专利名称：在单端孢菌毒素缺陷的丝状真菌突变细胞中生产异源多肽的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及在单端孢菌毒素缺陷的丝状真菌突变细胞中产生异源多肽的方法。本发明还涉及所述丝状真菌细胞的突变细胞和获得这些突变细胞的方法。本发明还涉及分离的trichodiene合成酶和分离的编码trichodiene合成酶的核酸序列。本发明还涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞以及制备trichodiene合成酶的方法。此外本发明涉及包含无标记修饰的基因的突变细胞和获得和使用这种突变细胞的方法。
相关工艺描述单端孢菌毒素是以首次分离到该物质的真菌粉红单端孢(Trichothecium roseum)命名的倍半萜环氧化物。单端孢菌毒素T-2毒素、蛇形菌素，以及脱氧瓜萎镰菌醇最常见于感染了镰孢的农产品。对这些化合物的兴趣主要基于这一发现，即食品和饲料污染了单端孢菌毒素对人和动物可能是有害的。
单端孢菌毒素是由trichodiene(产生自酶-trichodiene合成酶催化的反式，反式-法尼焦磷酸环化)经一系列氧合、异构化、环化和酯化反应产生的(Desjardins，Hohn和McCormick，1993，微生物综述57595-604)。
已从拟分枝孢镰孢(Hohn和Beremand，1989，基因79131-138)、虱状赤霉(Hohn和Desjardins，1992，分子植物-微生物相互作用5249-256)、玉蜀黍赤霉(Proctor等，1995，分子植物-微生物相互作用4593-601)、露湿漆斑菌(Myrothecium roridin)(Trapp等，1995，细胞生物化学杂志增刊19B154)和早熟禾镰孢(Fekete等，1997，真菌病理学13891-97)中克隆了Trichodiene合成酶基因(tri5或tox5)。
已经制备了虱状赤霉(Hohn和Desjardins，1992，同前)和玉蜀黍赤霉(Proctor等，1995，同前)的Tri5-突变体，该突变体不产生单端孢菌毒素。
已经克隆了单端孢菌毒素生物合成途径中的其他基因，包括来自拟分枝孢镰孢的编码15-O-乙酰基转移酶的tri3基因(McCormick等，1996，应用和环境微生物学62353-359)、来自拟分枝孢镰孢的编码细胞色素P450单加氧酶的tri4基因(Hohn等，1995，分子和普通遗传学24895-102)、来自拟分枝孢镰孢的编码一个参与调控单端孢菌毒素生物合成的锌指蛋白的tri6基因(Proctor等，1995，应用和环境微生物学611923-1930)、来自拟分枝孢镰孢的编码C-15羟基化需要的细胞色素P450单加氧酶的tri11基因(Alexander等，1997，应用和环境微生物学64221-225)、来自拟分枝孢镰孢的编码参与形成单端孢菌毒素的一个表观转运蛋白(apparent transport protein)的tri12基因(Alexander等，1997，谷类研究通讯25347-348)，以及来自禾本科镰孢的编码3-O-乙酰基转移酶的tri101基因(Kimura等，1998，生物化学杂志2721654-1661)。
本发明的目的是提供在突变细胞中制备多肽的方法。
发明概述本发明涉及制备异源多浅的方法，包括(a)在有利于异源多肽产生的条件下培养亲本丝状真菌细胞的突变细胞，其中(i)所述突变细胞包含编码异源多肽的第一核酸序列以及含有至少一个参与产生单端孢菌毒素的基因发生修饰的第二核酸序列和(ii)培养在相同条件下，所述突变细胞产生的单端孢菌毒素比亲本丝状真菌细胞少；以及(b)从培养基中分离异源多肽。本发明还涉及丝状真菌细胞的突变细胞以及获得所述突变细胞的方法。
本发明还涉及分离的trichodiene合成酶和分离的编码trichodiene合成酶的核酸序列。此外本发明涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体以及宿主细胞和制备trichodiene合成酶的方法。
本发明还涉及获得突变细胞的方法，包括(a)向具有编码第一多肽的第一核酸序列的亲本细胞导入第一核酸构建体，该构建体包含作为选择标记的硝酸还原酶基因和第一核酸序列的修饰，其中第一构建体整合到亲本细胞的基因组，以修饰过的第一核酸序列取代内源的第一核酸序列，使得在相同条件下培养时，第一多肽的产量较之亲本细胞减少；和(b)选择来自步骤(a)的有硝酸还原酶基因并且第一多肽产量减少的突变细胞。
在一个优选实施方案中，获得突变细胞的方法可以进一步包括(c)在培养条件下选择来自步骤(b)的缺失硝酸还原酶基因的突变细胞。在另一个优选实施方案中，获得突变细胞的方法可以进一步包括(c)向来自步骤(b)的突变细胞导入包含第二核酸序列的第二核酸构建体，所述第二核酸序列含有被修饰的第一核酸序列的5’和3’区，但缺少硝酸还原酶基因。其中该第二构建体整合到亲本细胞的基因组，以所述第二核酸序列取代被修饰的第一核酸序列；以及(d)在培养条件下挑选来自步骤(c)的缺失硝酸还原酶基因的突变细胞。
本发明还涉及来自这些方法的突变细胞以及用这些突变细胞制备多肽的方法。
附图简述
图1显示镰孢中的单端孢菌毒素生物合成途径。
图2A-2E显示Fusarium venenatum ATCC20334的trichodiene合成酶的基因组核酸序列和推测的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO1和2)。
图3显示pDM181的限制酶切图谱。
图4显示pJRoy36的限制酶切图谱。
图5显示pJRoy40的限制酶切图谱。
图6显示pBANe20的限制酶切图谱。
图7显示pLC30的限制酶切图谱。
图8显示pJRoy41的限制酶切图谱。
图9显示缺失tri5基因并去除amdS选择标记的方案。
图10显示pJRoy44的限制酶切图谱。
图11显示pJRoy47的限制酶切图谱。
图12显示pLC31b的限制酶切图谱。
发明详述单端孢菌毒素缺陷型突变细胞本发明涉及制备异源多肽的方法，包括(a)在有利于异源多肽产生的条件下培养亲本丝状真菌细胞的突变细胞，其中(i)所述突变细胞与亲本细胞相比不同在于，参与单端孢菌毒素产生的1或多个基因经过例如打断或缺失等修饰，和(ii)培养在相同条件下，所述突变细胞产生的单端孢菌毒素比亲本细胞少；以及(b)从突变细胞的培养基中分离异源多肽。
术语“单端孢菌毒素”此处定义为一族经一系列氧合、异构化、环化和酯化反应产生的倍半萜环氧化物，从而由trichodiene形成更复杂的单端孢菌毒素。单端孢菌毒素包括，但不限于，2-hydroxytrichodiene、12，13-epoxy-9，10-trichoene-2-ol、isotrichodiol、isotrichotriol、trichotriol、异木霉菌醇、异木霉素、15-decalonectrin、3，15-didecalonectrin、脱氧瓜萎镰菌醇、3-乙酰脱氧瓜萎镰菌醇、calonectrin、3，15-diacetoxyscirpenol、3，4，15-triacetoxyscirpenol、4，15-diacetoxyscirpenol、3-acetylneosolaniol、乙酰基T-2毒素和T-2毒素；以及它们的衍生物。单端孢菌毒素生物合成途径见图1(Desjardins，Hohn和McCormick，1993，同前)。
术语“产生单端孢菌毒素”此处定义为包括参与产生单端孢菌毒素的任何步骤，包括但不限于生物合成、生物合成的调节、运输和分泌。
在本发明的方法中，所述丝状真菌细胞可以是野生型细胞或其突变体。此外，所述丝状真菌细胞可以是不产生可检测量单端孢菌毒素，但含有编码单端孢菌毒素基因的细胞。优选地，所述丝状真菌细胞是支顶孢属(Acremonium)，曲霉属，短梗霉属，隐球酵母属，线黑粉菌属(Filibasidium)，镰孢属，赤霉属，腐质霉属，Magnaporthe，毛霉属，毁丝霉属，漆斑菌属，Neocallimastix，链孢霉属，拟青霉属，青霉属，Piromyces，皱褶菌属，踝节菌属(Talaromyces)，热子囊菌属(Thermoascus)，梭孢壳属(Thielavia)，Tolypocladium或者木霉属细胞。
在一个优选实施方案中，所述丝状真菌细胞是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或者米曲霉细胞。
在另一个优选实施方案中，所述丝状真菌细胞是杆孢状镰孢、Fusarium crookwellense(与Fusarium cerealis同物异名)、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、腐皮镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum。Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum细胞。
在另一个优选实施方案中，所述丝状真菌细胞是虱状赤霉、玉蜀黍赤霉、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、露湿漆斑菌、粗糙链孢霉或产紫青霉细胞。
在另一个优选实施方案中，所述丝状真菌细胞是Trichodermaharzianum，康宁木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei或绿色木霉细胞。
在一个更优选的实施方案中，所述Fusarium venenatum细胞是Fusarium venenatum A3/5，该菌原来以禾本科镰孢ATCC 20334保藏，最近由Yoder和Christianson(1998，真菌遗传学与生物学2362-80)以及O’Donnell等(1998，真菌遗传学与生物学2357-67)重新分类为Fusarium venenatum；以及Fusarium vanenatum的分类学上的等同物，无论它们现在称为什么种名。在另一个优选实施方案中，所述Fusarium vanenatum细胞是WO9726330中公开的FusariumvenenatumA3/5或Fusarium venenatumATCC 20334的形态学突变体。
在本发明所述方法中，丝状真菌细胞中参与产生单端孢菌毒素的任何基因都可以修饰，包括但不限于，tri3、tri4、tri5、tri6、tri11、tri12和/或tri101。在一个优选实施方案中，所述基因是tri5。在一个更优选的实施方案中，所述基因是具有SEQ ID NO1之核酸序列的Fusarium venenatum tri5基因。
可以通过利用本领域的已知方法减少或消除此处描述的1或多个基因的表达来构建单端孢菌毒素缺陷的丝状真菌突变细胞，例如插入、打断、取代或缺失。待修饰或失活的基因是，例如，编码区或活性关键部分，或者所述基因可以含有表达编码区所需要的调控区。这类调控或控制序列的一个例子可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响所述核酸序列表达的部分。其他可能作修饰的调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号序列、转录终止子和转录激活子。
可以通过将亲本细胞进行诱变并筛选其中该基因的表达被减少或消除的突变细胞，从而将所述基因修饰或失活。例如，可以通过使用合适的物理或化学诱变剂，使用合适的寡核苷酸或者对DNA序列进行PCR导致的突变来进行特异或随机的诱变。此外，可以联合使用这些诱变方法来进行诱变。
适用于该目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外线(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲烷磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
使用这些试剂时，一般通过于合适的条件下，在有所选诱变剂的情况下温育待突变的亲本细胞，并筛选显示出所述基因表达减少或没有表达的突变细胞来进行诱变。
还可以通过在所述基因或者其转录或翻译必需的调控元件中导入、取代或去除1或多个核苷酸来进行所述基因的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导入终止密码子、去除起始密码子或者改变开放读码框。可以根据本领域已知的方法，通过定点诱变或PCR导致的诱变来实现这类修饰或失活。虽然从理论上说，可以在体内，即直接在表达待修饰基因的细胞上进行修饰，但优选修饰如以下阐述在体外进行。
使所选丝状真菌细胞的单端孢菌毒素产量减少或使其失活的方便的方法的例子基于基因取代、缺失或打断技术。例如，在基因打断方法中，于体外将目的内源基因或基因片段所对应的核酸序列诱变以便产生缺陷的核酸序列，然后将后者转化到亲本细胞中产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷核酸序列取代内源基因或基因片段。可取的是所述缺陷基因或基因片段还编码可用于挑选转化子的标记物，所述转化子中的核酸序列已被修饰或破坏。选择标记基因可用于实现基因打断。缺陷的核酸序列可以单纯地以选择标记基因打断所述内源序列。可选择地，除了用选择标记基因打断外，缺陷核酸序列还可以含有内源序列，或其一部分的插入或缺失。此外，缺陷核酸序列可以含有内源序列或其一部分的插入或缺失，选择标记基因不参与修饰，而是作为鉴定含有缺陷基因的转化子的选择标记。
可选择地，可以通过已确立的反义技术，利用与所述基因的核酸序列互补的核苷酸序列来作基因修饰或失活。更具体地说，可以通过导入与所述基因的核酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列可以在细胞中转录并能与细胞内产生的mRNA杂交从而减少或消除丝状真菌细胞中基因的表达。在互补反义核苷酸序列能与mRNA杂交的条件下，翻译出的蛋白质的量就会减少或消失。
可以从其他产生单端孢菌毒素的微生物来源获得参与丝状真菌细胞中单端孢菌毒素生产的基因的核酸序列的同源或互补核酸序列。具有与Fusarium venenatum的SEQ ID NO1核酸序列互补或同源的核酸序列的Tri5基因的优选来源包括，但不限于，拟分枝孢镰孢(Hohn和Beremand，1989，同前)、虱状赤霉(Hohn和Desjardins，1992，同前)、玉蜀黍赤霉(Proctor等，1995，同前)、露湿漆斑菌(Trapp等，1995，同前)和早熟禾镰孢(Fekete等，1997，同前)。
单端孢菌毒素生物合成途径中可能与丝状真菌细胞相应基因的核酸序列互补或同源的其他基因的优选来源包括，但不限于，来自拟分枝孢镰孢的tri3基因(McCormick等，1996，同前)、来自拟分枝孢镰孢的tri4基因(Hohn等，1995，同前)、来自拟分枝孢镰孢的tri6基因(Proctor等，1997，同前)、来自拟分枝孢镰孢的tri11基因(Alexander等，1997，同前)、来自拟分枝孢镰孢的tri12基因(Alexander等，1997，同前)以及来自禾本科镰孢的tri101基因(Kimura等，1998，同前)。此外，所述核酸序列可以是丝状真菌细胞天然存在的。
在一个优选实施方案中，突变丝状真菌细胞中参与产生单端孢菌毒素的基因的修饰未用选择标记标志。
可以通过在反选择培养基上培养突变子来挑选去掉了选择标记基因的。选择标记基因含有侧接于其5’和3’末端的重复序列时，当对突变细胞进行反选择，重复序列将通过同源重组促进选择标记的环出。还可以通过向突变细胞中导入这样的核酸片段，该片段含有缺陷基因的5’和3’区，但缺少选择标记基因，然后在反选择培养基上挑选，从而通过同源重组来去除选择标记基因。通过同源重组，含有选择标记基因的缺陷基因被缺少选择标记基因的核酸片段取代。还可以使用本领域其他已知方法。
应当明白，本发明所述获得突变丝状真菌细胞的方法不限于特定顺序。可以在构建所述产生异源多肽的细胞的任何步骤向亲本细胞中引入对参与产生单端孢菌毒素的基因的修饰。优选地，在导入编码异源多肽的基因之前，所述丝状真菌突变子已是单端孢菌毒素缺陷的。
可以采用本领域已知的方法(参见，例如，Rood等，1988，农业和食品化学杂志3674-79；Romer，1986，官方分析化学家协会杂志69699-703；McCormick等，1990，应用与环境微生物学56702-706)来确定本发明所述突变丝状真菌细胞产生的单端孢菌毒素的水平。优选在相同条件下培养时，所述突变丝状真菌细胞较之相应亲本丝状真菌细胞产生的单端孢菌毒素少至少大约25％、更优选少至少大约50％，更优选少至少大约75％，最优选少至少大约95％，最最优选的是没有单端孢菌毒素。可以在有利于目的多肽产生或有利于单端孢菌毒素产生的条件下，就单端孢菌毒素的产量来比较亲本和突变细胞。
采用本领域已知方法，在适合目的异源多肽产生的营养基质中培养所述突变丝状真菌细胞。例如，可以在有合适的培养基的实验室或工业发酵罐中，于异源多肽能进行表达和/或分离的条件下通过摇瓶培养、或小量或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养所述细胞。可以在含有碳和氮源以及无机盐的适当营养基质中，采用本领域已知操作进行培养。合适的培养基可购自供应商或者可以按照公开的配方(例如，美国典型培养物保藏中心的目录)来制备。如果异源多肽分泌出来，可以直接从培养基中回收。
检测异源多肽可以利用本领域已知的该多肽的特异方法。这些检测方法可能包括利用特异抗体、酶产物的形成、酶底物的消失、SDS-PAGE或者其他本领域的已知方法。例如，可以用酶检测来确定异源多肽的活性。许多酶的测活步骤是本领域已知的。
可以通过本领域已知的方法来分离所得异源多肽。例如可以通过常规操作，包括，但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀来从营养基质中分离所述多肽。分离的多肽可以通过本领域已知的许多操作，包括，但不限于层析(例如，离子交换、亲合、疏水、层析聚焦以及体积排阻层析)、电泳操作(例如制备性等电聚焦)、差示溶解(例如硫酸铵沉淀)或者提取(参见，例如《蛋白质纯化》J-C，Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)来进一步纯化。
所述多肽可以是突变丝状真菌细胞的任何异源多肽。此处术语“多肽”并非指示编码产物的具体长度，因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。术语“异源多肽”此处定义为丝状真菌细胞的非天然多肽。突变丝状真菌细胞可以含有1或多拷贝的编码所述异源多肽的核酸序列。
在一个优选实施方案中，所述异源多肽是激素、激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分或者是报道蛋白。在一个更优选的实施方案中，所述异源多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。在一个甚至更优选的实施方案中，所述异源多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶(transglutaminase)或木聚糖酶。
