专利名称：具有高直链淀粉含量水稻的培育方法
技术领域：
本发明涉及植物学科，尤其涉及作物育种与植物基因工程领域，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。更具体地说，本发明涉及改变水稻胚乳淀粉生物合成的基因表达，从而在水稻胚乳生产具高直链淀粉分子组分的淀粉。
背景技术：
近几十年来，由于矮化育种和杂种优势的利用，我国水稻品种的亩产和总产有了大幅度的增加，食用稻米生产已相对过剩。我国稻米品质育种在80年代初起步，二十多年来已取得了瞩目的进展，育成了一批各有特色的优质品种。但是，目前高产优质品种不多，优质米的生产无论从质量上或数量上都还未能满足人民生活水平日益提高的需要。另外，以往讲稻米品质育种，只是注意食用品质方面，对工业用的稻米品质缺乏研究甚至是空白。从目前生产上大面积应用的非糯水稻品种(作为粮食用途)的品质看，目前直链淀粉含量比较集中于两类一类是含低或较低直链粉含量的，在12～18％之间，如常规的粳稻(16～18％)、重要的籼型杂交稻亲本(以恢复系居多，12～16％)。其次是直链淀粉含量偏高的类型，如常规的早籼品种、重要的籼型杂交稻亲本(由早籼品种转育成的不育系)，它们的直链淀粉含量一般在22％以上，有的高达25％以上。另外，随着食品以及其他工业的发展，对各种特定类型淀粉的需求量不断增长。因此，应该注重开展特殊用途、专门用途稻米品种的选育，如极低直链淀粉含量、酒米、极高直链淀粉含量等工业用途品种的选育。
在稻米各种各样的用途中，适宜的直链淀粉含量是首要考虑的目标性状。对直链淀粉含量的要求往往根据食米人群的特点、工业用途不同而要求不同。作为食用粮食，人们一般都倾向于中等偏低的直链淀粉含量。但不同地区或人群的要求又有所不同，这在前面已有说明。北方以粳米为主，直链淀粉含量一般偏低，在16-18％，煮成的饭比较粘软；南方稻区以籼米为主，直链淀粉含量要求稍高一些，在20-22％之间是比较理想的。在食品工业应用上，不同直链淀粉含量的稻米也有不同的用途。低直链淀粉含量的稻米一般可用于制作婴儿食品，而直链淀粉含量高的适用于制粉、制丝、味精、酿啤、蒸谷米等。传统糕团要求以糯米为主，这是由于它的粘性较好；而酿酒时对直链淀粉含量也有一定的要求。传统的绍兴酒之类的米酒，都以糯米为原料。在糖果生产中，大量需求的是直链淀粉含量较高的淀粉和酸水解的淀粉。在纯工业利用上，目前对于高直链淀粉含量的水稻要求较为迫切。特别是在含淀粉生物降解型塑料生产中，需要高直链淀粉含量的淀粉，所得制品具有较好的机械性能。但水稻中往往缺乏这种种质资源，而在玉米等作物中已有具特高直链淀粉含量的专用品种。因此，通过一定的技术路线培育高直链淀粉含量的水稻，是符合市场需要的。
技术方案本发明的目的是提供一种通过基因工程技术来抑制水稻内源分支酶基因的表达，培育可用于工业上的一种高直链淀粉含量水稻的培育方法。
本发明技术方案是这样实现的它包括(1)制备包括编码水稻分支酶基因或其片段的嵌合基因，其中的分支酶基因或其片段的上游一侧以反义的方向可操作地连接到可在水稻种子胚乳组织中高效特异表达的启动子核酸片段上，并且其下游一侧连接到可用于转录终止的适当调控序列的核酸片段上；(2)再用嵌合基因转化水稻。
其中编码分支酶的基因可以为cDNA，也可以是基因组结构基因，这个基因或其片段的核酸片段源自水稻本身。
所述水稻分支酶包括两类，即水稻分支酶SBE1和水稻分支酶SBE3，以上两种酶分别由分支酶基因sbe1和分支酶基因sbe3编码。
其中的编码分支酶基因或其片段的核酸片段编码水分支酶SBE1和SBE3的全部或一部分。
其中的编码分支酶基因或其片段的核酸片段是以反义的结构构建在嵌合基因中，或者以可形成基于双链RNA的发夹状结构的形式构建在嵌合基因中。
构件的嵌合基因，分别制备sbe1或sbe3基因或其片段的嵌合基因，或制备同时含有上述两个基因或其片段的嵌合基因。
本发明通过基因工程技术选育具有高直链淀粉含量水稻品种的方法，可克服常规育种中高直链淀粉含量水稻资源不足的限制，直链淀粉含量最高的可达55.9％，超过现有水稻品种一倍或更多。并可生产出适用于特殊工业用途的专用水稻品种。
附图1是本发明克隆并用于构建反义嵌合基因的水稻sbe1基因的全长cDNA序列。
附图2是本发明克隆并用于构建反义嵌合基因的水稻sbe3基因的全长cDNA序列。
附图3是本发明中构建的含有反义分支酶基因的质粒结构示意图。
