有效的除去或者减少抑制物，在PCR之前对食品样品进行预处理是必不可少的。通常增菌培养和分离浓缩是常常采用的方法。对于前者，检测时间大大提高了，因此，后者对于快速检测食品中的致病菌具有很大的潜力。目前的比较优异的前处理方法是磁性分离技术，其中免疫磁性分离技术研究较多。中国专利 201210035468.5,201110143730.3,201210308227.3,201110029946.7、201010550114.5中都是应用免疫磁珠进行分离。然而，致病菌是非常复杂的抗原物质，优质的适合应用的抗体难于制备，有时可能会对于同一种属的一些致病菌不能结合，有时又可能和其他种属致病菌交叉反应。而且从食品样品中分离出致病菌分离率并不高，在此基础上还要提取基因组DNA，进一步增加了损耗。此外，抗体制备困难、成本高，以及在储存和运输过程中易于变性。于是研究者开始试图用其他的生物分子来代替抗体进行致病菌分离，比如IgG、万古霉素和D-甘 露糖。然而，迄今为止这些方法尚不能应用于实际食品样品检测当中。作为另一种选择，一些研究者试图直接用磁性核酸探针从食品样品中分离和浓缩致病菌DNA而并非致病菌本身，但是也存在一些问题，比如，一种捕获磁性探针只能针对一种致病菌，不能同时检测多种致病菌，成本高等。研究一种可以磁性分离食品中不同致病菌的基因组DNA，而且可以同时分离多种致病菌的基因组DNA，将磁珠与捕获物直接用于PCR检测，将使得食品中致病菌检测更加简便、快速、广泛且成本低廉，对于食品安全的检测是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、快速、成本低廉、应用广泛的基于非标记的氨基化纳米磁珠捕获痕量基因组DNA结合PCR技术快速检测食品中致病菌的检测方法。主要包括以下步骤:(I)氨基磁珠的制备
a)制备Fe3O4磁性纳米粒子；b)娃包被Fe3O4磁性纳米粒子； c)去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性纳米粒子，得硅包磁珠；d)氨基化硅包磁珠，得氨基磁珠；(2)待检样品制备将预处理后的待检食品样品离心，收集沉淀，将沉淀复溶于缓冲溶液中，加入蛋白酶、表面活性剂以及溶菌酶孵育，后用沸水浴并用酚氯仿抽提得待检样品；(3)将氨基磁珠与待检样品混合，恒温振荡，磁性分离后洗涤，得吸附有致病菌DNA的氨基磁珠；(4)将吸附有致病菌DNA的氨基磁珠加入PCR体系中进行PCR检测。其中所述步骤(I)氨基磁珠的制备中，步骤a)制备Fe3O4磁性纳米粒子所采用的方法为，用共沉淀法将二价铁化合物与三价铁化合物在氨水的催化下共沉淀生成水溶性的Fe3O4磁性纳米粒子；此步骤中的磁性纳米粒子在实际应用中并不仅限于Fe3O4磁性纳米粒子，之所以选用，是因为相比而言共沉淀法制备的Fe3O4磁性纳米粒子条件温和、价格低廉、绿色环保，而且磁性能也完全可以应用于生物分离应用。步骤b)硅包被Fe3O4磁性纳米粒子所采用的方法为，
由表面活性剂、油相、水相、助剂配制反相微乳液体系，以氨水为催化剂水解正硅酸乙酯制成硅包被的Fe3O4磁性纳米粒子；所述反相微乳液体系的各组分配比为，表面活性剂:油相:水相:助剂体积比为大约为4:16:1:4，加入反相微乳液体系中的Fe3O4磁性纳米粒子的量(w/v)为0.1-0.4%，单位为g/ml。所述表面活性剂优选为曲拉通100，所述油相优选为环己烷，所述水相为去离子水，所述助剂优选为正己醇。或者用Stdber法[W.Siober,A.Fink, E.Bohn.Controlled growth of monodisperse silica spheres in the microsizerange.Journal of Colloid and Interface Science, 1968，26，62-69.]在乙醇/水溶液中用氨水催化正硅酸乙酯制成硅包被的Fe3O4磁性纳米粒子；这两种方法都可以有效的将正硅酸乙酯水解，在Fe3O4磁性纳米粒子的表面包上一层二氧化硅，二氧化硅因为其化学惰性对后续的PCR影响较小，而且二氧化硅层可以非常容易进行氨基化改性。