在本发明的方法中，所述异源多肽也可以是多肽的工程化变体。
编码能在丝状真菌细胞中表达的异源多肽的核酸序列可以得自任何原核细胞、真核细胞或其他来源。就本发明而言，术语“得自”与给定来源联系在一起用于此处表示多肽由该来源或插入了来自该来源的基因的细胞产生。
在本发明的方法中，突变丝状真菌细胞也可以用于重组生产细胞的天然多肽。通过例如，使编码该多肽的基因处于不同启动子的调控下以便增强该多肽的表达、利用信号序列促进目的天然多肽运送到细胞外以及增加编码多肽(其正常情况下由细胞产生)的基因拷贝数从而重组地生产所述天然多肽。本发明术语“异源多肽”的范围还涵盖重组产生丝状真菌细胞天然的内源多肽，其中这种表达涉及利用对细胞并非天然的基因元件，或者利用已被改变成以宿主细胞中原来不存在的方式行使功能的天然元件。
用于分离或克隆编码异源多肽的核酸序列的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA中分离、由cDNA制备或者联合使用它们。例如利用公知的聚合酶链式反应(PCR)可以实现来自基因组DNA的核酸序列的克隆。参见，例如，Innis等，1990，PCR方案方法和应用手册，Academic Press，New York。也可以使用其他核酸扩增操作，比如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。所述克隆过程可能包括切割和分离所需含有编码多肽的核酸序列的核酸片段，将该片段插入载体分子，以及使重组载体掺入到突变真菌细胞，从而在此复制多拷贝或多克隆的核酸序列。所述核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的或者是它们的任何组合形式。
在本发明的方法中，异源多肽还可以包括融合或杂合的多肽，其中在所述多肽或其片段的氨基端或羧基端融合了另一个多肽。通过将编码一个多肽的核酸序列(或其一部分)与编码另一个多肽的核酸序列(或其一部分)融合在一起可以产生融合多肽。制备融合多肽的技术是本领域已知的，包括将编码多肽的编码序列连接起来以便使它们读框一致，并且融合多肽的表达受到相同启动子和终止子的调控。杂合多肽可以包含组合在一起的至少两种不同多肽的部分或完整多肽序列，其中的一种或多种多肽对突变丝状真菌细胞是异源的。
可以多种途径操作编码目的异源多肽的分离的核酸序列从而使其表达所述多肽。表达应理解为包括生产多肽涉及到的任何步骤，包括，但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。根据表达载体不同，在将核酸序列插入载体前进行操作可能是可取或必需的。利用克隆方法修饰核酸序列的技术是本领域公知的。
此处“核酸构建体”定义为这样一个核酸分子，它是单链或双链的，分离自天然基因或者已被修饰从而含有几个核酸区段，这些区段的组合和排列方式不存在于自然界。核酸构建体含有表达编码序列所需的全部调控序列时，术语核酸构建体与术语表达盒是同义词。术语“编码序列”此处定义为转录为mRNA并翻译为多肽的序列。基因组编码序列的界线通常由正好位于mRNA 5’末端的开放读码框上游的ATG起始密码子和正好位于mRNA 3’末端的开放读码框下游的转录终止子序列确定。编码序列可以包括，但不限于，基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成的、重组的或者它们的任何组合方式。
术语“调控序列”此处定义为包括表达异源多肽所必需或有益的全部组分。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然或外来的。这类调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列以及转录终止子。所述调控序列最低限度包括一个启动子和转录及翻译终止信号。可以和调控序列一起提供接头以用于导入能协助调控序列和编码异源多肽的核酸序列的编码区进行连接的特异限制酶位点。术语“可操纵地连接”此处定义为这样一种构型，其中调控序列相对DNA序列的编码序列适当地置于能引导产生所述异源多肽的位置。
所述调控序列可以是合适的启动子序列，即丝状真菌细胞表达核酸序列时识别的核酸序列。启动子序列含有介导异源多肽的表达的转录调控序列。该启动子可以是任何在丝状真菌细胞中显示转录活性的核酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，可以得自编码对细胞是同源的或异源的胞外或胞内多肽的基因。
适合在本发明所述方法中引导核酸构建体进行转录的启动子的例子是得自下列基因的启动子，这些基因编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucormiehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶、尖镰孢类胰蛋白酶蛋白酶(美国专利4288627)及其突变的、截短的和杂合启动子。特别优选的启动子是葡糖淀粉酶，TAKA淀粉酶和NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶编码基因的启动子的杂合体)。
调控序列还可以是合适的转录终止子序列，即由丝状真菌细胞识别从而终止转录的一个序列。所述终止子序列可操纵地连接在编码异源多肽的核酸序列的3’端。任何在丝状真菌细胞中有功能的终止子均可用于本发明。
优选的终止子得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α葡糖苷酶和尖镰孢类胰蛋白酶蛋白酶的基因。
所述调控序列还可以是合适的前导序列，即mRNA的一个非翻译区，它对丝状真菌细胞的翻译非常重要。前导序列可操纵地连接在编码异源多肽的核酸序列的5’端。任何在丝状真菌细胞中有此功能的前导序列均可用于本发明。
优选的前导序列得自编码米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。
所述调控序列还可以是多聚腺苷酸化序列，即可操纵地连接在核酸序列的3’末端，并在转录时被丝状真菌细胞识别，作为一个信号向被转录的mRNA添加多聚腺苷酸残基的序列。任何在丝状真菌细胞中有此功能的多聚腺苷酸化序列均可用于本发明。
优选的多聚腺苷酸化序列得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶和黑曲霉α葡糖苷酶的基因。
所述调控序列还可以是信号肽编码区，它编码连接在异源多肽氨基端的一个氨基酸序列，并引导编码多肽进入细胞的分泌途径。核酸序列中编码序列的5’末端可以自身含有信号肽编码区，后者天然地与编码所分泌多肽的编码区片段在翻译阅读框中连接在一起。可选择地，编码序列的5’末端可以含有该编码序列的外源信号肽编码区。编码序列正常情况下不含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。可选择地，可以直接用外来信号肽编码区代替天然的信号肽编码区以便增强多肽的分泌。但是，任何能引导所表达异源多肽进入丝状真菌细胞的分泌途径的信号肽编码区都可用于本发明。
对丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是这样一些信号肽编码区，它们得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂酶的基因。
所述调控序列还可以是前肽编码区，它编码位于多肽氨基端的一段氨基酸序列。所得的多肽称为前酶或多肽原(在某些情况中称为酶原)。多肽原通常是没有活性的，由多肽原通过催化或自身催化切割掉前肽可以将其转化为成熟、有活性的多肽。所述前肽编码区可以得自Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因或者嗜热毁丝霉漆酶基因(WO9533836)。
信号肽和前肽区均位于多肽的氨基端时，前肽区与多肽的氨基端相邻，信号肽区域与前肽区的氨基端相邻。
所述核酸构建体还可以包含1或多个核酸序列，这些序列编码1或多个有利于指导异源多肽进行表达的因子，例如转录激活子(例如反式作用因子)、伴侣蛋白和加工蛋白酶。任何在丝状真菌细胞中有功能的因子均可用于本发明。所述编码1或多个因子的核酸不必与编码异源多肽的核酸序列串联。
添加这样一些调控序列可能也是可取的，这些序列能相对丝状真菌细胞的生长而调节异源多肽的表达。调控体系的例子是那些在化学或物理刺激(包括存在调控化合物)下导致基因表达开放或关闭的体系。TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子均可作为调控序列。调控序列的其他例子是能使基因扩增的序列，例如可用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码异源多肽的核酸序列应与调控序列可操纵地连接在一起。
利用一个含有最少量的改变内源核酸序列表达所需成分的核酸构建体也可以改变细胞的内源核酸序列的表达。在一个实施方案中，所述核酸构建体优选含有(a)导靶序列，(b)调控序列，(c)外显子和(d)剪接供体位点。该核酸构建体一导入细胞，就通过同源重组插入细胞基因组的内源核酸序列位点。导靶序列引导元件(a)-(d)整合到内源核酸序列中，从而使元件(b)-(d)可操纵地与内源核酸序列连接。在另一个实施方案中，所述核酸构建体含有(a)导靶序列，(b)调控序列，(c)外显子，(d)剪接供体位点，(e)内含子以及(f)剪接受体位点，其中导靶序列引导元件(a)-(f)的整合从而使元件(b)-(f)可操纵地与内源核酸序列连接。但构建体还可以含有其他成分比如选择标记。
在这两个实施方案中，这些成分的导入均产生一个新的转录单元，其中内源核酸序列的表达被改变。实质上，这个新的转录单元是导靶构建体所导入的序列与内源核酸序列的融合产物。在一个内源核酸序列被改变的实施方案中，核酸序列是被激活。在该实施方案中，利用同源重组，通过插入一个调控序列来将正常情况下与亲本细胞的内源核酸序列相连的调控区取代、打断或失活，该调控序列使得核酸序列以高于相应亲本细胞的水平进行表达。利用本领域已知的方法(参见，例如美国专利5641670)，通过使构建体中含有一个可扩增的选择标记基因能进一步扩增被激活的核酸序列。在另一个内源核酸序列被改变的实施方案中，基因的表达降低。
所述导靶序列可以在内源核酸序列内、紧接着核酸序列、在上游基因之内或者在内源核酸序列的上游或有一定距离。可以使用1或多个导靶序列。例如，环形质粒或其DNA片段优选采用单个导靶序列，而线性质粒或其DNA片段优选采用两个导靶序列。
构建体中的调控序列可以包含1或多个启动子、增强子、支架附着区或者基质结合位点、负调控元件、转录结合位点或者这些序列的组合形式。
所述构建体另外含有内源核酸序列的1或多个外显子。外显子定义为这样一个DNA序列，它可被拷贝成RNA并存在于成熟的mRNA分子中，因此外显子序列与内源核酸序列的编码区读框一致。任选外显子含有编码1或多个氨基酸和/或部分编码氨基酸的DNA。可选择地，外显子含有对应于5’非编码区的DNA。在外源外显子编码1或多个氨基酸和/或氨基酸的一部分的情况下，将所述核酸构建体设计成当转录和剪接时，读码框与内源核酸序列的编码区读框一致，从而来自第二个外显子的mRNA部分的正确读码框不被改变。
构建体的剪接供体位点引导一个外显子与另一个外显子的剪接。通常，第一外显子位于第二外显子的5’，与第一外显子在3’方向重叠和侧接的剪接供体位点识别侧接在第二外显子5’侧的剪接受体位点。剪接受体位点和剪接供体位点一样，是引导一个外显子与另一个外显子进行剪接的序列。剪接系统利用剪接受体位点，与剪接供体位点联合作用来去除内含子。
可以将以上描述的各种核酸和调控序列连接在一起产生一个重组表达载体，该载体可以包括1或多个方便的限制位点以便在该位点插入或取代编码异源多肽的核酸序列。可选择地，可以通过将编码异源多肽的核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入到合适的表达载体中使所述序列得以表达。在制备表达载体时，将编码序列置于载体中，从而使编码序列可操纵地连接合适的调控序列以便进行表达，还有可能分泌。
所述重组表达载体可以是任何可以方便地对它进行重组DNA操作，并能表达编码异源多肽的核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。通常载体的选择取决于载体与该载体要导入的丝状真菌细胞的相容性。载体可以是线性或封闭环形质粒。载体可以是自主复制的载体，即以染色体外个体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如，质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。该载体可以含有确保进行自我复制的任何手段。可选择地，载体可以是一个在导入丝状真菌细胞时能整合到基因组中并与它所整合的染色体一起复制的载体。载体系统可以是单个载体或质粒或者两个或多个载体或质粒，它们共同含有要导入丝状真菌细胞基因组的DNA，或者是转座子。
优选所述载体含有1或多个能使得容易挑出被转化的丝状真菌细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物能提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性，使营养缺陷型成为原养型等。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记可以选自amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸转氨甲酰酶)、bar(膦丝菌素转乙酰酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)，以及来自其他物种的等同物，但不局限于此。优选用于丝状真菌细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌的bar基因。
优选所述载体含有能使载体稳定地整合到丝状真菌细胞基因组或者能使载体在细胞中独立于该细胞的基因组而自主复制的元件。
“导入”意味着将包含核酸序列的载体引入丝状真菌细胞从而该载体维持染色体的整合子或自我复制的染色体外载体的形态。通常认为整合比较占优势，因为这样核酸序列更可能稳定地维持在细胞中。载体的整合是通过同源重组、非同源重组或转座实现的。
向丝状真菌细胞中导入表达载体可能包括这样的过程以已知方式进行原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生。在EP238023和Yelton等，1984，美国科学院学报811470-1474中描述了转化曲霉宿主细胞的合适程序。Malardier等，1989，基因78147-156以及WO96/00787中描述了转化镰孢菌种的适用方法。
为了整合到丝状真菌细胞基因组中，载体可以依赖于编码异源多肽的核酸序列或者能使载体通过同源或非同源重组稳定整合到基因组中的其他载体元件。可选择地，载体可以含有引导通过同源重组整合至丝状真菌细胞基因组的其他核酸序列。所述其他核酸序列使载体能在染色体的精确位点整合到基因组中。为了提高在精确位点整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸序列，比如100到1500碱基对，优选400到1500碱基对，最优选800到1500碱基对，这些核酸序列与相应的靶序列高度同源以便增加同源重组的几率。整合元件可以是与丝状真菌细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到细胞基因组中。
为了进行自主复制，载体还包含复制起点以保证载体在所述丝状真菌细胞中自主地复制。
用于将文中描述的元件连接起来构建重组表达载体的步骤是本领域技术人员熟知的(参见，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，分子克隆，实验指南，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。
在本发明的另一个方面，所述突变丝状真菌细胞另外含有1或多个核酸序列的修饰，这些核酸序列编码对目的异源多肽的生产、提纯和/或应用可能有害的蛋白质。修饰将使1或多个第三核酸序列的表达减少或消除，这样得到的突变细胞培养在相同条件下比第三核酸序列未修饰的突变细胞产生更多异源多肽。
所述第三核酸序列可以编码任何蛋白质或酶。例如，酶可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。优选第三核酸序列编码蛋白水解酶，例如氨肽酶、羧肽酶或蛋白酶。
本方法还涉及获得单端孢菌毒素缺陷型丝状真菌突变细胞的方法，包括(a)向亲本丝状真菌细胞中导入核酸序列，该序列包含至少一个参与单端孢菌毒素产生的基因的修饰；和(b)鉴定来自步骤(a)的包含被修饰之核酸序列的突变体，其中突变细胞培养在相同条件下比亲本丝状真菌细胞产生的单端孢菌毒素少。
本发明还涉及用于生产异源多肽的丝状真菌细胞的单端孢菌毒素缺陷型突变体，其包含编码异源多肽的第一核酸序列和含有至少一个参与单端孢菌毒素产生之基因的修饰的第二核酸序列，其中突变细胞培养在相同条件下时产生的单端孢菌毒素比亲本丝状真菌细胞少。Trichodiene合成酶及其编码核酸本发明还涉及分离的trichodiene合成酶。
在第一个实施方案中，本发明涉及分离的trichodiene合成酶，其具有与SEQ ID NO2相同性至少大约97％(下文称为“同源多肽”)的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，同源多肽具有与SEQ ID NO2有5个、优选4个、更优选3个、更加优选的是2个，最优选1个氨基酸不同的氨基酸序列。用在本发明中，通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS5151-153)，使用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来确定两个氨基酸序列之间的相同程度，所述软件有一个相同性表及以下多重比对参数缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数是Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口(window)＝5，对角线(diagonal)＝5。