附图4是导入反义分支酶基因对转基因水稻种子中内源分支酶活性的影响。
具体实施例方式
本发明具体的操作程序及技术要点如下(1)分支酶基因或其基因片段的克隆。根据已公开发表的水稻分支酶基因sbe1和sbe3基因的核苷酸序列，设计引物，采用PCR技术从水稻基因组DNA中扩增这两个基因编码区的部分片段，或者采用RT-PCR技术从水稻未成熟种子胚乳总RNA中克隆出这两个基因编码区的全长或部分片段。在克隆上述基因或基因片段的同时，在被克隆基因或基因片段的5’和3’末端分别设计并加接上特定的限制性内切酶位点，以便于随后的反义嵌合基因的构建。申请人按上述方法，已成功地从水稻品种武运粳7号中克隆了编码sbe1和sbe3的全长cDNA或其部分片段。
(2)反义载体的构建。利用已克隆的sbe1和sbe3基因或其部分片段，反向地连接到可在水稻种子胚乳中特异表达的启动子下游，并在反义sbe1或sbe3基因片段的下游接上可终止基因转录的终止子(如农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子NOS)，组成反义嵌合基因。然后再将该反义嵌合基因克隆到可适用于转化水稻的载体上。其要点是①用于构建的分支酶基因或其片段，可以是编码该酶的全长cDNA，也可以编码区的部分核苷酸片段，或者是结构基因中含有编码区部分片段的核苷酸序列。
②用于指导反义分支酶基因的启动子，是使用可在水稻胚乳中特异性高表达基因的启动子，例如水稻蜡质基因、水稻谷蛋白基因或水稻分支酶基因的启动子。
③在构建反义载体时，可将sbe1和sbe3两个分支酶基因的反义基因或其片段分别构建在两个载体上，在转化时可采用共转化导入同一水稻品种中或分别导入不同水稻植株中；也可将两个反义基因构建在同一载体上，以便采用一次转化即可将两个反义基因同时导入同一个水稻品种中。
④应用RNAi技术。除采用反义RNA技术外，还可利用RNAi技术，构建可形成dsRNA的嵌合基因构件。
(3)反义分支酶基因向水稻的转化。采用农杆菌、基因枪或花粉管通道等介导的转化方法，将(2)中构建的反义分支酶嵌合基因分别导入水稻品种中。其要点是①当sbe1和sbe3两个分支酶基因的反义嵌合基因分别构建在不同的载体上时，可先分别将这两个反义基因导入不同的水稻植株中，然后再通过常规杂交聚合两个反义基因入同一转基因水稻植株中；②或者采用共转化方法，将两个反义分支酶基因同时导入同一转基因水稻植株中。
(4)转基因水稻中内源分支酶基因的表达分析。获得转基因水稻植株后，在转基因水稻植株生长期取叶片样，提取总DNA，采用PCR和Southern杂交技术鉴别反义分支酶基因的整合。然后，在水稻开花后，从水稻未成熟种子中提取总RNA进行Northern杂交分析，以检测内源分支酶基因的转录是否受到抑制；进一步可从未成熟种子或成熟种子中提取蛋白质，通过测定Q酶活性鉴别分支酶的活性是否有下降，或者查可靠地方法，即通过分支酶免疫制备的抗体采用免疫杂交技术分析特定分支酶是表达量是否有改变。
(5)转基因水稻成熟种子中淀粉组分及结构的分析。采用经典的淀粉含量分析方法，如碘比色法测定水稻成熟种子中的直链淀粉含量，以确定转基因水稻中的淀粉组成与未转化的相比有否改变；下面结合具体的最佳实施例说明实施例1利用水稻分支酶基因编码区部分片段构建反义嵌合基因，导入水稻后对转基因水稻种子中淀粉合成的影响。
(1)水稻分支酶基因编码区部分片段的克隆。以粳稻品种武运粳7号基因组总DNA为模板，用与分支酶sbe1基因特异的一对引物B1P1(5’-GATGGTGTACACTGGGATCCT-3’)和B1P2(5’-GATCCCGGGTATAGCATTGATGTAAC-3’)进行PCR扩增，分离出了长度为683bp的基因组DNA称为B1F1片段，包含有水稻sbe1基因第5外显子3’端21bp、第5内含子全序列(108 bp)以及第6外显子5’端554 bp序列。同时，又用与sbe1 cDNA特异的一对引物B1P3(5’-GAGGATCCGTGGCAATGTTCGCCTGAG-3’)和B1P4(5’-TAACCCGGGAATACGATCAACCCATG-3’)、或与sbe3 cDNA特异的一对引物B3P3(5’-GCGGATCCTGAGTAGCACGGAGCCAAAG-3’)和B3P4(5’-AGTCCCGGGTAGGCATTCCACTGACATC-3’)，从水稻品种IR36胚乳来源的cDNA文库中分别扩增出了特异性的PCR产物，分子量大小分别约为519bp和640bP，分别称为B1F2片段和B3F1片段。B1F2片段位于sbe1 cDNA的5’端，在起始密码子ATG后92bp与610bp间(包含了第2至第5外显子的序列)；B3F1片段位于sbe3 cDNA编码区的中间，在起始密码子ATG后965bp与1604bp间。