步骤c)去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性纳米粒子所采用的方法为，用盐酸进行浸泡，然后洗涤去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性纳米粒子；或者重复一次b)步骤，进行二次包裹，确保没有裸露的Fe3O4磁性纳米粒子存在；此步骤是为了除去裸露存在的Fe3O4,实验证明，Fe3O4对PCR反应具有强烈的抑制作用。可以选择其中一种方法，也可以两种方法都采用，以达到去除裸露的Fe3O4磁性纳米粒子的目的。步骤d)氨基化硅包磁珠所采用的方法为，用氨基化硅烷偶联剂对硅包磁珠进行修饰，使其表面修饰氨基；或者在所述二次包裹的同时加入氨基化硅烷偶联剂进行氨基化修饰；硅包磁珠经氨基化修饰以后即得氨基磁珠。其中所述步骤(2)待检样品制备中，将预处理后的食品样品进行离心处理，收集沉淀，其中可能含有菌体，将沉淀复溶于一定pH值以及离子浓度的缓冲溶液中，同时添加蛋白酶以及溶菌酶孵育处理，并同时加入表面活性剂，为了充分释放致病菌核酸以及去除蛋白质等杂质干扰，同时进行沸水浴以及酚氯仿抽提，得到待检样品；所述表面活性剂选自吐温20、曲拉通100和十二烷基磺酸钠中的一种或多种，所述PH为7-10，所述缓冲溶液为TE缓冲溶液。蛋白酶的作用一方面是水解食品中的蛋白质类PCR抑制物，另一方面也起到水解菌体的作用，尤其是对于革兰氏阴性菌。溶菌酶主要是针对革兰氏阳性菌的肽聚糖层，如果目标检测物中不含有革兰氏阳性菌，可以不采用。其中所应用的表面活性剂同样也起到两个作用，一方面可以使得蛋白质等PCR抑制物变性，另一方面也可使得基因组核酸充分分离释放。中性表面活性剂(如曲拉通100)的选择，以及缓冲溶液PH7-10等参数也至关重要，它会影响到氨基磁珠与基因组DNA的结合。将步骤(3)所述的吸附有致病菌DNA的氨基磁珠直接用于PCR反应体系，并没有进行洗脱，实验证明经过包被的氨基磁珠对于PCR反应基本没有影响，此外，同时也发现，食品处理物中的蛋白质等可以很好的包被磁珠，不进一步包被并不影响后续的PCR实验。磁性分离得到的磁珠与致病菌基因组DNA结合物既可以用于普通PCR、也可以用于多重PCR同时检测多种致病菌，此外，也可以用于荧光定量PCR进行定量检测。本发明的要点是:所制备的氨基化硅包磁珠必须确保其表面充分的包被二氧化硅，彻底避免表面暴露的Fe3O4磁性纳米粒子。食品的处理遵循的原则是尽量的释放其中致病菌的基因组DNA，并尽可能的去除蛋白质等PCR抑制物，此外，食品处理物与氨基磁珠混合的体系也严格需要一定的条件，在合适的PH值、温度等作用下才会达到较好的结合作用。磁珠与基因组DNA结合物直接用于PCR检测，无需洗脱处理。此发明可以快速、简单、灵敏、特异的检测食品中的某种或多种致病菌污染。具体方法包括以下几个步骤:(I)制备Fe3O4磁性纳米粒子，将二价铁化合物与三价铁化合物按照摩尔比1:2混合，所述二价铁化合物优选为FeSO4.7Η20，所述三价`铁化合物优选为FeCl3.6Η20，加入氨水至pH值为8-11，在通氮气的氛围下50°C -100°C加热，剧烈电动搅拌约30_60min。磁性分离，反复用无水乙醇与水洗涤数次，干燥。(2)硅包被Fe3O4磁性纳米粒子:由表面活性剂曲拉通100、油相环己烷、水相、助剂正己醇配制成反相微乳液体系，加入Fe3O4磁性纳米粒子，超声混合，加入正硅酸乙酯(TE0S),以氨水为催化剂水解正硅酸乙酯制成二氧化硅包被的Fe3O4磁性纳米粒子，优选地反相微乳液体系中表面活性剂:油相:水相:助剂体积比为4:16:1:4，加入反相微乳液体系中的Fe3O4磁性纳米粒子的质量为每50ml体系加入0.05-0.2g ;也可用St^ber法在乙醇/水溶液中用氨水催化正硅酸乙酯包硅。后者所得粒径一般比前者大。(3)去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性纳米粒子:用盐酸浸泡24h，优选盐酸浓度为0.l_3mol/L，然后洗涤去除杂质；或者也可以重复一次(2)步骤，进行二次包裹，确保没有裸露的Fe3O4磁性纳米粒子存在。可以单独采用其中一种方法，也可以两者都用。采用二次包被的方法得到的磁珠粒径将较大。