优选地，本发明的trichodiene合成酶包含SEQ ID NO2之氨基酸序列或其等位基因变体，或其具有trichodiene合成酶活性的片段。在一个更优选的实施方案中，本发明的trichodiene合成酶包含氨基酸序列SEQ ID NO2。在另一个优选实施方案中，本发明的trichodiene合成酶由氨基酸序列SEQ ID NO2或其等位基因变体，或其具有trichodiene合成酶活性的片段组成。在另一个优选实施方案中，本发明的多肽由氨基酸序列SEQ ID NO2组成。
SEQ ID NO2的片段是在该氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失了1或多个氨基酸的多肽。优选地，所述片段含有至少290个氨基酸残基，更优选含有至少320个氨基酸残基，最优选至少350个氨基酸残基。
等位基因变体表示占据相同染色体座位的基因的两个或多个替换形式中的一种。通过突变可以自然产生等位基因变异，并可能造成种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码多肽没有变化)或可以编码氨基酸序列被改变的多肽。多肽的等位基因变体是基因的等位基因变体所编码的多肽。
在第二个实施方案中，本发明涉及分离的trichodiene合成酶，其由在极低的严谨条件下、优选在低度严谨条件下，更优选在中等严谨条件下，更优选的是在高度严谨条件下，最优选在极高严谨条件下可与下述核酸探针杂交的核酸序列编码，该探针在相同条件下可与(i)SEQ ID NO.1的2521到3686位核苷酸，(ii)包含在SEQ ID NO.1的2521到3686位核苷酸中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，分子克隆，实验指南，第二版，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO.1的亚序列可以是至少100个核苷酸或优选至少200个核苷酸。此外，所述亚序列可以编码具有trichodiene合成酶活性的多肽片段。多肽还可以是具有trichodiene合成酶活性的多肽的等位基因变体或片段。
可以用SEQ ID NO1的核酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段，按照本领域已知方法来设计核酸探针以便从不同属或种的菌株中鉴定和克隆编码trichodiene合成酶的DNA。具体来说，可以用这类探针在常规Southern印迹后与目的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定和分离相应基因。所述探针可以比完整序列短得多，但应当至少长15个，优选至少25个，更优选至少35个核苷酸。也可以用较长的探针。DNA和RNA探针都可以使用。通常将探针标记以检测相应基因(例如，用32P、3H、35S、生物素、抗生物素蛋白、荧光素或洋地黄毒苷)。本发明也涵盖这些探针。
因此，可以从制备自其他生物的基因组DNA或cDNA文库筛选可与文中描述的探针杂交并编码trichodiene合成酶的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者其他分离技术来分离来自其他生物的基因组或其他DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移并固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO1或其亚序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中使用载体材料。本发明中，杂交指核酸序列与标记核酸探针在极低到极高严谨条件下可杂交，该探针对应SEQ ID NO1所示的核酸序列，其互补链或亚序列。用X-光胶片检测与所述核酸探针在这些条件下发生杂交的分子。
在一个优选实施方案中，核酸探针是编码SEQ ID NO2之多肽的核酸序列或其亚序列。在另一个优选实施方案中，核酸探针是SEQ IDNO1中2521到3686位核苷酸。在另一个优选实施方案中，核酸探针是包含在质粒pTri5中的核酸序列，该质粒包含于大肠杆菌NRRLB-30029中，所述核酸序列编码trichodiene合成酶。在另一个优选实施方案中，核酸探针是大肠杆菌NRRL B-30029包含的质粒pTri5中所含有的成熟多肽编码区。
对于至少长100个核苷酸的长探针，极低到极高严谨条件定义为依照常规Southern印迹步骤后，于42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切变性的鲑精DNA以及对极低和低严谨度是25％甲酰胺，对中等和中高严谨度是35％甲酰胺，或者对高和极高严谨度是50％甲酰胺中进行预杂交和杂交。
对于至少长100个核苷酸的长探针，最后将载体材料洗3次，每次用2X SSC、0.2％SDS，优选于至少45℃(极低度严谨)、更优选于至少50℃(低度严谨)、更优选于至少55℃(中等严谨)、更优选于至少60℃(中高度严谨)，甚至还要优选的是至少65℃(高度严谨)，最优选于至少70℃(极高度严谨)洗15分钟。
对于大约15到70个核苷酸长的短探针，严谨条件定义为依照常规Southern印迹步骤后，于低于按Bolton和McCarthy的公式(1962，美国国家科学院学报，481390)计算的Tm大约5到10℃的温度下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1XDenhardt’s溶液、1mM焦磷酸钠、磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg/ml酵母RNA中预杂交、杂交和杂交后洗涤。
对于大约15到70个核苷酸长的短探针，在比计算的Tm低大约5到10℃的温度下，载体材料在加有0.1％SDS的6X SCC中洗15分钟一次，用6X SSC洗两个15分钟。
在第三个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO2氨基酸序列的trichodiene合成酶的变体，所述变体中包含1或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入。
所述变体多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO2或其成熟多肽的氨基酸序列不同之处在于插入或缺失1或多个氨基酸残基和/或以不同氨基酸残基取代1或多个氨基酸残基。优选地，氨基酸变化较小，即不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小的缺失，通常为1到大约30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，比如，氨基端甲硫氨酸残基；多达大约20-25个残基的小接头肽；或者通过改变净电荷或其它功能来协助纯化的小延伸，比如多聚组氨酸片段，抗原表位或结合域。
保守性取代的例子是碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)各组内的取代。一般不改变其比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且H.Neurath和R.L.Hill，1979在《蛋白质》(AcademicPress，New York)中描述过。最常见的替换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及相反替换。
本发明的多肽具有SEQ ID NO2之成熟多肽的至少20％、优选至少40％、更优选至少60％、更优选至少80％、更优选至少90％，最优选至少100％的trichodiene合成酶活性。
在一个优选实施方案中，本发明的trichodiene合成酶得自Fusarium venenatum菌株，更优选得自Fusarium venenatumATCC20334或其突变菌株，例如具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽。
“分离的”trichodiene合成酶文中定义为这样一种多肽，其基本上不含其他多肽，例如，通过SDS-PAGE确定，至少大约20％纯、优选至少大约40％纯、更优选至少大约60％纯、更优选至少大约80％纯，最优选大约90％纯，甚至更加最优选的是大约95％纯。
本发明还涉及编码本发明所述trichodiene合成酶的分离的核酸序列。在一个优选实施方案中，该核酸序列如SEQ ID NO1所示。在另一个优选实施方案中，该核酸序列是包含于大肠杆菌NRRL B-30029内的质粒pTri5中含有的序列。在另一个优选实施方案中，该核酸序列是SEQ ID NO1的成熟多肽编码区。在另一个优选实施方案中，该核酸序列是包含于大肠杆菌NRRL B-30029内的质粒pTri5中含有的成熟多肽编码区。本发明还涵盖编码具有氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽的核酸序列，该核酸序列与SEQ ID NO1的区别在于遗传密码的简并性。本发明还涉及编码SEQ ID NO2的具有trichodiene合成酶活性的片段的SEQ ID NO1亚序列。
SEQ ID NO1的亚序列是SEQ ID NO1包含的核酸序列，但在5’和/或3’末端缺失了1或多个核苷酸。优选地，亚序列含有至少870个核苷酸，更优选至少960个核苷酸，最优选至少1050个核苷酸。
本发明还涉及在SEQ ID NO1的成熟多肽编码序列中包含至少1个突变的突变核酸序列，其中所述突变核酸序列编码由SEQ ID NO2的1到380位氨基酸构成的多肽。
文中描述了用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术。所述核酸序列可以克隆自镰孢属菌株，或者另一种或相关生物，并且例如可以是所述核酸序列的多肽编码区的等位基因或物种变体。
术语“分离的核酸序列”用在文中指这样一个核酸序列，它基本上不含其他核酸序列，例如通过琼脂糖电泳确定为至少大约20％纯，优选至少大约40％纯，更优选至少大约60％纯，更优选至少大约80％纯，最优选至少大约90％。例如，通过基因工程中用来将核酸序列从它的天然位置重新放置到它可以被增殖的不同位点的常规克隆技术，就可以获得分离的核酸序列。克隆过程可能包括包含编码多肽的核酸序列的所需核酸片段的切割和分离、将片段插入载体分子，以及将重组载体掺入到宿主细胞中，由此将复制出多个拷贝或克隆的核酸序列。所述核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源或者它们的任何组合形式。
本发明还涉及与SEQ ID NO1中2521到3686位核苷酸同源性至少大约97％，并编码trichodiene合成酶的核酸序列。本发明中，两个核酸序列之间的同源性是通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，美国科学院学报80726-730)，使用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.Madison，WI)确定的，该软件中使用相同表和以下多重比对参数缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数为Ktuple＝3，缺口罚分＝3，窗口＝20。
对编码本发明所述trichodiene合成酶的核酸序列进行修饰可能是合成与trichodiene合成酶基本上类似的多肽所必需的。术语与trichodiene合成酶“基本上类似”指该多肽的非天然形式。这些多肽可能与分离自天然来源的trichodiene合成酶在某些工程化方法上不同，例如，比活性、热稳定性、最适pH等不同的变体。可以在SEQID NO1之多肽编码部分所示的核酸序列(例如其亚序列)的基础上，和/或通过引入核苷酸取代，该取代不会使核酸序列编码的多肽具有另一个氨基酸序列，但符合用来产生酶的宿主微生物的密码子使用习惯，或者通过引入能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代，从而构建所述变体序列。对核苷酸取代的全面描述，参见，例如Ford等，1991，蛋白质表达和纯化295-107。
可以在分子的功能关键区以外进行这类取代，仍得到有活性的多肽，这对本领域技术人员是显而易见的。对于本发明所述分离核酸序列编码的多肽的活性起关键作用，因此优选不对它们进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知步骤，比如定点诱变或丙氨酸扫描诱变来鉴定(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，科学2441081-1085)。在后一种技术中，在分子中每个带正电的残基处引入突变，测试所得突变分子的trichodiene合成酶活性，以便鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。通过分析比如通过核磁共振、结晶学或光亲合标记技术等确定的三维结构，也可以确定底物-酶相互作用的位点(参见，例如，de Vos等，1992，科学255306-312；Smith等，1992，分子生物学杂志224899-904；Wlodaver等，1992，FEBS快报30959-64)。
本发明还涉及编码本发明所述trichodiene合成酶的分离的核酸序列，该序列与下述核酸探针在极低严谨条件下，优选在低严谨条件下，更优选中等严谨条件下，更优选中高严谨条件下，更优选高度严谨条件下，最优选极高严谨条件下可杂交，所述探针在相同条件下与SEQ ID NO1之核酸序列或其互补链可杂交；或文中定义的其等位基因变体或亚序列(Sambrook等，1989，同前)。
本发明还涉及这样产生的分离的核酸序列(a)将DNA在极低、低、中等、中高、高或极高严谨条件下与(i)SEQ ID NO1的2521到3686位核苷酸，(ii)包含在SEQ ID NO1的2521到3686位核苷酸中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交；以及(b)分离该核酸序列。所述亚序列优选是至少100个核苷酸的序列，比如编码具有trichodiene合成酶活性的多肽片段的序列。
在一个优选实施方案中，所述编码trichodiene合成酶的分离的核酸序列得自Fusarium venenatum，在一个更优选的实施方案中，该核酸序列得自Fusarium venenatum ATCC 20334，例如SEQ ID NO1所示核酸序列。在另一个更优选的实施方案中，该核酸序列是包含于大肠杆菌NRRL B-30029内的质粒pTri5中含有的序列。本申请还涵盖与SEQ ID NO1因遗传密码简并性而不同的核酸序列。
可以从Fusarium venenatum的分类学上的等同微生物(按照Yoder和Christianson(1998，同前)以及O’Donnell等(1998，同前)的定义，不论它们现在称为何菌种)获得所述核酸序列。
本发明另外涉及制备突变核酸序列的方法，包括向SEQ ID NO1的成熟多肽编码序列或其亚序列中导入至少一个突变，其中该突变核酸序列编码由SEQ ID NO2的1到380位氨基酸组成的多肽或者其具有trichodiene合成酶活性的片段。
可以采用本领域已知方法，通过定点诱变来向所述核酸序列中导入突变以便将一个核苷酸置换为另一核苷酸。尤其有用的步骤利用一个带有目的插入片段的超螺旋双链DNA载体和两个含有所需突变的合成引物。所述寡核苷酸引物分别与载体的相对链互补，它们借助PfuDNA聚合酶在温度循环过程中延伸。引物掺入后将产生含有交错切口的突变质粒。在温度循环之后，用DpnI处理产物，该酶特异识别甲基化和半甲基化DNA，由此消化亲本DNA模板并能选择含有突变的合成DNA。也可以使用本领域已知的其他步骤。
本发明还涉及用于表达所述序列的含有SEQ ID NO1之核酸序列、其亚序列或同源物的核酸构建体、重组表达载体和宿主细胞。可以按照文中的描述构建所述构建体和载体。宿主细胞可以是任何适用于表达该核酸序列的细胞。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，它与亲本细胞的不同源于复制过程中发生的突变。选择宿主细胞很大程度上取决于编码多肽的基因和它的来源。
宿主细胞可以是真核细胞，比如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个优选实施方案中，宿主细胞是一种真菌细胞。文中所用“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等在Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中的定义)以及卵菌门(Oomycota)(Hawksworth等，1995，同前，171页)和所有的有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同前)。
在一个更优选的实施方案中，该真菌宿主细胞是一种酵母细胞。文中使用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类的酵母(芽孢纲)。因为酵母的分类在将来可能改变，就本发明的目的而言，应按照《酵母的生物学和活性》(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.，编，Soc.App.Bacteriol.论文集9，1980)中的描述来定义酵母。
在一个更优选的实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或者Yarrowia属的细胞。
在一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。
在另一个更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是一种丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门亚支的所有丝状形态(如Hawksworth等定义，1995，同前)。丝状真菌的特点通常在于其菌丝壁由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其他复杂多糖组成。它们通过菌丝的延长进行营养生长，碳代谢是专性需氧的。相反，酵母比如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽进行的，碳代谢是发酵性的。
在一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是以下属内的种，但不限于这些属内的种的细胞支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium或者木霉属。