(2)反义分支酶嵌合基因表达载体的构建。为构建含反义分支酶基因片段的嵌合基因、并适宜于农杆菌介导转化水稻，将上述克隆的B1F1、B1F2和B3F1片段反向后分别插入农杆菌双元载体p1301B HS(蔡毅等，2002)中。分别构建成了由水稻分支酶sbe1基因启动子驱动的、含反义分支酶基因部分片段的3个工程质粒p13B1、p13B2和p13B3，它们T-DNA区的结构如附图2所示。同时，又构建了由水稻蜡质基因启动子控制的、含反向B1F2和B3F1片段的工程质粒p13WB1、p13WB3(附图2)。
(3)转反义分支酶基因水稻植株的获得。按申请人已建立的农杆菌介导转化水稻的程序(刘巧泉等1998，陈秀花等2001)，以粳稻品种武香粳9号以及籼稻品种龙特甫B和特青未成熟胚来源的初生愈伤组织为转化受体，通过农杆菌介导获得了将上述构建的5个含反义分支酶基因的工程质粒分别导入，并获得了较多的转基因水稻植株。大多数转基因水稻植株移栽入大田后，绝大多数能正常生长、开花并结实。
(4)转基因水稻植株胚乳中分支酶活性的分析。在转基因水稻植株开花后10天、20天和30天，从部分植株上分别取20粒种子，对其胚乳中的分支酶活性进行测定，结果见表和图4.15。由表中可见，转基因水稻植株种子胚乳中分支酶的活性较未转化对照植株中有明显下降，但不同转基因植株间以及同一转基因植株的不同种子间下降的幅度不同。由分支酶活性的分析，说明转入反义分支酶基因后，分支酶基因的表达活性受到了抑制。
(5)转基因水稻成熟种子中直链淀粉含量的变化。转基因水稻植株成熟后按单株收获种子，从每一转化子中挑选一个单株，对其成熟种子的直链淀粉含量进行分析。用碘比色法测定水稻成熟种子中的直链淀粉含量。首先对每一转化子的一个单株进行混测，每一样品做两个重复，然后从中选择直链淀粉含量提高幅度较大的植株，再对其种子进行单粒测定。部分T0代转基因水稻植株成熟种子的直链淀粉含量测定结果列于表1中。从表1中数据可见，在粳稻品种中转入反义分支酶sbe3基因(工程质粒为p13WB3，代号为B3)后，种子的直链淀粉含量有了一定程度的提高，如B3-47、B3-60与对照相比存在显著提高(t0.05)，分别提高了19.62％和14.50％。而转反义分支酶Sbe1基因的植株(工程质粒为p13WB3，代号为B1)种子中直链淀粉含量的提高不明显。将反义sbe1基因转入籼稻品种后，转基因植株成熟种子的直链淀粉含量与未转化对照植株相比，不但没有提高反而有所下降了。其中代号为B1-2(20.32％)的下降得最多，比未转化对照(27.87％)降低了27.09％。另外B1-5(24.54％)、B1-3(22.47％)、B1-4(23.27％)与未转化对照相比也都下降了，下降幅度分别为11.95％、18.94％和16.05％。当将反义sbe3基因转入籼稻后，转基因植株成熟种子的直链淀粉含量与未转化对照植株相比无明显变化。
表1 导入反义分支酶基因部分片段后转基因水稻T0代植株成熟种子中的直链淀粉
*表示与未转化对照相比，直链淀粉含量有显著提高(5％显著水平)。
实施例2利用水稻分支酶基因全长cDNA序列构建反义嵌合基因，导入水稻后对转基因水稻种子中淀粉合成的影响。
(1)水稻分支酶基因Sbe1和Sbe3 cDNA的克隆。通过改良的RT-PCR法了合成了水稻未成熟种子胚乳cDNA库，并以此为模板，用PCR技术从粳稻品种武运粳7号中克隆了分别编码SBE1和SBE1II的两个基因Sbe1和Sbe3。序列分析表明，克隆Sbe1和Sbe3基因的大小分别为2490bp和2481bp，包含了基因完整的编码序列。附图1为全长的Sbe1和Sbe3 cDNA核苷酸序列。