(4)氨基化硅包磁珠:用氨基化硅烷偶联剂配置成1%_5%的甲苯溶液，加入硅包磁珠，在氮气氛围下加热到30°C-100°C，回流3h-12h，得氨基磁珠。或者也可以在二次包裹的同时加入一些氨基化硅烷偶联剂进行氨基化修饰。优选氨基化硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)。(5)待检样品制备:取生牛奶 10-25ml，3000-8000r/min 离心 20min，加入 450 μ ITE缓冲溶液(ΡΗ7-10，其中含表面活性剂、蛋白酶K、溶菌酶)，37°C孵育30_100min，沸水浴IOmin后迅速置于冰上冷却，然后加入250 μ I Tris-饱和酚，250 μ I氯仿/异戊醇混合液(24:1，V/V),6000-12000r/min 离心 5min，吸取上层清液。(6)向吸取的清液中加入20 μ g氨基磁珠(ASMNP)，30-80 V 1400r/min振荡30min,用TE缓冲溶液洗涤一次，收集沉淀到PCR管。(7)将收集到的吸附有致病菌DNA的氨基磁珠加入PCR体系中进行PCR检测。本发明以氨基化硅包磁珠为载体，将食品进行一定处理，可以直接用氨基硅包磁珠非特异的结合其中的致病菌基因组DNA，因为其没有菌株特异性，所以可以用于检测任何存在于牛奶中的致病菌，并且结合多重PCR可以同时检测多种致病菌。本发明的优点是:1、检测方法快速。2、检测结果灵敏度高。3、检测目标广泛。4、可以进行多种检测。5、检测成 本低廉。6、既可作半定量检测，又可做定量检测。
图1为原子力显微镜(AFM)观测到的氨基磁珠对提纯的沙门氏菌(Salmonella)基因组DNA吸附(b)、氨基磁珠对于牛奶样品中沙门氏菌基因组DNA吸附(c)以及氨基磁珠(a)。图2为氨基磁珠吸附人工污染牛奶样品中沙门氏菌基因组DNA后直接PCR的检测限。图3为氨基磁珠吸附人工污染牛奶样品中单增李斯特菌(L.monocytogenes)基因组DNA后直接PCR的检测限。图4为氨基磁珠吸附人工污染牛奶样品中沙门氏菌与单增李斯特基因组DNA后直接进行多重PCR的检测限。本发明实施例中所用试剂均可通过市售获得，所用沙门氏菌(Salmonella)和单增李斯特菌(L.monocytogenes)均购自广东省微生物菌种保藏中心(GIMCC)。
具体实施例方式以下结合附图通过实施例对本发明做进一步说明。实施例1:氨基磁珠吸附人工污染的牛奶中沙门氏菌基因组DNA结合PCR快速检测原奶中沙门氏菌Fe3O4磁性纳米粒子的制备=Fe3O4磁性纳米粒子通过共沉淀法制备。0.02molFeCl3.6H20和0.0lmol FeSO4.7H20溶解于150ml去离子水中，滴加氨水至pH值11，在氮气保护下加热到85°C，并不断的搅拌，加热持续时间为25min，然后冷却至室温。黑色沉淀物用乙醇和去离子水反复清洗，最后真空干燥。娃包Fe3O4磁性纳米粒子的制备:用反相微乳液法制备娃包Fe3O4磁性纳米粒子，将32.0ml曲拉通100,128.0ml环己烧，8.0ml去离子水，32.0ml正己醇，280mg Fe3O4磁性纳米粒子混合超声组成反相微乳液体系，加入2.0ml正硅酸乙酯(TE0S)，然后加入1.2ml氨水，室温下磁力搅拌反应24h,丙酮破乳。高速离心，乙醇多次洗漆,最后用0.lmol/L的盐酸溶液浸泡24h，最终洗涤干燥待用。氨基化修饰:3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)被用来进行氨基化修饰，从上述制备好的硅包Fe3O4磁性纳米粒子中称取200mg加入30ml体积分数为3%的APTES甲苯溶液中，先超声lOmin，然后氮气保护，90°C加热12h。用乙醇与去离子水反复洗涤，最后真空干燥。取用沙门氏菌(GMT1.022)人工梯度污染的生牛奶10ml，6000r/min离心20min，收集沉淀，加入450 μ I含0.5%曲拉通100的TE缓冲溶液，加入40 μ 120 μ g/ μ I的蛋白酶K，37°C孵育30min，沸水浴IOmin后迅速置于冰上冷却，然后加入250 μ I Tris-饱和酚，250 μ I的氯仿/异戊醇(24:1，V/V)混合液，12000r/min离心5min,吸取上层清液，加入20 yg ASMNP, 600C 1400r/min振荡30min，用TE缓冲溶液洗涤一次，收集沉淀到PCR管。