在一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、F.cerealis、F.crookwellense、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、F.torulosum、F.trichothecioides或F.venenatum细胞。在一个更加最优选的实施方案中，丝状真菌亲本细胞是F.venenatum(Nirenberg新种)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、H.lanuginosa、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、Thielaviaterrestris、Trichoderma harzianum、康宁氏木霉、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉细胞。
可以利用文中描述的步骤来转化所述丝状真菌细胞。转化酵母可以使用Becker和Guarente(在Abelson，J.N.Simon，M.I.编的酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法194卷，182-187，AcademicPress，Inc.，New York)、Ito等(1983，细菌学杂志153163)以及Hinnen等(1978，美国科学院学报751920)描述的步骤。
本发明还涉及制备本发明所述trichodiene合成酶的方法，包括(a)培养一个菌株来制备包含trichodiene合成酶的上清液，所述菌株的野生型能产生所述多肽；和(b)回收trichodiene合成酶。优选地，该菌株属于镰孢属，更优选是Fusarium venenatum。
本发明还涉及制备本发明所述trichodiene合成酶的方法，包括(a)在有利于产生trichodiene合成酶的条件下培养宿主细胞；和(b)回收trichodiene合成酶。
此外本发明涉及制备trichodiene合成酶的方法，包括(a)在适合产生由内源核酸序列编码的trichodiene合成酶的条件下培养一种同源重组细胞，该细胞中掺入了一个新的转录单元，包含调控序列、外显子和/或可操纵地连接着本发明所述核酸序列(它对于细胞是内源的)的第二外显子的剪接供体位点；以及(b)回收trichodiene合成酶。该方法基于利用基因活化技术，例如美国专利5641670中描述的。
在本发明的制备方法中，利用文中描述的本领域的已知方法在适合产生trichodiene合成酶的营养基质中培养所述细胞。可以采用本领域已知的该酶的特异方法来检测trichodiene合成酶(参见，例如，Hohn和Beremand，1989，应用和环境微生物学551500-1503)。通过文中描述的本领域已知方法可以将得到的trichodiene合成酶回收并纯化。
无硝酸还原酶选择标记的突变细胞本发明还公开了利用硝酸还原酶基因作为修饰靶基因或DNA元件的选择标记从而减少或消除细胞内一种基因产物的产生。然后可以从细胞中缺失掉硝酸还原酶基因以便产生不含选择标记的细胞。
因此本发明还涉及获得突变细胞的方法，包括(a)向具有编码一种基因产物的核酸序列的亲本细胞中导入一个核酸构建体，该构建体含有作为选择标记的硝酸还原酶基因和对该核酸序列的修饰，其中所述构建体整合至亲本细胞的基因组中取代核酸序列，造成培养在相同条件下时，其基因产物较之亲本细胞减少；和(b)从步骤(a)挑选含有硝酸还原酶基因并且所述基因产物减少的突变细胞。
硝酸还原酶催化硝酸盐向亚硝酸盐的转化，这使得细胞能以硝酸盐为唯一氮源生长。对于缺少或仅有有限的能力利用硝酸盐作为唯一氮源的细胞，从理论上来说，只要细胞能摄取硝酸盐，就可以利用硝酸还原酶基因作为选择标记。优选硝酸还原酶基因在所选细胞内是显性的。编码硝酸还原酶的DNA可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或者是它们的任何组合形式，能产生有功能的酶。
可以利用文中描述的或本领域已知的任何重组方法来从任何来源中获得硝酸还原酶。在一个优选实施方案中，硝酸还原酶得自真菌来源，更优选得自酵母或丝状真菌菌株。在一个更优选的实施方案中，硝酸还原酶得自粗糙脉孢菌(nit3，参见，Fu和Marzluf，1987，美国科学院学报848243-8247)。在另一个更优选的实施方案中，硝酸还原酶得自曲霉属菌株(niaD)，比如构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和寄生曲霉。在另一个更优选的实施方案中，硝酸还原酶得自镰孢属菌株(nia)，比如尖镰孢。
利用文中描述的或者本领域已知的基因插入、打断、取代或缺失方法可以对靶核酸序列进行修饰。基因修饰可以是靶核酸序列或其一部分中的1或多个核苷酸改变，例如插入、缺失和/或取代，所述部分是比如，但不限于编码区、信号序列、启动子、终止子、内含子或调控DNA序列。因此构建一个包含靶核酸序列或其部分被修饰形式的核酸构建体以便用于消除或减少该核酸序列的表达。然后将该构建体转化到亲本细胞中产生缺陷的核酸序列，在此通过同源重组，缺陷序列取代了靶序列或其一部分。为了导入细胞，所述构建体可以包含在一个载体上。硝酸还原酶基因作为选择标记用于鉴定含有缺陷核酸序列的转化子。
该缺陷核酸序列可以是简单地用硝酸还原酶打断靶序列。可选择地，除了硝酸还原酶基因造成的基因打断，缺陷核酸序列还可以含有靶序列或其一部分的插入、取代和/或缺失。此外，缺陷核酸序列可以含有靶序列或其一部分的插入、取代和/或缺失，而硝酸还原酶基因不参与修饰，但后者与缺陷序列毗连。
所述核酸构建体在硝酸还原酶基因的5’和3’端可以进一步含有1或多个重复序列以便协助最终缺失掉硝酸还原酶基因。重复序列可以是任何适用于促进染色体内同源重组的核酸序列。通过提高基因进行染色体内同源重组的能力可以显著地增加标记基因缺失的频率。
硝酸还原酶的一个有用特性是它能将氯酸盐转化为对细胞有毒的亚氯酸盐。正是这个特性形成了本发明另一个方面，即制备不含硝酸还原酶选择标记的转化子的基础。转化氯酸盐的特性使得能反选择转化细胞。使挑选出的含有硝酸还原酶基因的转化子生长在以氯酸盐为唯一氮源的培养基上，鉴定存活的转化子，它们已丢失硝酸还原酶基因。某些存活转化子可能自身在硝酸还原酶基因中有突变。因此，应当通过例如Southern杂交证实硝酸还原酶基因的缺失。
因此，获得突变细胞的方法可以进一步包括(c)在培养条件下从步骤(b)中挑选已缺失硝酸还原酶基因的突变细胞。可选择地，获得突变细胞的方法还可以包括(c)向来自步骤(b)的突变细胞中导入第二核酸构建体，该构建体包含含有被修饰核酸序列的5’和3’区，但缺少硝酸还原酶基因的第二核酸序列，其中所述第二构建体掺入到亲本细胞的基因组中，以第二核酸序列取代被修饰的核酸序列，以及(d)在培养条件下从步骤(c)中挑选已缺失硝酸还原酶基因的突变细胞。
在这两种情况下，培养条件包括反选择硝酸还原酶的含有氯酸盐的反选择培养基。
缺失作为选择标记的硝酸还原酶基因的一个优选构建体从5’到3’应含有以下元件待缺失基因的5’端序列，其直接与待缺失基因的3’端序列融合在一起，下游随之是有功能的硝酸还原酶基因，再下游又是待缺失基因的3’端序列。在这种情况中，选择待缺失基因3’端的两个序列以使它们形成侧接选择标记基因的重复区。该核酸构建体的转化以及随后待缺失基因的5’和3’序列交换点取代该核酸构建体待缺失基因的染色体拷贝，导致所述基因的缺失。随后侧接选择标记基因的重复序列之间的染色体内重组以及对转化子进行的反选择最终产生不含选择标记的菌株。5’和3’重复序列不必都存在于构建体中，因为可以利用单个重复序列通过单交换整合来缺失基因。可以这样一种方式构建构建体，其在缺失硝酸还原酶基因后，没有外来的硝酸还原酶基因DNA还保持在转化细胞的染色体中。
所述构建体可以包含在载体中。可以按照文中的描述制备构建体和载体。
本发明的方法可以用来减少或消除1或多种靶基因产物的产生，这些靶基因产物是生产目的蛋白质(或化合物)时不需要的，特别是靶基因产物对所述蛋白质或化合物的产生、回收和/或应用有害时更可如此。这些方法还可以用来减少或消除抗生素和其他生物活性化合物的生物合成。
所述细胞可以是单细胞微生物，例如，原核细胞，或者非单细胞微生物，例如真核细胞，比如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个优选实施方案中，宿主细胞是真菌细胞，比如酵母或丝状真菌细胞。该酵母或真菌细胞可以是文中描述的任何细胞。
有用的单细胞细胞是细菌细胞，比如革兰氏阳性细菌，包括，但不限于，芽孢杆菌细胞，例如嗜碱性芽孢杆菌、液化淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环形芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或者链霉菌细胞，例如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或者是革兰氏阴性细菌比如大肠杆菌和假单胞菌属的种。
可以利用感受态细胞(参见，例如Young和Spizizin，1961，细菌学杂志81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志56209-221)通过原生质体转化(参见，例如Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学168111-115)、电穿孔(参见，例如Shigekawa和Dower，1988，生物技术6742-751)或接合(参见，例如Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志1695771-5278)将构建体导入细菌细胞。
本发明还涉及通过这些方法产生的突变细胞。本发明的突变细胞可以用于制备该突变细胞的天然或外来多肽。所述多肽可以是任何多肽，比如文中描述过的。利用文中描述的方法可以在本发明所述突变细胞中表达多肽。
本发明还涉及制备多肽的方法，包括(a)在有利于产生多肽的条件下培养含有编码所述多肽的核酸序列的突变细胞；以及(b)从突变细胞的培养基中分离多肽。文中描述了培养突变体和分离多肽的方法。
通过以下实施例进一步描述本发明，但不应将实施例理解为对发明范围的限制。
实施例材料用作缓冲液和底物的化学药品是至少试剂纯的商品。
菌株镰孢属菌株A3/5，现在重新分类为Fusarium venenatum(Yoder和Christianson，1998，真菌遗传学与生物学2362-80；O’Donnell等，1998，真菌遗传学与生物学2357~67)，其得自Dr.AnthonyTrinci(Universisty of Manchester，Manchester，England) 或者美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)的镰孢属菌株ATCC 20334。Fusarium venenatum 菌株#93(BBA 64537)得自BiologischeBundensanstalt fur Land-und Fortswirtschaft，Berlin，德国。Fusarium venenatum A3/5的形态学突变体，命名为CC1-1、CC1-2、CC1-3、CC1-5、CC1-8、CC2-3、MC3-2、MC3-5、MC3-6和MC3-9(Wiebe等，1992，真菌学研究96555-562；Wiebe等，1991，真菌学研究951284~1288；Wiebe等，1991，真菌学研究96555-562)是高度分枝的菌落变体。以下菌株均来源于Fusarium venenatum A3/5的形态学突变体CC1-3Fusarium venenatum MLY3(CC1-3的一个衍生物，它与CC1-3的互补特性相同)；Fusarium venenatum JRoy36-19B(CC1-3，木聚糖酶+，bar+)；Fusarium venenatum LyMC4(CC1-3，tri5缺失，amdS+bar+.木聚糖酶+)；Fusariwn venenatum LyMC4.B(CC1-3，tri5缺失，amdS+，bar+，木聚糖酶+，LyMC4的单孢子分离物)；Fusariumvenenatum LYMC4.C(CC1-3，tri5缺失，amdS+，bar+，木聚糖酶+，LyMC4的单孢子分离物)；Fusariwn venenatum LyMC19(CC1-3，tri5缺失，andS+，bar+，木聚糖酶+)；Fusarium venenaturn LyMC19.2(CC1-3，tri5缺失，amdS+，bar+，木聚糖酶+，LyMC19的单孢子分离物)；Fusariwn venenatum LyMC19.5(CC1-3，tri5缺失，amdS+，bar+，木聚糖酶+，LyMC19的单孢子分离物)；Fusarium venenatumLyMC1(MLY3，tri5缺失)；Fusarium venenatum LyMC1A(MLY3，tri5缺失，amdS，单孢子分离物)；Fusarium venenaturn LyMC1B(MLY3.tri5缺失，amdS，单孢子分离物)；以及Fusarium venenatum LyMC1C(MLY3，tri5缺失，amdS，单孢子分离物)。
培养基和溶液AMG微量金属溶液每升含有14.3g ZnSO4·7H2O、2.5g CuSO4·5H2O、0.5g NiCl2、13.8g FeSO4、8.5g MnSO4和3.0g柠檬酸。
生物素储液为在100ml 50％乙醇中含有5mg生物素。
COVE微量金属溶液每升含有0.04g NaB4O7·10H2O、0.4gCuSO4·5H2O、1.2g FeSO4·7H2O、0.7g MnSO4·H2O、0.8g Na2MoO2·2H2O以及10g ZnSO4·7H2O。
50X COVE盐溶液每升含有26g KCl、26g MgSO4·7H2O、76g KH2PO4以及50ml COVE微量金属溶液。
COVE培养基每升含有342.3g蔗糖、20ml 50X COVE盐溶液、1mM乙酰胺、1.5mM CsCl2和25g Noble琼脂。
50X Vogels培养基每升含有150g柠檬酸钠、250g KH2PO4、10gMgSO4·7H2O、10g CaCl2·2H2O、2.5ml生物素储液以及5.0ml AMG微量金属溶液。
COVE顶层琼脂糖每升含有20ml 50X COVE盐、0.8M蔗糖、15mM氯化铯、10mM乙酰胺和10g低熔点琼脂糖，pH调至6.0。
NY50培养基每升含有62.5g Nutriose 725、2g MgSO4·7H2O、10gKH2PO4、2g K2SO4、2g柠檬酸、10g酵母提取物、2g尿素、0.5gCaCl2·2H2O和0.5ml AMG微量金属溶液，pH6.0。
NYU35培养基每升含有35g麦芽糖糊精、1g MgSO4·7H2O、2g KH2PO4、2g柠檬酸、4g酵母提取物、1g尿素和0.25ml AMG微量金属溶液，pH6.0。
RA生孢培养基每升含有50g琥珀酸、12.1g NaNO3、1g葡萄糖、20ml50X Vogels和0.5ml 10mg/ml NaMoO4储液，pH6.0。
YEG培养基每升含有5g酵母提取物和20g葡萄糖。
YEP培养基每升含有10g酵母提取物和20g蛋白胨。
YEPG培养基每升含有10g酵母提取物、20g蛋白胨和20g葡萄糖。
基本培养基每升含有6g NaNO3、0.52g KCl、1.52gKH2PO4、1ml COVE微量金属溶液、1g葡萄糖、500mg MgSO4～7H2O、342.3g蔗糖以及20g Noble琼脂(pH6.5)。
STC含有0.8M山梨醇、25mM Tris(pH8)、25mM CaCl2。
SPTC含有40％PEG4000、0.8M山梨醇、25mM Tris pH8、25mM CaCl2。
M400Da培养基每升含有50g麦芽糖糊精、2g MgSO4～7H2O、2g KH2PO4、4g柠檬酸、8g酵母提取物、2g尿素以及1ml COVE微量金属溶液。
生孢III培养基每升含有20ml 50X Vogels、4g葡萄糖、0.8gNaNO3和1ml 10mg/ml NaMoO4储液。
含有BASTATM的Vogels培养基(第一阶段种子接种)每升含有20ml50X Vogels、5％葡萄糖、16.5一元碱磷酸铵以及5mg BASTATM/ml，pH6.5。
用于挑选niaD突变体的氯酸钾培养基每升含有20ml 50X COVE盐溶液、61.28g氯酸钾、0.3g尿素、25g noble琼脂和2％高温灭菌后加入的葡萄糖。
氟乙酰胺培养基每升含有12g醋酸钠、2g氯化钠、0.5g MgSO4、3gKH2PO4、0.3g尿素、2g氟乙酰胺、1ml Vogels盐和15g Noble琼脂，pH6.1。
TAE缓冲液每升含有4.84gTris碱、1.14ml冰醋酸以及2ml 0.5MEDTA，pH8.0。
实施例1提取Fusarium venenatum ATCC 20334基因组DNA将Fusarium venenaturn ATCC 20334在25ml YEG培养基中于28℃、150rpm生长24小时。然后经Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)过滤收集菌丝，并用25ml 10mM Tris-1mM EDTA(TE)缓冲液洗一次。从菌丝上吸去多余的缓冲液，随后将菌丝冷冻在液氮中。在电咖啡磨中将冷冻的菌丝磨成细粉，粉末加入一次性塑料离心管中的20mlTE缓冲液和5ml 20％w/v十二烷基硫酸钠(SDS)中。将混合体系轻轻地颠倒几次以确保混匀，用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)抽提两次。加入醋酸钠(3M溶液)至终浓度0.3M，用2.5体积的冰冷乙醇沉淀核酸。将试管在15,000xg离心30分钟，沉淀风干30分钟，然后重悬于0.5ml TE缓冲液中。加入无DNase的核糖核酸酶至浓度为100mg/ml，混合物于37℃保温30分钟。然后加入蛋白酶K(200mg/ml)，将混合物于37℃再保温1小时。最后，用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)将混合物抽提两次，然后按照常规操作用醋酸钠和乙醇沉淀DNA。将DNA沉淀真空下干燥，重悬于TE缓冲液，储存在4℃。
实施例2制备Fusarium venenatum ATCC 20334 trichodiene合成酶探针在拟分枝孢镰孢、早熟禾镰孢和虱状赤霉的trichodiene合成酶的保守氨基酸序列基础上，用Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA合成仪，按照制造商的说明，合成下列寡核苷酸引物，以便PCR扩增来自Fusarium venenatum ATCC 20334基因组DNA的trichodiene合成酶基因片段。