(2)全长反义分支酶嵌合基因表达载体的构建以及转基因水稻植株的获得。利用我们已克隆的水稻谷蛋白GT1基因翻译起始密码子上游1.3kb长的启动子区序列。将此Gt1启动子与反向的sbe1和sbe3基因全长cDNA以及Nos终止子构建成融合基因，再将这一融合基因构建在双元载体pCAMBIA1300的多克隆位点中，获得了双元载体pYH698和pYH612。鉴定正确的双元载体经冻融法导入根癌农杆菌菌株EHA105中，用于农菌介导的水稻转化。按实施例1中所述转化方法，分别将全长的反义分支酶基因sbe1和sbe3导入水稻品种武香粳9号中，获得转基因水稻植株。
(3)转基因水稻成熟种子中直链淀粉含量的变化。按实施例1中所述测定方法分析了转基因水稻植株成熟种子中的直链淀粉含量。部分T0代转基因水稻植株成熟种子的直链淀粉含量测定结果列于表2。转入反义分支酶基因后，种子的直链淀粉含量有一定程度的提高，如导入全长反义sbe3基因(转基因植株编号为612)的转基因水稻植株612-7、612-11和612-31与未转化对照相比，直链淀粉含量有显著提高(t0.05)，分别提高了18.32％、16.77％和13.19％。而转入全长反义Sbe1基因的转基因植株(代号为698)种子中的直链淀粉含量无明显提高。
表2 武香粳9号转全长反义分支酶基因水稻T0代部分植株成熟种子的直链淀粉直链淀粉含量(％)植株代号重复一 重复二 平均值698-1219.902118.577119.240698-1720.234219.421719.828698-1519.142919.649119.396698-6 19.716017.520118.618698-8 20.408318.398519.403612-7 21.865122.286922.076*612-2518.644119.232218.938612-9 20.311619.358819.835612-1121.579722.113021.846*612-3120.400921.822721.112*未转化对照18.480418.822818.652*表示与未转化对照相比，直链淀粉含量有显著提高(5％显著水平)。
实施例3将反义的sbe1和sbe3两个嵌合基因同时导入同一水稻植株后，对转基因水稻种了中淀粉合成的影响。
(1)反义sbe1和sbe3嵌合基因向同一水稻植株的聚合。采用常规杂交的方法，分别以导入有反义sbe1和sbe3嵌合基因的转基因水稻植株为父母本进行配组杂交，所获F1杂交种植成F1植株。该杂种株经PCR和Southern杂交鉴定，确实同时含有两个反义嵌合基因。
(2)聚合反义sbe1和sbe3嵌合基因的转基因水稻未成熟种子中的淀粉分支酶活性分析。表3显示聚合有两个反义分支酶基因的转基因杂种植株上未成熟种子中的淀粉分支酶活性要明显低于未转化对照植株未成熟种子中的淀粉分支酶活性。说明将sbe1和sbe3基因同时抑制后，未成熟种子中淀粉分支酶活性可明显降低。
(3)转基因杂种水稻成熟种子中的直链淀粉含量。杂种水稻种子成熟后，按单株收获。对每一单株的种子进行直链淀粉含量的测定，结果如表4所列。从表中可以看出，转基因杂种水稻成熟种子的直链淀粉含量较未转化对照有明显提高，其中单粒最高的达55.90％。说明同时抑制SBE1和SBE1II基因的表达后，确实可以较大幅度地提高水稻种子中直链淀粉的相对含量。
表3 部分转反义sbe1和sbe3基因杂种水稻未成熟种子中的淀粉分支酶活性平均值杂种编号 组合 单粒未成熟种子分支酶活性(％)(％)19.54 13.70 13.51 13.04 12.16C2905-1 协青早-sbe1/龙特甫-sbe3 10.96
10.39 9.59 8.86 7.23 1.5451.72 43.40 36.76 28.95 26.98C2913-1 协青早-sbe1/龙特甫-sbe3 28.7926.98 22.73 21.54 15.38 13.465.71 60.29 60.00 59.38 57.14C2918-4 协青早-sbe1/龙特甫-sbe3 51.8750.00 44.44 42.63 37.04 32.0850.00 27.78 22.39 20.99 18.75C2946 协青早-sbe1/龙特甫-sbe3 20.3015.94 10.14 9.43 7.2575.41 67.31 66.67 65.71 62.30C2933 协青早/龙特甫 60.7860.98 55.00 55.00 50.91 48.48