检测沙门氏菌的引物通过Blast比对选定沙门氏菌特有序列，然后用Primer5设计，并用实验室内菌株进行了验证，上下游引物分别为AGCACAGGCGTTTATGGT与GGCGACTGGCTTCTTTAT。PCR 扩增体系为 25 μ 1，包含 Ix Taq buffer, 1.5mM MgCl2, 0.1mMdNTP，400nM引物和1.5U Taq DNA polymerase，最终用无菌水补足体积。PCR扩增沙门氏菌条件为94°C预变性5min;35个循环:95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸40s;最后72°C延伸8min。PCR产物用2.0%琼脂糖进行电泳，EB染色。经过梯度人工污染生牛奶检测证实(图2，从I到7泳道依次 为沙门氏菌污染量为8xl05cfu/ml、8xl04cfu/ml、8xl03cfu/ml、SxlO^fu/mUSxlO^fu/mUSxlO^fu/mUSxlO^cfu/ml 人工污染牛奶的样品的检测结果)，检测生牛奶中的沙门氏菌检测限可以到达8cfu/ml。此结果与目前报道的免疫磁珠分离结合PCR (IMS-PCR)检测致病菌污染基本一致，在灵敏度一致的基础上，此方法因为是非特异的，可以用于任何一种致病菌以及同时存在的多种致病菌污染，所以其优越性远远高于只能检测一种致病菌的IMS-PCR。实施例2:氨基磁珠吸附人工污染的原奶中单增李斯特基因组DNA结合PCR快速检测原奶中单增李斯特菌Fe3O4磁性纳米粒子的制备同实施例1。娃包Fe3O4磁性纳米粒子的制备:将25ml乙醇、6.5ml /K，以及Iml氨水混合,此为A液；将25ml乙醇与0.5ml正硅酸乙酯混合，并加入0.1g Fe3O4磁性纳米粒子，此为B液。将A液与B液混合，常温搅拌12h。乙醇与水分别多次洗涤，然后于lmol/L盐酸溶液中，浸泡 24h。氨基化修饰步骤同实施例1。取用单增李斯特菌(GM1.229)人工梯度污染的生牛奶10ml，6000r/min离心20min，加入450 μ I含0.5%曲拉通100的TE缓冲溶液，加入40 μ 140 μ g/ μ I的溶菌酶，37°C孵育30min，沸水浴IOmin后迅速置于冰上冷却，然后加入250 μ ITris-饱和酚，250 μ I的氯仿/异戊醇(24:1，V/V)混合液，12000g/min离心5min，吸取上层清液，加入20 μ gASMNP, 60°C，1400g/min振荡30min，用TE缓冲溶液洗涤一次，收集沉淀到PCR管。检测单增李斯特菌的引物通过Blast比对单增李斯特菌特有序列，然后对此序列用Primer5设计引物，并用实验室内菌株进行验证，上下游引物分别为GCAAGCCACTATCCAAACAC 与 GAGCAACCACTCATCAGCTT。PCR 扩增体系为 25 μ 1，包含 Ix Taqbuffer, 1.5mM MgCl2, 0.1mM dNTP, 400nM 引物和 1.5U Taq DNA polymerase,最终用无菌水补足体积。PCR扩增沙门氏菌条件为94°C预变性5min;35个循环:95°C变性30s，60 °C退火30s，72°C延伸40s;最后72°C延伸8min.PCR产物用2.0%琼脂糖进行电泳，EB染色。经过梯度人工污染生牛奶检测证实(图3，从I到8泳道依次为单增李斯特菌污染量为 2.6xl04cfu/ml, 2.6xl03cfu/ml, 2.6xl02cfu/ml, 1.3xl02cfu/ml, 2.6xl02cfu/ml, 26cfu/ml, 13cfu/ml, 2.6cfu/ml, 1.3cfu/ml人工污染牛奶的样品的检测结果),检测生牛奶中的单增李斯特菌检测限可以到达13cfu/ml。由此 可见，此方法不但适用于革兰氏阴性菌，同样也适用于革兰氏阳性菌，而且检测灵敏度基本相当。实施例3:氨基磁珠吸附人工污染的原奶中致病菌基因组DNA结合PCR快速检测原奶中沙门氏菌与单增李斯特菌Fe3O4纳米粒子的制备与硅包Fe3O4纳米粒子的制备和实施例1相同。