引物15’-GGCTGCTCATCACTTTGCTC-3’引物25’-TGCATGAAGCACTCAATCGT-3’用大约0.8μg如实施例1所描述制备的Fusarium venenatum基因组DNA作为模板来制备扩增反应体系(50μl)。每个反应体系中含有以下成分0.8μg基因组DNA、40pmol引物1、40pmol引物2、dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM、1×Taq DNA聚合酶缓冲液(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)和2.5单位Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)。反应体系在一台设定30个循环的Perkin-ElmerModel 480热循环仪中保温，每循环为95℃3分钟，58℃2分钟，72℃2分钟。在1.5％琼脂糖凝胶(Eastman Kodak，Rochester，NY)上分离反应产物，从凝胶上切下812bp的产物条带并用Qiaex II(Qiagen，Chatsworth，CA)按照制造商的说明进行纯化。随后将纯化过的PCR产物克隆至pCRII载体(Invitrogen.San Diego，CA)中，利用lac正向和反向引物(New England BioLabs，Beverly，MA)确定DNA序列。
将所扩增的基因片段与拟分枝孢镰孢、早熟禾镰孢和虱状赤霉trichodiene合成酶基因序列进行序列比较，在此基础上的DNA序列分析表明扩增的基因片段编码相应Fusarium venenatum trichodiene合成酶基因的一部分。按照制造商的说明，利用DIG试剂盒(BoehringerMannheim Corp.，Indianapolis，IN)将trichodiene合成酶基因片段(812kb)经PCR标记上洋地黄毒苷以便探测Fusarium venenarum基因组DNA文库。
实施例3DNA文库及tri5克隆的鉴定利用噬菌体克隆载体λZipLox(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，以大肠杆菌Y1090ZL细胞(Life Technologies，Gaithersburg，MD)作为铺板和纯化重组噬菌体的宿主，大肠杆菌DH10Bzip(Life Technologies，Gaithersburg，MD)作为切割单个pZLl-tri5克隆的宿主来构建基因组DNA文库。用Tsp509I将总细胞DNA部分消化，并在1％琼脂糖凝胶上按大小分离。将迁移到3-8kb范围内的DNA片段切下，并用Qiaex(Qiagen Inc.，Chatsworth CA)从凝胶上洗脱下来。洗脱下来的DNA片段与经EcoRI切割并去磷酸化的λZipLox载体臂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)进行连接，用商品化包装提取物(Stratagene.La Jolla，CA)将连接体系包装。包装好的DNA文库铺板并在大肠杆菌Y1090ZL细胞(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中扩增。扩增好的基因组文库含有1.4×107pfu/ml。采用常规操作(参见，Sambrook等，1989，同前)，用实施例2中描述的非放射性洋地黄毒苷通过噬斑杂交对来自文库的大约30,000个噬斑进行筛选。
挑出与探针强杂交的3个阳性克隆，其中的两个在大肠杆菌Y1090ZL细胞中纯化两次。随后从λZipLox载体中切下两个tris5克隆pSMO129和pSMO130，作为pZL1-tri5克隆(D’Alessio等，1992，Focus1476)。
实施例4Fusarium venenatum tri5基因的DNA序列分析在Applied Biosystems 373A型自动DNA测序仪(AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)对tri5克隆pSMO129和pSMO130进行DNA测序。除了lac-正向和lac-反向引物，还按照制造商的说明在Applied Biosystems 394型DNA/RNA合成仪上合成特异性寡核苷酸测序引物。
对命名为pSMO129和pSMO130的克隆进行的DNA测序表明，两个克隆都不含有基因的完整序列，但含有重叠序列，从其中得到了完整基因的DNA序列。由两个序列组合得到的DNA序列揭示出一个开放读码框，如图2所示(SEQ ID NO.1)。
由两个重叠克隆pSO130和pSO129构建含有完整基因片段的一个克隆。用限制酶SacI消化pSO129和pSO130，然后在1％琼脂糖凝胶上走胶。用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)从胶上分离合适的片段，并采用常规方法于14℃过夜连接从而产生pTri5。然后通过常规方法将连接产物转化到大肠杆菌菌株DH5α中。用QiagenMaxiPrep kit(Qiagen，Chiatsworth CA)从推测的全长克隆中分离质粒DNA，并用Applied Biosystems 373A型自动测序仪将DNA测序，测序结果证实该序列与SEQ ID NO1相同。该克隆命名为大肠杆菌DH5αpTri5。
基于推测氨基酸序列(SEQ ID NO.2)与相应早熟禾镰孢trichodiene合成酶基因产物(SEQ ID NO.3)的比对，确定了Fusariumvenenatum ATCC 20334 trichodiene合成醇基因的内含子和外显子位置。根据这一比较，Fusarium venenatum ATCC 20334 trichodiene合成酶基因含有2个外显子(1-469bp和529-1203bp)，中间被1个小内含子(470-528 bp)打断。该内含子的大小和组成与其他真菌基因的内含子(Gurr等，1987，在Kinghorn，J.R.编的《真核微生物的基因结构》中93-139页，IRL Press，Oxford)一致，因为它含有共有剪接供体和受体序列以及靠近每个间插序列3’端的共有套索序列(PuCTPuAC)。
Trichodiene合成酶是一种由380个氨基酸(MW＝44562)构成的酸性蛋白质(计算的等电点＝5.37)。
采用Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)对trichodiene合成酶的推测氨基酸序列进行比较比对，所述方法使用了有一个相同性表格和以下多重比对参数的LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)缺口罚分为10，缺口长度罚分为10，成对比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5，以及对角线＝5。
比较比对表明Fusarium venenatum ATCC 20334 trichodiene合成酶的推测氨基酸序列与早熟禾镰孢trichodiene合成酶(Fekete etal.，1997，真菌病理学13891-97)(SEQ ID NO.3)相同性大约为96.3％。
实施例5pJRoy36的构建构建pJRoy36以便在Fusarium venenatum中表达Thermomyceslanuginosus(以前称为Humicola lanuginosa)木聚糖酶。
利用剪接重叠延伸的技术使1.2kb尖镰孢胰蛋白酶启动子与1.1kb尖镰孢胰蛋白酶终止子(SP3S7)融合在一起从而构建pDM181。在启动子和终止子之间插入一个含有SwaI，KpnI和PacI限制位点的多接头作为重叠PCR策略的一个步骤。在启动子5’末端加上一个XhoI位点，保留天然的EcoRI位点。经PCR反应在终止子3’末端引入EcoRI，HindIII和NsiI位点。
利用以下引物由质粒pJRoy20(Royer等，1995，生物技术131479-1483)制备含有尖镰孢胰蛋白酶启动子-1208至-1以及一个25碱基对的多接头的PCR片段引物1(有义)XhoIEcoRI5′-GAGCTCGAGGAATTCTTACAAACCTTCAAC-3’
引物2(反义)PacIKpnI SwaI5′-TTAATTAAGGTACCTGAATTTAAATGGTGAAGAGATAGATATCCAAG-3’100μl PCR反应体系中含有1X Pwo缓冲液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM，10ng pJRoy20和5单位Pwo DNA聚合酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。所用PCR条件为95℃ 3分钟，然后以95℃ 30秒、50℃ 1分钟，72℃ 1分钟作25个循环。最后的延伸循环为72℃ 5分钟。
采用相同的PCR条件，利用以下引物由质粒pJRoy20制备第二个PCR片段，该片段含有尖镰孢胰蛋白酶启动子-5到-1位碱基、一个25碱基对的多接头以及1060碱基对的尖镰孢胰蛋白酶基因3’非翻译区(终止子区域)引物3(有义)SwaI KpnIPacI5′-TCACCATTTAAATTCAGGTACCTTAATTAAATTCCTTGTTGGAAGCGTCGA-3’引物4(反义)NsiI HindIII EcoRI5′-TGGTATGCATAAGCTTGAATTCAGGTAAACAAGATATAATTT-3’用0.2μl第一次PCR(启动子)反应体系和3μl第二次(终止子)反应体系作为模板以及引物1和4获得最后的2.3kb重叠PCR片段，该片段含有尖镰孢胰蛋白酶启动子-1208到-1位、25碱基对多接头以及1060碱基对的尖镰孢胰蛋白酶终止子。所用PCR条件是95℃ 3分钟，随后以95℃ 30秒、62℃ 1分钟以及72℃ 3分钟作30个循环。最后的延伸循环是72℃ 5分钟。该反应中还使用了Pwo DNA聚合酶。
用EcoRI消化得到的2.3kb片段(含有胰蛋白酶启动子、多接头和胰蛋白酶终止子)并连接至EcoRI消化的含有bar基因的载体pMT1612(WO9726330)从而产生pDM181(图3)。
所述木聚糖酶片段同样经PCR制备。含有Thermomyceslanuginosus木聚糖酶基因cDNA的质粒pHD414(WO 93/11249)作为模板。用PCR引物5和6在木聚糖酶编码序列的5’末端导入序列CCACC，在3’末端导入PacI位点。
引物5(有义)5’-CCACCATGGTCGGCTTTACCCCCGTT-3，引物6(反义)5’-GGTTAATTAATTAGCCCACGTCAGCAACGGT-3’PacI所用PCR条件是95℃3分钟，随后以95℃ 1分钟、62℃ 1分钟以及72℃3分钟作25个循环。反应体积如前面的描述。其中包含5％v/v的DMSO。
用PacI消化得到的0.7kb木聚糖酶片段并连接至用SwaI/PacI消化的pDM181形成质粒pJRoy36(图4)。
实施例6构建Fusarium venenatum JRoy36-19B并表达木聚糖酶基因如下制备Fusarium venenatum CC1-3的孢子用来自补充了2.5％葡萄糖和2.5mM硝酸钠的1X Vogels培养板(2.5％Noble琼脂)的10个琼脂块接种含有500ml RA生孢培养基的摇瓶，于28℃，150rpm培养2到3天。经Miracloth(Calbiochem，San Diego，CA)收集孢子，并在Sorvall RC-5B离心机(E.I.DuPont De Nemours and Co..Wilmington，DE)中于7000rpm离心20分钟。用无菌蒸馏水将沉淀的孢子洗两次，重悬于少量水中，然后用血球计数板计数。
如下制备原生质体用4×107个Fusarium venenatum CC1-3孢子接种100ml YEPG培养基，并于24℃、150rpm培养16小时。将培养物在Sorvall RT 6000D(E.I.DuPont Dc Nemours and Co.，Wilmington，DE)于3500rpm离心7分钟。用30ml 1M MgSO4将沉淀洗两次，重悬于15ml溶于1M MgSO4的5mg/ml NOVOZYME 234TM(批号PPM 4356，NovoNordisk A/S，Bagsvserd，Denmark)中。将培养物于24℃和150rpm保温至形成原生质体。向原生质体消化液中加入35ml 2M山梨醇，混合物于2500rpm离心10分钟。将沉淀重新悬浮，用STC洗两次，于2000rpm离心10分钟以便沉淀原生质体。用血球计数板计原生质体数，重悬于8∶2∶0.1的STC∶SPTC∶DMSO溶液至终浓度为1.25×107个原生质体/ml。将原生质体在Nalgene Cryo 1℃ Freezing Container(VWRScientific，Inc.San Francisco，CA)中控速冷冻后，保存于-80℃。
在冰上融化Fusarium venenatum CC1-3的冷冻原生质体。向50ml无菌聚丙烯试管中加入5μg实施例5中描述的pJRoy36和5μg肝素(5mg/mlSTC)。加入100μl原生质体，轻轻混匀，并在冰上保持30分钟。加入1ml SPTC，于室温温育20分钟。加入25ml 40℃的COVE顶层琼脂糖(补充了10-25mM硝酸钠代替10mM乙酰胺和10mM氯化铯)后，将混合物倒在一个空的150mm直径平板上，于室温保温过夜。然后将25ml 40℃COVE顶层琼脂糖(补充了10-25mM硝酸钠代替10mM乙酰胺和10mM氯化铯，并且每ml含有10mg BASTATM)倒在平板上面，于室温温育长达14天。除草剂BASTATM中的活性成分是膦丝菌素。BASTATM购自AgrEvo(Hoechst Schering，Rodovre，Denmark)，使用前用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取两次，氯仿∶异戊醇(24∶1)提取一次。
将转化子平板(如上述COVE下层，COVE-BASTATM覆盖上层)中的琼脂栓块接种到含有30ml M400Da培养基的摇瓶中，并于30℃，150rpm培养7天。在7天中从摇瓶中取样，分析上清液中的木聚糖酶活性。
如下确定木聚糖酶活性。将90μl含有溶于0.1M磷酸钠(pH6.0)缓冲液的0.5％AZO-WAXTM(Megazyme，Dublin，Ireland)的底物溶液加入10μl各份在0.1M磷酸钠(pH6.0)缓冲液中适当稀释的酶样品溶液中，从而起始反应。反应体系于50℃保温30分钟，然后加入500μl已经用0.55μl浓盐酸酸化的乙醇来终止反应。将得到的混合物在室温保持至少10分钟，但不超过60分钟。然后将样品于12,000rpm离心2分钟。取200μl每份上清液转移到微量培养板上，并于600nm测定光吸收。利用标准曲线，对照购自Novo Nordisk A/S(Bagsvaerd，Denmark)的BIOFEED WHEATTM标准品计算活性。标准曲线是加入10、20、40、60、80、90和100μl标准液(1.0 FXU/ml)绘制的。为此，首先制备10 FXU/ml的标准液，然后用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)1∶10稀释作为工作标准液。利用线性回归绘制标准曲线时包括一个空白样(以缓冲液代替酶)。
在木聚糖酶检测结果的基础上，挑选出单个转化菌落，命名为pJRoy36-19.B。
实施例7构建pJRoy40制备缺失质粒pJRoy40，该质粒含有由BglII位点连接在一起的Fusarium venenatum tri5基因的大约1.5kb 5’侧翼DNA和1.5kb 3’侧翼DNA。用NotI和BglII消化实施例3中描述过的pSO129和pSO130。将含有载体pZLl加上tri5 DNA之0-1694位碱基的5.5kb的pSO130片段与1.5kb的pSO129片段连接在一起，后一个片段对应tri5 DNA之5413-6946位碱基加上一个小多接头。这样产生了pJRoy40(图5)，它含有1.5kb的tri5 5’DNA和1.7kb的tri5 3’DNA。tri5的编码区是2475-3678位碱基。接近3.7kb的包含整个tri5编码区的DNA被去掉了。
实施例8构建tri5∷amdS缺失片段用BglII消化pJRoy40，这样在5’和3’区之间形成连接点。用Klenow片段按照Sambrook等(1989，同前)的描述补平末端，使用TAE缓冲液经1％琼脂糖凝胶电泳纯化被线性化的载体，并经琼脂糖酶处理。然后如Sambrook等(1989，同前)所述用小牛肠碱性磷酸酶处理载体。从pBANe20(图6)中分离amdS基因，并作为补平片段插入pJRoy40的BglII位点从而得到pLC30(图7)。
用QIAquick凝胶提取试剂盒从pLC30经凝胶纯化分离含有tri5缺失盒的5670 bp EcoRI片段。用凝胶纯化过的缺失片段转化Fusariumvenenatum JRoy36-19B的原生质体。
实施例9构建tri5杂交探针经PCR扩增获得DIG标记的探针。对于5’探针(“tri5侧翼探针″)，扩增反应体系含有以下成分50ng pSO130，DIG标记的dATP、dCTP、dGTP和dTTP各100mM，引物tri55’探针5’-AACTGGAAAGACCTGTGGGC-3’(bp928-947)和pSO130 5’-1442探针5’-GGGAAATAGTGTCACGCGGTA-3’(bp1379-1399)各50pmole，2单位Taq DNA聚合酶以及1x Taq DNA聚合酶缓冲液。反应体系在设定30个循环的Perkin-Elmer热循环仪中保温，每个循环为95℃ 1分钟、55℃ 1分钟，72℃ 90秒。用GenElute SpinColumns(Supelco，Bellefonte，CA)将得到的片段(“tri5侧翼探针″)经凝胶分离，根据制造商的说明用DIG Quantification Test Strips(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)定量。
制备开放读码框探针(″tri5开放读码框探针″)的条件相同，只是使用以下引物引物970590 5’-GGACAACAGCCGAACTCAAAC-3’(bp2036-2057)和引物970478 5’-GTGCTGCGGATAAGGTTC-3’(bp2919-2937)。同上将得到的片段(″tri5开放读码框探针″)分离并纯化。
按照上面的描述通过扩增相同PCR产物来制备荧光素标记的探针。按照制造商的说明，用QlAquick凝胶提取试剂盒将产物凝胶纯化。利用用于荧光成像仪(Amersham，Sunnyvale，CA)的“Random PrimeLabeling Module”，按照制造商的说明将纯化过的片段标记上荧光素。