表4 转基因杂种水稻成熟种子中的直链淀粉含量混测杂种编号 组合 单粒种子直链淀粉含量(％)(％)36.95 35.87 35.84 35.81 34.85C2905-1 协青早-sbe1/龙特甫-sbe3 30.0034.58 34.15 33.97 33.20 29.7237.00 36.26 36.21 36.10 35.53C2913-1 协青早-sbe1/龙特甫-sbe3 24.3934.53 34.04 33.16 32.98 31.3932.29 31.81 31.29 30.88 30.70C2918-4 协青早-sbe1/龙特甫-sbe3 26.4730.60 30.14 29.68 28.84 28.0955.90 50.90 45.25 45.00 42.19C2910-4 龙特甫-sbe1/特青-sbe3 32.1735.88 35.50 35.00 32.50 30.9430.13 29.98 29.50 29.26 28.28C2942-3 特青-sbe1/龙特甫-sbe3 25.0226.69 24.50 23.13 22.03 21.5431.31 29.38 29.10 29.10 28.06C2878 未转化对照龙特甫/协青早 26.0727.77 27.54 27.32 27.08 26.0731.97 31.78 31.64 31.10 30.56D2918 未转化对照特青/龙特甫 27.4630.18 30.16 29.61 29.00 28.6权利要求
1.一种具有高直链淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，它包括(1)制备包括编码水稻分支酶基因或其片段的嵌合基因，其中的分支酶基因或其片段的上游一侧以反义的方向可操作地连接到可在水稻种子胚乳组织中高效特异表达的启动子核酸片段上，并且其下游一侧连接到可用于转录终止的调控序列的核酸片段上；(2)再用嵌合基因转化水稻。
2.根据权利要求1所述的具有高直链淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，其中编码分支酶的基因可以为cDNA，也可以是基因组结构基因，这个基因或其片段的核酸片段源自水稻本身。
3.根据权利要求2所述的具有高直链淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，所述水稻分支酶包括两类，即水稻分支酶SBE1和水稻分支酶SBE3，以上两种酶分别由分支酶基因sbe1和分支酶基因sbe3编码。
4.根据权利要求3所述的具有高直链淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，其中的编码分支酶基因或其片段的核酸片段编码水分支酶SBE1和SBE3的全部或一部分。
5.根据权利要求1所述的具有高直链淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，其中的编码分支酶基因或其片段的核酸片段是以反义的结构构建在嵌合基因中，或者以可形成基于双链RNA的发夹状结构的形式构建在嵌合基因中。
6.根据权利要求5所述的具有高直链淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于，构建的嵌合基因是分别制备sbe1或sbe3基因或其片种子的水段的嵌合基因，或制备同时含有上述两个基因或其片段的嵌合基因。
全文摘要
本发明涉及植物学科，尤其涉及作物育种与植物基因工程领域，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。本发明的方法是，它包括(1)制备包括编码水稻分支酶基因或其片段的嵌合基因，其中的分支酶基因或其片段的上游一侧以反义的方向可操作地连接到可在水稻种子胚乳组织中高效特异表达的启动子核酸片段上，并且其下游一侧连接到可用于转录终止的调控序列的核酸片段上；(2)再用嵌合基因转化水稻。本发明由于采用基因工程技术选育具有高直链淀粉含量水稻品种的方法，可克服常规育种中高直链淀粉含量水稻资源不足的限制，直链淀粉含量最高的可达55.9％，超过现有水稻品种一倍或更多。并可生产出适用于特殊工业用途的专用水稻品种。
文档编号C12N15/52GK1537941SQ0315835
公开日2004年10月20日 申请日期2003年9月25日 优先权日2003年9月25日
发明者顾铭洪, 刘巧泉, 于恒秀, 陈秀花 申请人:扬州大学