对硅包Fe3O4纳米粒子进行二次包被:将25ml乙醇、6.5ml水，以及Iml氨水混合，此为A液；将25ml乙醇与0.5ml正硅酸乙酯混合，并加入0.1g经一次包被的硅包磁性纳米粒子，此为B液。将A液与B液混合，常温搅拌12h。氨基化修饰步骤同实施例1。 取用沙门氏菌和单增李斯特菌人工梯度污染的生牛奶IOml，6000r/min离心20min，加入450μ I含0.5%曲拉通100的TE缓冲溶液，加入40 μ 120 μ g/μ I的蛋白酶K、40 μ 140 μ g/μ I的溶菌酶，37°C孵育30min,沸水浴IOmin后迅速置于冰上冷却,然后加入250 μ I Tris-饱和酚，250 μ I 的氯仿 / 异戊醇(24:1，V/V)混合液，12000r/min 离心 5min，吸取上层清液，加入20 μ g ASMNP, 60°C 1400r/min振荡30min，用TE缓冲溶液洗涤一次，收集沉淀到PCR管。应用多重PCR同时检测沙门氏菌与单增李斯特菌，这两种菌引物分别为:上游引物ACCGCTGGTGAAACGACA，下游引物GCGACGGCAGTGCTTATT ;以及上游引物GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG，下游引物 CAAAGAAACCTTGGAITTGCGG，PCR 扩增体系均为 25 μ 1，包含 Ix Taq buffer, 1.5mM MgCl2, 0.1mM dNTP, 400nM 引物和 1.5U Taq DNA polymerase,最终用无菌水补足体积。PCR扩增条件为94°C预变性5min; 35个循环:95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸40s;最后72°C延伸8min。PCR产物用2.0%琼脂糖进行电泳，EB染色。经过梯度人工污染生牛奶检测证实(图4，I到10泳道分别为沙门氏菌、单增李斯特菌混合污染量为 3xl04cfu/ml、5xl04cfu/ml ；3xl03cfu/ml>5xl03cfu/ml ;3xl02cfu/ml、5xl02cfu/ml ；30cfu/ml>50cfu/ml ； 15cfu/ml>25cfu/ml ；3cfu/ml>5cfu/ml ；1.5cfu/ml>2.5cfu/ml ；
0.3cfu/ml、0.5cfu/ml ；0.15cfu/ml、0.25cfu/ml ；0cfu/ml>0cfu/ml,的人工污染牛奶的检测结果)，同时检测生牛奶中的沙门氏菌和单增李斯特菌检测限分别可以到达15cfu/ml和25cfu/ml。此结果证明，此方法不但能应用于检测任意一种致病菌，而且能够同时检测多种致病菌，这是以致病菌抗体为核心的IMS-PCR无法达到的。以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明 的保护范围之内。
权利要求
1.一种快速检测食品中致病菌的方法，包括以下步骤: (1)氨基磁珠的制备 a)制备Fe3O4磁性纳米粒子； b)娃包被Fe3O4磁性纳米粒子； c)去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性纳米粒子，得硅包磁珠； d)氨基化硅包磁珠，得氨基磁珠； (2)待检样品制备 将预处理后的待检食品样品离心，收集沉淀，将沉淀复溶于缓冲溶液中，加入表面活性齐U、蛋白酶和溶菌酶孵育，后用沸水浴并用酚氯仿抽提得待检样品； (3)将氨基磁珠与待检样品混合，恒温振荡，磁性分离后洗涤，得吸附有致病菌基因组DNA的氨基磁珠； (4)将吸附有致病菌基因组DNA的氨基磁珠加入PCR体系中进行PCR检测。