实施例10用缺失片段取代Fusarium venenatum JRoy36-19B的天然tri5基因如下制备Fusarium venenatum JRoy36-19B的孢子用来自琼脂平板(每ml含有5mg BASTATM)的10个琼脂栓块接种含有500ml RA生孢培养基的摇瓶，于28℃，150rpm培养2到3天。经Miracloth收集孢子，并在Sorvall RC-5B离心机中于7000rpm离心20分钟。用无菌蒸馏水将沉淀的孢子洗两次，重悬于少量水中，然后用血球计数板计数。
如下制备原生质体用4×107个Fusarium venenatum JRoy36-19B的孢子接种100ml YEG培养基，并于24℃、150rpm培养16小时。将培养物在Sorvall RT 6000D中于3500rpm离心7分钟。沉淀用30ml 1M MgSO4洗两次，重悬于20ml溶于1M MgSO4的5mg/ml NOVOZYME 234TM中。将培养物于24℃和150rpm保温至形成原生质体。向原生质体消化液中加入35ml 2M山梨醇，混合物于2500rpm离心10分钟。将沉淀重新悬浮，用STC洗两次，于2000rpm离心10分钟以便沉淀原生质体。用血球计数板计原生质体数，重悬于8∶2∶0.1的STC∶SPTC∶DMSO溶液至终浓度为1.25×107个原生质体/ml。将原生质体在Nalgene Cryo 1℃ FreezingContainer中控速冷冻后，保存于-80℃。
在冰上融化Fusarium venenatum JRoy36-19B的冷冻原生质体。向50ml无菌聚丙烯试管中加入5μg实施例8中描述的凝胶纯化过的tri5缺失片段。加入100μl原生质体，轻轻混匀，并在冰上保持30分钟。加入1ml SPTC，于室温温育20分钟。加入25ml 40℃的COVE顶层琼脂糖后，将混合物倒在一个150mm直径COVE琼脂平板上。转化平板于室温温育长达14天。
在COVE平板上生长需要具有利用乙酰胺作为氮源的能力，这就表明整合了amdS基因，由此挑选出转化子。有超过145个转化子(来自20次转化)在COVE平板上生长，检测其中20个转化子的4，15-diacetoxyscirpenol(DAS)产量。
按照以下方案诱导产生DAS。通过将2升Fernbach摇瓶中的500ml RA生孢培养基接种上12个从基本培养基平板上切下来的琼脂栓块(5×5mm)来制备孢子储液。Fernbach摇瓶于28℃、150rpm培养40小时。然后经无菌Miracloth将培养物收集到50ml无菌Falcon试管中，用血球计数玻片计数后将浓度调到2×107个孢子/ml。孢子储液可立即或于5℃储存1或两周后使用。
将2ml 2×107孢子/ml孢子储液(新制备的或者存放了1或两周的)接种到装在250ml有挡板的玻璃摇瓶中的50ml MYRO培养基中，作3份。摇瓶于28℃、220rpm，在光照下培养7天。7天后，用无菌Miracloth将每个摇瓶的内容物过滤，测量其pH，进行DAS分析前储存在-20℃。
通过略有改进的McCormick等(1990，同前)的方法提取DAS并定量。用两体积的乙酸乙酯(2.0ml)将无细胞Fusarium venenatum培养液样品(1.0ml)提取两次。将合并在一起的有机提取物在氮气流下蒸发至干燥，并用50微升TriSil/TBT(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)于80℃衍生60分钟。然后用己烷将最后的样品体积调到0.5ml。
在配备了30米DB-1柱(J&W Scientific.Folsom，CA；直径250微米，膜厚0.25微米)和FID检测器的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪上分析1微升样品。注射步骤使用不分拆模式(splitless mode)，具有260℃入口，氮气载体气体流速1.2ml/min.。烤箱程序是起始温度180℃；以30℃每分钟加热到210℃；以5℃每分钟加热到260℃；维持终温度2分钟。对蛇形菌素进行的鉴定和定量基于购自Sigma ChemicailCo.(St Louis，MO)的标准物质进行。在此情况下，DAS的检测极限为2ppm。
所检测的20个转化子中有12个不产生可检测到的DAS。将来自这12个转化子的COVE平板琼脂栓块按照以下方案接种到三个摇瓶中分析木聚糖酶。用种子逐级放大方法来接种摇瓶培养物。给补充了5mgBASTATM/ml的30ml Vogels培养基中接种来自每株受测菌的新鲜平板琼脂栓块，然后于28℃、200rpm培养3天。再用150μl每种培养物接种含有5mg BASTATM/ml的30ml NY50培养基。于28℃、200rpm生长2天后，取1.5ml每种培养物转移到30ml不含BASTATM的NYU35培养基中，在相同条件下培养4-7天。在第4-7天从摇瓶中取样，分析上清液的木聚糖酶活性。然后将木聚糖酶产量最高的3个菌株作Southern分析以便证实tri5基因已缺失。
用Vistra试剂盒(Amersham，Arlington，IL)和Rapid Hyb Kit(Amersham，Arlington，IL)按照制造商的说明作Southern杂交。Fusarium venenatum JRoy36-19B推断缺失子的真菌基因组DNA是用DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)按照制造商的说明制备的。用Sphl和Dral消化1μg基因组DNA并在琼脂糖凝胶上电泳。变性和中和后，用Turboblotter(Schleicher & Schuell，Keene，NH)将基因组DNA转移至Hybond-N+膜(Amersham.Arlington，IL)上。与Rapid Hyb在60℃预杂交后，将膜与变性探针(见下文)在60℃过夜杂交。按照制造商的说明将膜显影，用STORM860(Molecular Dynamics.Sunnyvale，CA)扫描。
“tri5侧翼探针”(荧光素标记的，实施例9)与amdS插入片段上游的5’侧翼区756个核苷酸杂交。“tri5开放读码框探针″(荧光素标记的，实施例9)与tri5 ATG下游大约450个核苷酸杂交。
Southern杂交的结果证实了在3个DAS阴性、高产木聚糖酶转化子Fusarium venenatum LyMC4、LyMC19和LyMC21中tri5基因缺失。与tri5的5’侧翼区杂交的探针与一个条带发生杂交，该条带对应缺失构建体的大小，但该探针不与对应天然tri5基因的条带杂交，这表明缺失构建体已取代了该区域。此外，与tri5开放读码框结合的探针没有与这些菌株杂交，表明基因已丢失。
实施例11以膦丝菌素抗性选择生长的Fusarium venenatum LyMC4、LyMC19和LyMC21的木聚糖酶产生Fusarium venenatum LyMC4、LyMC19和LyMC21从实施例10中描述的原始COVE转化平板上传代培养到含有5mg/ml BASTATM的平板上，并于28℃培养7-10天。按照实施例10中概括描述的木聚糖酶检测法，用来自这些分离物的BASTATM平板的琼脂栓块接种3个摇瓶。在第4、5、6和7天从摇瓶中取样，检测上清液。
按照实施例6的描述测定第4、5、6和7天从摇瓶中取出的样品的木聚糖酶活性。Fusarium venenatum LyMC4和LyMC19与亲本菌株Fusarium venenatum JRoy36-19B产生的木聚糖酶量相当或高于它，进一步分析这些菌株。
实施例12分析木聚糖酶高产缺失子Fusarium venenatum LyMC4和LyMC19
如实施例6所述在BASTATM培养基上挑出两个Fusarium venenatum高产菌株LyMC4和LyMC19的单孢子分离物。维持对每个菌株的5个单孢子分离物的膦丝菌素抗性选择。
如实施例10所述对得自这5个单孢子分离物的基因组DNA进行Southern杂交分析。
Southern杂交证实所有单孢子分离物中均缺失了tri5基因。用与tri5基因缺失区上游结合的荧光素标记探针(″Tri5侧翼探针″)进行探测时，与Fusarium venenatum JRoy36-19B的天然tri5区条带的大小相比，所有菌株都有一个对应着缺失盒大小的条带。亲本菌株Fusariumvenenatum LyMC19有一个对应着野生型tri5基因的微弱条带，这可能说明少数核未发生缺失。但是，所有得自该菌株的单孢子分离物都有缺失。当同样是这些菌株与能结合tri5开放读码框的荧光素标记探针(“Tri5开放读码框探针”)杂交时，只有Fusarium venenatumJRoy36-19B和Fusarium venenatum LyMC19有与tri5的开放读码框对应的条带。Fusarium venenatum LyMC 19的该条带非常微弱，该菌株的单孢子分离物都没有条带，说明可能在单孢子纯化之前，多数核就已缺失了tri5基因。来自两次杂交的数据表明在所有单孢子分离物中tri5开放读码框都已被amdS缺失盒取代。
实施例13Fusarium venenatum LyMC4和LyMC19的衍生菌株的DAS检测利用实施例10中描述的方案分析单孢子分离物Fusariumvenenatum LyMC4.B、LyMC4.C、LyMC19.2和LyMC19.5，亲本菌株Fusarium venenatum LyMC4和LyMC19，以及对照菌株的DAS产量。
所有菌株生长在3套摇瓶中，在同一轮中进行检测。每次检测的结果列于表1，最后1栏显示平均DAS产量。在能诱导野生型Fusariumvenenatum菌株#93(BBA 64537，Biologische Bundensanstalt furLand-und Fortswirtschaft，Berlin，Germany)高产DAS的条件下，tri5缺失的菌株都没有产生可检测量的DAS。
表1.LyMC4和LyMC19单孢子分离物的DAS产量F.venenatum菌株 DAS产量平均DAS产量(ppm) (ppm)a. b. c.
#93 347 355 301 334A3/5136 15 91 47CC1-3 29 26 24 26JRoy36-19B24 29 24 26LyMC4 0 0 0 0LyMC4.B 0 0 0 0LyMC4.C 0 0 0 0LyMC190 0 0 0LyMC19.2 0 0 0 0LyMC19.5 0 0 0 01得自Dr.Anthony Trinici(Universitv of Manchester，Manchester，England)的Fusarium venenatum Quorn种子瓶。
实施例14Fusarium venenatum LyMC4.B、LyMC4.C、LyMC19.2和LyMC19.5的发酵Fusarium venenatum LyMC4.B、LyMC4.C、LyMC19.2和LyMC19.5的发酵在2升发酵罐中于30℃进行8天，发酵罐所含培养基每升有20g蔗糖、2.0g MgSO4·7H2O、2.0g KH2PO4、2.0g柠檬酸·H2O、2.0g CaCl2·2H2O、0.5ml AMG微量金属溶液(灭菌前将pH调至4.5)，以及过滤除菌的每升含有2.5g尿素的混合物和培养基灭菌并冷却后加入的30ml大豆维生素混合物。补料是蔗糖和尿素的分批高温灭菌混合物。
与类似的Fusarium venenatum JRoy36-19B发酵相比，所有单孢子分离物产生等量的木聚糖酶。
实施例15构建Fusarium venenatum N-2通过在氯酸钾培养基上进行选择，由Fusarium venenatum CCl-3形态学突变体制备Fusarium venenatum菌株N-2。菌株能在补充了2％葡萄糖和10mM亚硝酸钠、酒石酸铵、次黄嘌呤或者尿酸的1X Vogels培养基上生长，却不能在补充2％葡萄糖和10mM硝酸钠的1X Vogels培养基上生长，这证明它有niaD表现型。
实施例16构建tri5缺失构建体pJRoy41用BglII消化pJRoy40，按照Sambrook等(1989，同前)所述用Klenow片段补平末端。使用TAE缓冲液经1％琼脂糖凝胶电泳纯化线性化的载体，并经过琼脂糖酶处理。然后按照Sambrook等(1989，同前)所述用小牛肠碱性磷酸酶处理载体。用NotI和SrfI消化从pNit3(Fu和Marzluf，1987，同前)中取下粗糙脉孢菌的nit3基因。限制酶反应体系用Klenow片段处理，并进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳使用TAE缓冲液。利用琼脂糖酶分离含有nit3基因的4886bp片段。
将nit3基因片段克隆至pJRoy40的填平的BglII位点从而产生pJRoy41(图8)。在这个载体中，Fusarium venenatum基因组中含有tri5基因的3.7kb片段被含有粗糙脉孢菌nit3基因的4.9kb片段代替。
实施例17Fusarium venenatum N-2的转化和转化子分析以2种不同方式制备用于产生Fusarium venenatum N-2的原生质体的生物质。对第1批，用5个Fusarium venenatumN-2琼脂栓块(1cm)接种50ml YEPG培养基，于26℃和150rpm培养3天。用其中10ml培养物另外接种100ml YEPG培养液，在制备原生质体前于200rpm、28℃培养20小时。制备第2批原生质体时，将Fusarium venenatum N-2琼脂栓块接种到RA生孢培养基中，该培养基含有0.1M Na2HPO4和0.1M NH4H2PO4来代替硝酸钠，再加上0.05％葡萄糖。培养物于28℃和200rpm生长4天。用10ml第1级培养物接种含有500ml培养液的Fernbach摇瓶，培养液每升含有10g琥珀酸、0.1M NH4H2PO4、0.1M K2HPO4、1x COVE盐和0.5g葡萄糖，将摇瓶于26℃、150rpm培养65小时。从该培养物中获得大约108个孢子。用这些孢子接种50ml YEPG培养基，于24℃、150rpm生长13.5小时。如实施例6所述制备原生质体并保存在-80℃。
用pJRoy41(不切割，在多接头的NotI位点线性化或者是在3’侧翼序列中的NheI位点线性化)转化Fusarium venenatum N-2的原生质体。如实施例6所述用pJRoy41进行转化，不同的是将反应体系用50ml 40℃的上层培养基铺在空的150mm平板上，该上层培养基含有1x COVE盐、0.8M蔗糖、25mM硝酸钠和1％低熔点琼脂糖。
由经NotI消化的pJRoy41获得4个转化子；由经NheI消化的pJRoy41得到2个，未消化质粒得到32个。
实施例18推测的Fusarium venenatum tri5缺失转化子的基因组DNA的制备采用以下方案从实施例17描述的推测的Fusarium venenatum tri5缺失转化子中制备基因组DNA。所述转化子在25ml YEG培养基中于30℃、250rpm生长72小时。然后经Miracloth过滤收集菌丝体，用25ml 10mMTris-1mM EDTA(TE)缓冲液洗1次，从菌丝上吸去多余的缓冲液，随后冷冻在液氮中。将冷冻的菌丝在电咖啡磨中磨成细粉，将粉末加入一次性塑料离心管中的20ml TE缓冲液和5ml 20％w/v十二烷基硫酸钠(SDS)中。将混合物轻轻地颠倒几次以确保混匀，用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)抽提两次。加入醋酸钠(3M溶液)至终浓度0.3M，然后加入2.5体积的冰冷乙醇沉淀核酸。将试管在15,000×g离心30分钟收集核酸沉淀，沉淀风干30分钟，然后重悬于0.5ml TE缓冲液中。加入无DNase的核糖核酸酶A至浓度为100mg/ml，混合物于37℃保温30分钟。然后加入200mg/ml的蛋白醇K，混合物于37℃再保温1小时。最后，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1v/v/v)将混合物抽提两次，然后如前所述用醋酸钠和乙醇沉淀DNA。将DNA沉淀在真空下干燥，重悬于TE缓冲液，储存在4℃待用。
实施例19PCR筛选tri5基因缺失作PCR预筛来检验实施例17中分离到的转化子中是否缺失了tri5基因。所设计的反应中使用的引物能从完整tri5 DNA扩增出一个1.1kb的条带，但无法由那些tri5编码区已被nit3基因取代的DNA扩增出条带。使用引物551 5’-CGGTATCGAATGTACTCGAG-3’(Tri5 bp 2524-2544)和510 5’-CCCATGGTGTGAACACC-3’(tri5 bp 1397-1414)进行PCR反应。反应体系含有2.5μl DMSO、1μl Taq DNA聚合酶、2.5mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP各5μl，5μl 10xPCR缓冲液、0.5-1μg转化子基因组DNA(实施例18)，上述引物50pmol/μl各2μl，及适量的水补至50μl。进行反应使用1个循环的97℃ 5分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟，然后以97℃1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟作30个循环。
将未能产生1.1kb条带(对应完整的tri5基因)的转化子培养在补充了25mM NaNO3的液体Vogels培养基中，并如实施例10的描述进行DAS分析。在这些生长条件下，某些转化子没有产生可测水平的DAS，而阳性对照一致产生大约10ppm的DAS(表2)。
表2.推测的tri5缺失子的DAS和Southern分析一览表菌株 DAS(ppm) tri5 5’探针 tri5 orf探针CC1-3 10 5.9 +N2-119ND 5.9 +N2-1 ND*7.1 -N2-8 ND 7.1 -N2-13 ND 7.1 -N2-103ND 7.1 -N2-106ND 7.1 -N2-118ND 7.1 NT**N2-10111 5.9，7.1 +N2-10219 5.9，7.1 +N2-10418 5.9，7.1 +N2-10535 5.9，7.1 +
*ND没有检测到**ND未测对在诊断性PCR反应中没有产生1.1kb条带的菌株也进行了Southern分析。如实施例18所述制备的推测Fusarium venenaturntri5缺失菌株的基因组DNA用DraI/SphI消化。片段在1％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液经电泳分离。以5X SSC作为虹吸转膜缓冲液将DNA过夜转移至Nytran Plus膜上。膜在DIG Easy Hyb中于65℃预杂交2小时。用DIG标记的″tri5侧翼探针″(实施例9)作杂交。随后将膜于室温在2XSSC-0.1％SDS中洗两次，各15分钟，然后于68℃在0.1X SSC-0.1％SDS中洗两次，各15分钟。按照常规DIG方法，将洗过的膜处理并在室温对Kodak X-OMAT AR胶片曝光大约1小时，然后按制造商的说明用KonicaQX-70自动胶片处理机显影。
当使用DIG标记的″tri5侧翼探针″时，用DraI/SphI消化的野生型菌株的基因组DNA含有一个5932bp的杂交条带，缺失质粒中有一个7100bp的杂交条带。5.9kb条带对应着野生型tri5基因，而7.1kb条带对应着nit3基因取代了tri5基因的DNA。有几个转化子产生了分别对应完整tri5基因和缺失质粒的两个条带。在这些菌株中，缺失片段发生了异位整合，因此tri5基因未被缺失。然而，Fusarium venenatum转化子N2-1、N2-8、N2-113、N2-103、N2-106和N2-118都只含有指示着缺失质粒的7.1kb条带。
来自这些推测缺失子的基因组DNA还与DIG标记的“tri5开放读码框探针”(实施例9)进行了杂交。除1例外，所有那些在与5’探针杂交时显示标志缺失质粒的单个条带的菌株都不含有能与tri5的开放读码框探针杂交的条带。由表3可见，多数被DAS分析确定为tri5缺失子的菌株也被Southern分析确定为tri5缺失子。这一数据表明Fusariumvenenatum菌株N2-1、N2-8、N2-113、N2-103和N2-106的tri5基因缺失。
实施例20在Fasarium venenatum中产生无nit3标记的tri5缺失通过用含有来自缺失构建体pJRoy40(实施例7)的5’和3’侧翼DNA的EcoRI片段转化Fusarium venenatum N2-8菌株来去掉该缺失子中的nit3基因。原生质体制备和转化如实施例10所述进行。加入10ml补充有0.8M蔗糖作为渗透剂的YEPG培养基后，使转化反应体系于室温再生24小时。然后将再生原生质体浓缩，在无菌水中经离心(10分钟，2000×g)清洗，以5×106/ml的密度铺到氯酸钾培养基上。氯酸盐培养基上长出几百个菌落。对其中的100个菌落根据它们在亚硝酸钠、酒石酸铵、次黄嘌呤和尿酸上生长的能力以及不能在硝酸钠上生长的能力进行分析。鉴定到大约50个niaD突变体。
用“tri5侧翼探针”如实施例9所述对其中的20个突变体进行Southern分析。1个转化子(N2-8-1)含有一个表明丢失了nit3基因的条带。对niaD突变体(N2)、nit3/tri5取代的菌株N2-8和推测的切除菌株N2-8-1重复进行Southern杂交。来自这些菌株的DNA用NheI和NruI消化，并用“tri5侧翼探针”检测。结果显示在N2菌株中存在一个6436bp的条带，它与野生型tri5基因是一致的；nit3/tri5取代菌株N2-8中有一个7604bp的条带，与nit3取代了tri5基因的情况符合。在切除菌株N2-8-1中杂交条带的大小降到2718bp，与nit3基因被切除的情况相符。
实施例21在Fusarium venenatum菌株MLY3中产生无amdS标记的tri5缺失如图9所示在Fusarium venenatum表达宿主MLY3的基因组中产生未标志的tri5缺失。首先将tri5基因缺失，然后用侧翼是分离自米曲霉pyrG基因(WO9812300)上游区的重复DNA序列的amdS基因代替它。然后通过生长在含有氟乙酰胺的平板上来挑选amdS基因被去除的分离物。
通过在构巢曲霉amdS基因的侧翼导入同向重复序列，并将得到的amdS盒亚克隆到tri5缺失载体pJRoy40(实施例5)中从而构建质粒pLC31b。
起始步骤是制备pJRoy43，该质粒含有pNEB193(New EnglandBiolabs)，其中PacI和XbaI位点被一个SwaI位点代替。为了达到这一目的，通过将下面两个寡核苷酸一起退火来形成一个在5’末端含有BamHI位点，在中部有SwaI位点，在3’端有SalI位点的多接头5’-GATCGATTTAAAT-3’5’-TCGAATTTAAATC-3’将产生的接头连接到已经用BamHI和SalI消化的pNEB193中从而形成pJRoy43。
接下来，选择米曲霉pryG基因上游一个230bp的区域作为Fusariumvenenatum中的重复序列。用以下两组引物对-引物3和4以及引物5和6将米曲霉pyrG质粒pJaL335(WO 98/12300)中的这一区域扩增成两个不同产物引物35′-CGAATTTCATATTTAAATGCCGACCAGCAGACGGCCCTCG-3′引物45′-GCGATATCATGATCTCTCTGGTACTCTTCG-3′引物55′-GCGATATCATCGACCAGCAGACGGCCCTCG-3′引物65′-GCGTTTAAACATGATCTCTCTGGTACTCTTCG-3′用大约40-50ng基因组DNA作为模板来制备扩增反应体系(50μl)，所述基因组DNA是用DNeasy Plant Mini试剂盒制备的。每个反应体系含有以下成分40-50ng基因组DNA、引物3和4或者引物5和6各50pmol、dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM、1X Taq DNA聚合酶缓冲液和2.5单位的Taq DNA聚合酶。将反应体系在如下设定的Perkin-Elmer480型热循环仪中温育第1轮在94℃ 2.5分钟，72℃ 2.5分钟；第2-26轮分别为94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 2分钟；第27轮为94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 10分钟。
在1％琼脂糖凝胶上分离反应产物，分离出大约230bp的片段。第一PCR产物(大约230bp的片段)在5’末端含有SwaI位点，3’末端含有EcoRV位点，而第二PCR产物(大约230bp的片段)在5’末端含有EcoRV位点，3’末端含有PmeI位点。将这两个纯化过的重复片段首先用EcoRV消化，然后连接在一起。纯化(苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀)后，用PmeI和SwaI消化连接产物从而产生一个大约500bp的片段，将该片段经琼脂糖凝胶电泳和琼脂糖酶处理纯化。
将得到的片段克隆至用PmeI和SwaI消化的pJRoy43以产生pJRoy44(图10)。该载体含有所述两个230bp的重复片段，它们被一个EcoRV位点分开，侧翼是SwaI和PmeI位点。
从p3SR2(Kelly和Hynes，1985，EMBO杂志4475-479)的亚克隆中分离到一个含有amdS基因和调控区的EcoRI片段，用Klenow片段将其制成平末端，连接到用EcoRV消化的pJRoy44中产生pJRoy47(图11)。用SwaI和PmeI消化该载体，将含有侧翼是如上所述的同向重复序列的amdS基因的片段连接到用BglII消化、Klenow处理过的JRoy40中产生pLC31b(图12)，在该质粒中含有tri5编码区的3.7kb片段已被含有侧接有230bp重复序列的构巢曲霉amdS基因的3kb片段取代。
然后用EcoRI消化得到的质粒pLC31b，在转化前用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)纯化含有tri5缺失盒的6.1kbEcoRI片段。
如实施例6所述制备Fusarium venenatum MLY3的原生质体，然后用凝胶纯化过的6.1kb EcoRI缺失片段转化。将转化子铺COVE平板以便挑选amdS基因整合的转化子。在得到的3个转化子中通过Southern杂交证明天然tri5基因已被缺失盒取代。使用制造商提供的Amersham(Arlington，IL)Vistra and Rapid Hyb方案或者BochringerMannheim DIG System方案作Southern杂交。推测的缺失子的真菌基因组DNA利用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen Chatsworth，CA)来制备。按照制造商的说明将膜显影，对于探针是荧光素标记的用STORM860(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)扫描膜，或者对于DIG标记的探针对胶片曝光。“tri5侧翼探针”在amdS插入点上游765个核苷酸的5’侧翼区域内发生杂交。
将全部3个转化子生孢，并用显微操作仪分离单孢子。再使这3个缺失转化子的各3个单孢子分离物(共9株菌)生孢子。将已证实的tri5缺失子的1×106个孢子铺到9个150mm含有氟乙酰胺培养基的平板之一上，这样来挑选出丢失amdS标记的菌株。将这些平板在室温下培养长达2周。形成的菌落在COVE平板和新的氟乙酰胺平板上进行传代培养。在氟乙酰胺平板上生长良好，而在COVE平板上生长差或者不生长的菌落作进一步分析。在308个能在氟乙酰胺平板上生长的分离物(FA+)中，有3个不能在COVE平板上生长(COVE-)，1个在COVE平板上生长非常弱，但它们在氟乙酰胺平板上很好。Southern杂交显示这3个COVE-菌株仍含有amdS基因，而在COVE上生长弱的那个菌株有一个与“环出”预计大小相符的条带。将这个命名为LyMC1的缺失子生孢子，从单孢子中获得3个分离物。Southern印迹结果证实在一个转化子和来自该转化子的3个孢子纯化分离物LyMC1A、LyMC1B和LyMC1C中tri5缺失，amdS基因丢失。如实施例6所述制备3个转化子的孢子，但要使用Vogels硝酸盐培养基，并于24℃培养72小时。用显微操作仪分离单孢子。
重复序列间的同源重组应造成整个amdS基因的缺失。为了证实完全丢失了该基因，用以下分别与tri5基因的3’和5’侧翼区杂交的引物PCR扩增该缺失区GAGa3.35′-GGTAGCACGAGTGTCTGG-3′Tox5’5′-AACTGGAAAGACCTGTGGGC-3′用大约40-50ng各个缺失子的基因组DNA作为模板来制备扩增反应体系(50μl)，所述基因组DNA是用DNeasy Plant Mini试剂盒制备的。每个反应体系含有以下成分40-50ng基因组DNA，正向引物和反向引物各50pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM、1X Taq DNA聚合酶缓冲液和2.5单位的Taq DNA聚合酶。将反应体系在如下设定的Perkin-Elmer480型热循环仪中温育第1轮在94℃ 2.5分钟，72℃ 2.5分钟；第2-26轮分别为94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 2分钟；第27轮为94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 10分钟。
在1％琼脂糖凝胶上分离反应产物，从凝胶上切下一个990bp的产物条带，依照制造商的说明克隆到来自TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)的pCR2.1中，然后用它转化One ShotTOP10细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用Qiagen QIAprep-8试剂盒从得到的转化子中制备DNA，并用EcoRI限制酶消化进行分析。将质粒在ABI PRISM 377 DNA测序仪(ABI，Foster City，CA)上测序。缺失区的PCR扩增和测序证明发生了一个完全的环出，只有一个230bp的重复片段留在tri5基因位点。这个重复片段含有5’重复序列的5’末端和3’重复序列的3’末端，这说明在两个重复序列之间发生了同源重组。
如实施例10所述测定3个经孢子纯化的缺失子、Fusariumvenenatum MLY3和野生型Fusarium venenatum菌株BBA 64537的DAS产量，但要使用Vogels硝酸盐培养基来生孢子。表3显示了该分析的DAS结果。3个tri5缺失子LyMC1A、LyMC1B或LyMC1C都未产生可检测量的DAS，而野生型Fusarium venenatum菌株BBA64537和Fusariumvenenatum MLY3产生了可检测量的DAS。
表3.tri5缺失的Fusarium venena tum菌株的DAS分析菌株DAS(ppm)*3个数值的均值(+/-S.E.)BBA 64537 318(+/-31)MLY329(+/-11)LyMC1A ＜2LyMC1B ＜2LyMC1C ＜2*检测极限2ppm.
生物材料的保藏以下生物材料已根据布达佩斯条约保藏在农业研究机构专利培养物保藏中心(Northern Regional Research Center(NRRL)，Peoria，Illinois)，并给予了下列保藏号保藏物保藏号 保藏日期大肠杆菌DH5α pTri5NRRL B-300291998年5月6日菌株的保藏保证在该申请的待审期间，由根据37 C.F.R.ξ1.14和35 U.S.C.ξ122授权的专利与商标委员会确定的人员可以获得该保藏物。保藏物代表所述保藏菌株的基本纯培养物。在本申请的副本或其后续申请提交的国家，可以根据外国专利法索要该保藏物。但应当明白，保藏物的可用性并不构成对损害由政府行为授予的专利权来实施本发明的许可。
此处描述和请求保护的发明并不限于文中具体公开的实施方案的范围，因为这些实施方案仅用于阐述本方面的几个方面。任何等同的实施方案都应看作在本发明范围内。的确，由前面的描述，对文中显示和描述的发明进行各种改进对本领域技术人员是显而易见的。这些改变同样应视为落在所附权利要求书的范围内。
文中引用了许多参考文献，此处均是全文引入作为参考。
序列表<110>John C.RoyerLynne M.ChristiansonGregory A.GambettaHoward BrodySuzanne M.OtaniWendy T.Yoder<120>在单端孢菌毒素缺陷的丝状真菌突变细胞中产生异源多肽的方法<130>5563.204-WO<140>待定<141>1999-05-20<150>09/082,217<151>1998-05-20<160>3<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>6946<212>DNA<213>镰孢<400>1gaattctctc agtcggcctc atctggcagg tgctaatata ttctacccgc gcttggctac 60ctatgccaca cacaaagctt catgtttggt tcatatcgta tactcgcttc aacagttctg 120cgggtacgac tctcgtatgg atgtaataaa caaatgttcc gacctattat gccgagttac 180cgtggacaat tatcgggccg gaaaagaatg catttgtgaa ttgtaatcct gcctgtttgt 240ggagtgataa gtgacatatt ggaaaagtcg tcaagcaatt ggaggtttca tcaactgtgg 300agtcatcgtt ttgggcaaac aatactatgt agggtaggct tctgctgcag catcaatgac 360tcgtttggat cgagtccttt tgttgccaag gcgtatgggg cctgcaggga acgagtcagt 420cgtatcaggc cggtgaggca aatgccgttt cgcagcagct atcatttgtc gcgggatttt 480cgcgaagctt tgcgtgacga gtcaaatccg cacatcttga ttcatgagtt gttgaattta 540gctgttcatt cgtgagtggc taaagcgtat ctagtcgatt gtcaaattca gacttgacag 600gtcccttgat gaatgagacg tcggatgtcc ctagccgaga tgcggattgt gacaacggaa 660gagacagggg cagggttcat gggtgttgaa ccttgttcac tgaaacggtg atgtctttgg 720tctacaaagt atccttcaca tgtctctgtt cccagaccac gtggttattc tggcatccgg 780gtcctattga ttggctgatt tcttgcactg atacatacaa ataagtccaa gactgtattc 840tactggcaaa attatgccga caaggggaaa tcattctgaa ttagtgatga agcatgccgt 900cgaagccgaa gagaaacttt gcgcagcaac tggaaagacc tgtgggctgt agagcgcaca 960gcacggtagt aagacctacg gccctggtat catggttgta gcctcttccg tattgctcac1020atatccaccg gttttctaca taaacagtct gagtcctgat agtggatatt atatcttcca1080ggacctagtc taggtagtag tcggcatttg aaacgcctag tggcaagaga tcgcttagcc1140tccagcctgg caatatcgcg gcttcctcag gttgtaccac gaatgatgat ctcaattgtg1200cttcccctgt cgtgaatttg ctagtgcgac gggacttgcc aggcttacgg cacctacaag1260tcgcgccagc cttctgacag tgattgtatg caagatcgtc attagttatg attaagcttt1320gataaacaag agcgccacag cctttcttta actccgacaa cctcaacggt gacatgcata1380ccgcgtgaca ctatttccca tggtgtgaac accatcaatg acttagagta gataaccact1440tgaaacttct agaaatgtcc aagaaactac actcagtgtt tcatagaact aagacaatgt1500tcattgaagg atgggatttg agactccgta ctgcttcacc tcggaaaata agcactgttt1560agcacccgtt aagccaagtc cttcaaacgt ggggacggat ttaaccaaca gcagagtgga1620taagcctgta ctctactcat tgaatgtata taatacattg ctaggtacat acgcagcttt1680