2.根据权利要求1所述的快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步骤(I)氨基磁珠的制备中， 步骤a)制备Fe3O4磁性纳米粒子所采用的方法为，用共沉淀法将二价铁化合物与三价铁化合物在氨水的催化下共沉淀生成水溶性的Fe3O4磁性纳米粒子； 步骤b)硅包被Fe3O4磁性纳米粒子所采用的方法为， 由表面活性剂、油相、水相、助剂配制反相微乳液体系，以氨水为催化剂水解正硅酸乙酯制成硅包被的Fe3O4磁性纳米粒子；或者 用St0ber法在乙醇/水溶液中用氨水催化正硅酸乙酯制成硅包被的Fe3O4磁性纳米粒子; 步骤c)去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性纳米粒子所采用的方法为， 用盐酸浸泡，然后洗涤去除未被硅包被的裸露Fe3O4磁性纳米粒子；或者 重复一次b)步骤，进行二次包裹，确保没有裸露的Fe3O4磁性纳米粒子存在； 步骤d)氨基化硅包磁珠所采用的方法为， 用氨基化硅烷偶联剂对硅包磁珠进行修饰，使其表面修饰氨基；或者在所述二次包裹的同时加入氨基化硅烷偶联剂进行氨基化修饰。
3.根据权利要求2所述的快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步骤(I)的步骤a)中，所述二价铁化合物为FeS04.7H20，所述三价铁化合物为FeCl3.6H20，二价铁化合物与三价铁化合物的摩尔比为1:2。
4.根据权利要求2所述的快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步骤(I)的步骤b)中，所述反相微乳液体系的各组分配比为:表面活性剂:油相:水相:助剂体积比大约为4:16:1:4，加入反相微乳液体系中的Fe3O4磁性纳米粒子的量(w/V)为 0.1-0.4%ο
5.根据权利要求2或4所述的快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述表面活性剂为曲拉通100，所述油相为环己烷，所述水相为去离子水，所述助剂为正己醇。
6.根据权利要求2所述的快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步骤(1)的步骤c)中，所述盐酸浓度为0.l_3mol/L，盐酸浸泡时间为15_30h。
7.根据权利要求2所述的快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步骤(I)的步骤d)中，氨基化硅包磁珠采用的方法为将氨基化硅烷偶联剂配置成体积分数为1%_5%的甲苯溶液，加入硅包磁珠，在氮气氛围下加热到30°C -100°C，回流3h-12h。
8.根据权利要求1、2或7所述的快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述的氨基化硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷。
9.根据权利要求1所述的快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于: 所述步骤(2)中，所述表面活性剂选自吐温20、曲拉通100和十二烷基磺酸钠中的一种或多种，所述缓冲溶液为TE缓冲溶液。
10.根据权利要求1所述的快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，所述PCR检测选自普通PCR、多重PCR或荧光定量PCR中的任意一种检测方法。
全文摘要
本发明涉及食品安全领域，一种基于非标记的氨基化纳米磁珠捕获痕量基因组脱氧核糖核酸(DNA)结合聚合酶链式反应(PCR)快速检测食品中致病菌的方法。现有技术的缺点是国标培养方法需要增菌，检测时间长；免疫检测方法需要高质量的抗体，且一种抗体只对应一种致病菌；单纯的PCR检测技术也需要前增菌，检测时间长。本发明方法为制备适合于加入PCR体系中的氨基磁珠，捕获经过简单处理的食品样品中的DNA，最终结合物直接进行PCR检测。本发明的优点是检测快速；价格低廉；灵敏度高；可针对不同致病菌检测，且可同时检测多种致病菌；可做半定量检测或定量检测。
文档编号C12Q1/68GK103160577SQ20131004626
公开日2013年6月19日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者史贤明, 白亚龙, 施春雷, 宋明辉, 王大鹏, 崔妍 申请人:上海交通大学