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195 200 205Glu Ile Thr Ser Ala Ile Ala Gln Met Glu Asn Trp Met Val Trp Val210 215 220Asn Asp Leu Met Ser Phe Tyr Lys Glu Phe Asp Asp Glu Arg Asp Gln225 230 235 240Ile Ser Leu Val Lys Asn Tyr Val Val Ser Asp Glu Ile Thr Leu His245 250 255Glu Ala Leu Glu Lys Leu Thr Gln Asp Thr Leu His Ser Ser Lys Gln260 265 270Met Val Ala Val Phe Ser Asp Lys Asp Pro Gln Val Met Asp Thr Ile275 280 285Glu Cys Phe Met His Gly Tyr Val Thr Trp His Leu Cys Asp His Arg290 295 300Tyr Arg Leu Asn Glu Ile Tyr Glu Lys Val Lys Gly Gln Lys Thr Glu305 310 315 320Asp Ala Gln Lys Phe Cys Lys Phe Tyr Glu Gln Ala Ala Asn Val Gly325 330 335Ala Val Ser Pro Ser Glu Trp Ala Tyr Pro Pro Ile Ala Gln Leu Ala340 345 350Asn Ile Arg Ser Lys Asp Val Lys Asp Val Lys Asp Val Lys Glu Ile355 360 365Gln Lys Pro Leu Leu Ser Ser Ile Glu Leu Val Glu370 375 380<210>3<211>377<212>PRT<213>镰孢<400>3Met Glu Asn Phe Pro Thr Glu Tyr Phe Leu Asn Thr Ser Val Arg Leu1 5 10 15Leu Glu Tyr Ile Arg Tyr Arg Asp Ser Asn Tyr Thr Arg Glu Glu Arg20 25 30Ile Glu Asn Leu His Tyr Ala Tyr Asn Lys Ala Ala His His Phe Ala35 40 45Gln Pro Arg Gln Gln Gln Leu Leu Iys Val Asp Pro Lys Arg Leu Gln50 55 60Ala Ser Leu Gln Thr Ile Val Gly Met Val Val Tyr Ser Trp Ala Lys65 70 75 80Val Ser Lys Glu Cys Met Ala Asp Leu Ser Ile His Tyr Thr Tyr Thr85 90 95Ieu Val Leu Asp Asp Ser Ser Asp Asp Pro Tyr Ala Ala Met Met Asn100 105 110Tyr Phe Asn Asp Leu Gln Ala Gly Arg Glu Gln Ala His Pro Trp Trp115 120 125Ala Leu Val Asn Glu His Phe Pro Asn Val Leu Arg His Phe Gly Pro130 135 140Phe Cys Ser Leu Asn Leu Ile Arg Ser Thr Leu Asp Phe Phe Glu Gly145 150 155 160Cys Trp Ile Glu Gln Tyr Asn Phe Gly Gly Phe Pro Gly Ser His Asp165 170 175Tyr Pro Gln Phe Leu Arg Arg Met Asn Gly Leu Gly His Cys Val Gly180 185 190Ala Ser Leu Trp Pro Lys Glu Gln Phe Asp Glu Arg Ser Leu Phe Leu195 200 205Glu Ile Thr Ser Ala Ile Ala Gln Met Glu Asn Trp Met Val Trp Val210 215 220Asn Asp Leu Met Ser Phe Tyr Lys Glu Phe Asp Asp Glu Arg Asp Gln225 230 235 240
Ile Ser Leu Val Lys Asn Tyr Val Val Ser Asp Glu Ile Ser Leu His245 250 255Glu Ala Leu Glu Lys Leu Thr Gln Asp Thr Leu His Ser Ser Lys Gln260 265 270Met Val Ala Val Phe Ser Asp Lys Asp Pro Gln Val Met Val Thr Ile275 280 285Glu Cys Phe Met His Gly Tyr Val Thr Trp His Leu Cys Asp His Arg290 295 300Tyr Arg Leu Asn Glu Ile Ser Glu Lys Val Lys Glu Gln Lys Thr Glu305 310 315 320Asp Ala Gln Lys Phe Cys Lys Phe Tyr Glu Gln Ala Ala Asn Val Gly325 330 335Ala Val Ser Pro Ser Glu Trp Ala Tyr Pro Pro Val Ala Gln Leu Ala340 345 350Asn Val Arg Ser Lys Asp Val Lys Asn Val Lys Gln Ile Glu Lys Pro355 360 365Leu Leu Ser Ser Ile Glu Leu Val Glu370 37权利要求
1.一种制备分泌异源多肽的方法，包括(a)在有利于多肽产生的条件下培养亲本丝状真菌细胞的突变体，其中(i)该突变体包含编码所述分泌的异源多肽的第一核酸序列和含有对至少一个参与产生单端孢菌毒素之基因的修饰的第二核酸序列，(ii)培养在相同条件下时，该突变体产生的单端孢菌毒素少于亲本丝状真菌细胞；和(b)从培养基中分离所述多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述丝状真菌细胞是支顶孢属，曲霉属，短梗霉属，隐球酵母属，线黑粉菌属，镰孢属，赤霉属，腐质霉属，Magnaporthe，毛霉属，毁丝霉属，漆斑菌属，Neocallimastix，脉孢菌属，拟青霉属，青霉属，Piromyces，皱褶菌属，踝节菌属，热子囊菌属，梭孢壳属，Tolypocladium或者木霉属菌株。
3.权利要求1的方法，其中所述丝状真菌细胞是镰孢属菌株。
4.权利要求3的方法，其中所述镰孢属细胞是Fusariumvenenatum细胞。
5.权利要求4的方法，其中所述Fusarium venenatum细胞是Fusarium venenatum ATCC20334。
6.权利要求4的方法，其中所述Fusarium venenatum细胞是一种形态学突变体。
7.权利要求6的方法，其中所述Fusarium venenatum细胞是Fusarium venenatum ATCC20334的形态学突变体。
8.权利要求1-7任何一项所述的方法，其中的基因选自tri3、tri4、tri5、tri6、tri11、tri12、tri101。
9.权利要求1-8任何一项所述的方法，其中的基因是tri5或trichodiene合成酶基因。
10.权利要求1-9任何一项所述的方法，其中的基因是tri3基因。
11.权利要求1-10任何一项所述的方法，其中的基因是tri4基因。
12.权利要求1-11任何一项所述的方法，其中的基因是tri6基因。
13.权利要求1-12任何一项所述的方法，其中的基因是tri11基因。
14.权利要求1-13任何一项所述的方法，其中的基因是tri12基因。
15.权利要求1-14任何一项所述的方法，其中的基因是tri101基因。
16.权利要求1-15任何一项所述的方法，其中的突变细胞培养在相同条件下时，比亲本丝状真菌细胞产生的单端孢菌毒素少至少大约25％。
17.权利要求1-16任何一项所述的方法，其中的突变细胞不产生单端孢菌毒素。
18.权利要求1-17任何一项所述的方法，其中的丝状真菌细胞包含至少两个拷贝的第一核酸序列。
19.权利要求1-18任何一项所述的方法，其中的异源多肽是一种激素、激素变体、酶、受体或其一部分、抗体或其一部分或者是一种报道蛋白。
20.权利要求19的方法，其中所述酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。
21.权利要求20的方法，其中所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
22.权利要求1-21任何一项所述的方法，其中的突变细胞还包含1或多个第三核酸序列的1或多个修饰，这些修饰使所述1或多个第三核酸序列的表达减少或消除。
23.权利要求22的方法，其中所述1或多个第三核酸序列独立地编码一种选自下组的酶氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
24.权利要求22的方法，其中所述1或多个第三核酸序列独立编码氨肽酶、羧肽酶或蛋白酶。
25.权利要求1-24任何一项所述的方法，其中包含对至少一个参与产生单端孢菌毒素之基因的修饰的第二核酸序列未被选择标记标志。
26.一种丝状真菌细胞的单端孢菌毒素缺陷型突变细胞，其中包含编码一种分泌的异源多肽的第一核酸序列和含有对至少一个负责产生单端孢菌毒素之基因的修饰的第二核酸序列，该突变体培养在相同条件下时比其亲本丝状真菌细胞产生的单端孢菌毒素少。
27.权利要求26的突变细胞，其中所述丝状真菌细胞是支顶孢属，曲霉属，短梗霉属，隐球酵母属，线黑粉菌属，镰孢属，赤霉属，腐质霉属，Magnaporthe，毛霉属，毁丝霉属，漆斑菌属，Neocallimastix，脉孢菌属，拟青霉属，青霉属，Piromyces，皱褶菌属，踝节菌属，热子囊菌属，梭孢壳属，Tolypocladium或者木霉属菌株。
28.权利要求26的突变细胞，其中所述丝状真菌细胞是镰孢属菌株。
29.权利要求28的突变细胞，其中所述镰孢属细胞是Fusariumvenenatum细胞。
30.权利要求29的突变细胞，其中所述Fusarium venenatum细胞是Fusarium venenatum ATCC20334。
31.权利要求29的突变细胞，其中所述Fusarium venenatum细胞是一种形态学突变体。
32.权利要求31的突变细胞，其中所述Fusarium venenatum细胞是Fusarium venenatum ATCC20334的形态学突变体。
33.权利要求26-32任何一项所述的突变细胞，其中的基因选自tri3、tri4、tri5、tri6、tri11、tri12、tri101。
34.权利要求26-33任何一项所述的突变细胞，其中的基因是tri5或trichodiene合成酶基因。
35.权利要求26-34任何一项所述的突变细胞，其中的基因是tri3基因。
36.权利要求26-35任何一项所述的突变细胞，其中的基因是tri4基因。
37.权利要求26-36任何一项所述的突变细胞，其中的基因是tri6基因。
38.权利要求26-37任何一项所述的突变细胞，其中的基因是tri11基因。
39.权利要求26-38任何一项所述的突变细胞，其中的基因是tri12基因。
40.权利要求26-39任何一项所述的突变细胞，其中的基因是tri101基因。
41.权利要求26-40任何一项所述的突变细胞，其中突变细胞培养在相同条件下时，比亲本丝状真菌细胞产生的单端孢菌毒素少至少大约25％。
42.权利要求26-41任何一项所述的突变细胞，其中突变细胞不产生单端孢菌毒素。
43.权利要求26-42任何一项所述的突变细胞，其中的丝状真菌细胞包含至少两个拷贝的第一核酸序列。
44.权利要求26-43任何一项所述的突变细胞，其中的异源多肽是一种激素、激素变体、酶、受体或其一部分、抗体或其一部分或者是一种报道蛋白。
45.权利要求44的突变细胞，其中所述酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。
46.权利要求45的突变细胞，其中所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
47.权利要求26-46任何一项所述的突变细胞，其中的突变细胞还包含对1或多个第三核酸序列的1或多个修饰，这些修饰使所述1或多个第三核酸序列的表达减少或消除。
48.权利要求27的突变细胞，其中所述1或多个第三核酸序列独立地编码一种酶选自下组的氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
49.权利要求47的突变细胞，其中所述1或多个第三核酸序列独立编码一种氨肽酶、羧肽酶或蛋白酶。
50.权利要求26-49任何一项所述的突变细胞，其中包含对至少一个参与产生单端孢菌毒素之基因的修饰的第二核酸序列未被选择标记标志。
51.获得权利要求26-50任何一项所述突变细胞的方法，包括(a)向亲本丝状真菌细胞中导入一个核酸序列，该核酸序列包含对至少一个负责产生单端孢菌毒素的基因的修饰；和(c)对来自步骤(a)的突变体进行鉴定，其中该突变体培养在相同条件下时比其亲本丝状真菌细胞产生的单端孢菌毒素少。
52.一种得自Fusarium venenatum菌株的分离的trichodiene合成酶，其选自下组(a)具有与SEQ ID NO2至少97％相同性的氨基酸序列的trichodiene合成酶；(b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列之trichodiene合成酶的包含1或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；(c)(a)或(b)的等位基因变体；以及(d)(a)或(c)的具有trichodiene合成酶活性的片段。
53.权利要求52的trichodiene合成酶，其具有与SEQ ID NO2至少97％相同性的氨基酸序列。
54.权利要求52的trichodiene合成酶，其包含氨基酸序列SEQID NO2或其片段。
55.权利要求52的trichodiene合成酶，其包含氨基酸序列SEQID NO2。
56.权利要求52-55任何一项的trichodiene合成酶，其得自Fusarium venenatum ATCC20334。
57.权利要求52的trichodiene合成酶，其由大肠杆菌NRRLB-30029中包含的质粒pTri5携带的核酸序列编码。
58.一种分离的核酸序列，其包含编码权利要求52-57任何一项所述的trichodiene合成酶的核酸序列。
59.一种包含权利要求58所述核酸序列以及与之可操纵地连接的1或多个指导在合适表达宿主中产生trichodiene合成酶的调控序列的核酸构建体。
60.一种包含权利要求59所述核酸构建体的重组表达载体。
61.一种包含权利要求59所述核酸构建体的重组宿主细胞。
62.一种制备权利要求52-57任何一项所述trichodiene合成酶的方法，包括(a)培养Fusarium venenatum菌株来制备包含trichodiene合成酶的上清液；和(b)回收trichodiene合成酶。
63.一种制备trichodiene合成酶的方法，包括(a)在适合产生trichodiene合成酶的条件下培养权利要求61所述的宿主细胞；和(b)回收trichodiene合成酶。
64.一种获得突变细胞的方法，包括(a)向具有编码第一基因产物的第一核酸序列的亲本细胞中导入第一核酸构建体，该第一核酸构建体包含作为选择标记的硝酸还原酶基因和对第一核酸序列的修饰，其中第一核酸构建体掺入到亲本细胞的基因组中，从而以修饰过的第一核酸序列取代内源的第一核酸序列，使得在相同条件下培养时，第一基因产物的产量较之亲本细胞减少；和(b)选择来自步骤(a)的有硝酸还原酶基因并且第一基因产物产量减少的突变细胞。
65.权利要求64的方法，其中还包括(c)在培养条件下选择来自步骤(b)的硝酸还原酶基因被缺失的突变细胞。
66.权利要求64的方法，其中还包括(c)向来自步骤(b)的突变细胞导入包含第二核酸序列的第二核酸构建体，所述第二核酸序列含有被修饰的第一核酸序列的5’和3’区，但缺少硝酸还原酶基因，其中该第二构建体掺入到亲本细胞的基因组中，以所述第二核酸序列取代被修饰的第一核酸序列；以及(d)在培养条件下挑选来自步骤(c)的缺失硝酸还原酶基因的突变细胞。
67.通过权利要求64-66任何一项所述方法获得的突变细胞。
68.一种制备多肽的方法，包括(a)在有利于所述多肽产生的条件下培养权利要求67所述包含编码该多肽的核酸序列的突变细胞；以及(b)从突变细胞的培养基中分离该多肽。
69.一种向细胞内含有的靶核酸序列中引入改变的方法，包括(a)通过向亲本细胞内导入核酸构建体来获得该亲本细胞的突变细胞，所述核酸构建体包含硝酸还原酶选择标记基因，侧翼是核苷酸序列重复区，形成标记盒，其中所述重复区包含靶DNA 5’紧邻的核苷酸序列或3’紧邻的核苷酸序列；并且其中当侧翼核苷酸序列重复区含有靶DNA 5’的核苷酸序列时，该核酸构建体还在标记盒的3’相邻处包含具靶DNA序列3’的核苷酸序列的另一核苷酸序列；当侧翼核苷酸序列重复区含有靶DNA 3’的核苷酸序列时，该核酸构建体还在标记盒的5’相邻处包含具靶DNA序列5’的核苷酸序列的另一核苷酸序列；(b)选择来自步骤(a)的有硝酸还原酶基因的突变细胞；(c)在能使硝酸还原酶基因通过侧翼核苷酸序列重复区之间的重组而缺失的条件下培养挑选出来的突变细胞，(d)选择靶核酸序列中具有改变的突变细胞，其中该突变细胞内硝酸还原酶基因已被缺失。
70.由权利要求69所述方法获得的突变细胞。
71.一种制备多肽的方法，包括(a)在有利于所述多肽产生的条件下培养权利要求70所述的包含编码该多肽的核酸序列的突变细胞；以及(b)从突变细胞的培养基中分离该多肽。
全文摘要
本发明涉及制备多肽的方法，包括(a)在有利于多肽产生的条件下培养亲本丝状真菌细胞的突变体，其中(i)该突变体包含编码所述多肽的第一核酸序列和含有对至少一个参与产生单端孢菌毒素之基因的修饰的第二核酸序列，(ii)培养在相同条件下时，该突变体产生的单端孢菌毒素少于亲本丝状真菌细胞；和(b)从培养基中分离所述多肽。本发明还涉及丝状真菌细胞的突变体以及获得突变细胞的方法。本发明又涉及分离的trichodiene合成酶及编码该酶的分离的核酸序列。本发明另外涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及制备trichodiene合成酶的方法。本发明最后涉及包含对基因进行了无标记修饰的突变细胞以及获得和利用这样的突变细胞的方法。
文档编号C12P21/02GK1500882SQ0315880
公开日2004年6月2日 申请日期1999年5月20日 优先权日1998年5月20日
发明者J·C·罗耶, J C 罗耶, L·M·克里斯琴森, 克里斯琴森, G·A·甘贝塔, 甘贝塔, H·布鲁迪, 车, S·M·奥塔尼, 奥塔尼, W·T·约德, 约德 申请人:诺沃奇梅兹生物技术有限公司