鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的分子标记及其方法
【专利摘要】本发明涉及一种鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的分子标记，根据能显著降低稻米垩白从而提高稻米外观品质的主效基因Chalk5的显隐性等位基因的功能突变位点开发两对特异PCR引物分子标记Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22。本发明另涉及一种鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的方法，以前述分子标记对不同水稻植株DNA进行扩增。本发明不仅能准确鉴定水稻是否含有水稻Chalk5垩白基因，亦能进一步区分Chalk5基因的纯合体和杂合体，提高对水稻粒重的选择效率。
【专利说明】
鉴别水稻里白基因 Cha I k5等位基因型的分子标巧及其方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术工程领域，特別设及一种鉴别水稻聖白基因化alk5等位基因 型的分子标记及其方法，属于生物技术工程领域，W用于化alk5等位基因型水稻种质资源 鉴定W及品种选育。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国的主要的粮食作物，种植面积和总产在我国都位居第一。中国在杂交 育种、花培育种、杂种优势利用等方面居世界领先水平。随着人们生活水平的提高，消费者 对稻米品质需求越来越高。稻米品质由加工品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质组 成，具体内容有:透明度、聖白、粒型、直链淀粉含量、胶稠度、糊化溫度、蛋白质含量W及有 无香味等等。其中的外观品质尤为重要，是水稻商品性的直接体现，决定了其在市场竞争中 的地位。聖白是衡量水稻外观品质优劣的重要指标之一，降低稻米的聖白是培育优质水稻 品种的前提。
[0003] 稻米聖白是指胚乳充实不足，胚乳中的淀粉和蛋白颗粒排列疏松，颗粒之间存在 空气，阳光照射透过其内部而致使光线发生折射形成的一种光学特性。根据其发生部位的 不同可分为背白、腹白和屯、白。由于水稻种子灌浆的顺序是从背部到腹部、从周边到中屯、， 因此水稻聖白中腹白最多，背白最少。相关研究表明，聖白与其他品质性状存在一定的相关 性。在外观品质中，李欣等认为聖白与粒形的相关性因釉、梗稻而异，釉稻米粒聖白与粒宽 呈极显著正相关，与长宽比呈极显著负相关，而梗稻米粒聖白面积与粒型、粒长没有明显相 关性。在加工品质上面，徐富贤等认为聖白与整精米率呈显著负相关。在釉稻的蒸煮食味品 质中，周少川等认为聖白与直链淀粉含量和糊化溫度呈极显著正相关，与胶稠度呈极显著 负相关，而在梗稻中，运些相关性不显著。运一结论与刘奇华等的研究结果一致。
[0004] 聖白是典型的数量性状，受多基因调控，W加性效应为主，同时也容易受到环境的 影响，如溫度、肥力水平等。因此，对聖白性状的遗传研究比较困难。不同的研究者利用不同 的遗传群体对聖白性状进行了大量的研究，鉴定了部分相关数量性状基因座 (quant;Uative化ait 1〇。;[，9化）。到目前为止共定位到85个与聖白相关的9化，其中与聖 白大小有关的WL为13个，与聖白度相关的有21个，控制聖白率的有51个，但多数研究尚停 留在WL初步和精细定位的层面上。目前已克隆的与聖白相关的基因共8个，其中6个是通过 转移DNA (化ansfer-DNA，T-DNA)插入、福射诱变、化学诱变等方式创制人工突变体而分离克 隆的，2个是利用自然突变的材料克隆的，前者的优点是能创造极端表型，等位基因效应大， 较易分离克隆，但是限制了其在育种实践中的直接应用。GW2是第一个利用自然变异克隆的 聖白相关基因，位于第2染色体上，编码一个E3泛素连接酶，它使巧粒变宽和粒重增加的同 时巧粒的聖白也增加，可能是由于粒宽增大，巧粒灌浆速度加快，从而导致聖白的产生。 化alk5是最近克隆的一个控制水稻聖白的主效QTL，该基因编码一种液泡上的无机焦憐酸 水解作用和M離子r转运作用的焦憐酸转移酶。ChalkS的过量表达使胚乳的聖白增加，推 测是由于干扰了种子发育过程中膜运输系统的pH稳态，进而影响蛋白体的生物合成，使小 囊泡结构大量增加，因此在胚乳的胆藏部位形成空气泡即聖白。与低聖白品种H94等位基因 序列比较，高聖白品种珍灿97(Zhenshan97)等位基因序列发生39处多态性变异，其中10处 变异发生在翻译起始位点上游1.Skb的启动子上，运些变异包括替换、插入和缺失S种突变 类型。5处变异发生在外显子上，但仅在第一个和第四个外显子上发生两个氨基酸替换，内 含子上有24处单核巧酸多型性（single-nucleotidepolymo;r曲ism,SNP)变异。对该基因进 行功能性遗传变异分析发现，在珍灿97启动子-721位点和-485位点的两个SNPs变异导致其 与种子发育相关的两个顺式调控原件（负方向）在H94启动子中发生了变异，位于-721位点 的是负责种子特异表达和脱落酸(abscisiC acid,ABA)相应的RY/G-box(CATGCA)，位于- 485位点的是负责种子发育过程中光合产物运输和代谢的CACT-box。研究结果表明，运两个 突变位点上具有与珍灿97相同等位基因型的，化a化5的RNA表达量较高，与同一时期的珍灿 97表达量相近，任意一个位点发生突变，化alk5的RNA表达量降低，与同一时期朋4的RNA表 达量相近。聖白是典型的数量性状，容易受到环境的影响，且其表型是在成熟收获后才能进 行选择。有鉴于此，如何发展出获得化alk5的功能标记能快捷、准确鉴定不同基因型，现有 技术实有待改善的必要。
【发明内容】
[0005] 本发明针对水稻聖白率在稻米外观品质改良选育过程中，呈连续分布且易受气候 等环境条件影响造成鉴定不准确的技术难题。根据高聖白率和低聖白率在化alk5位点存在 的功能性单碱基突变，设计、合成目的基因的功能标记，并通过简单的检测方法，快速鉴定 含低聖白率化alk5等位基因型的水稻种质资源，同时还能进一步应用于分子标记辅助育 种。因此，在Chalks基因克隆的基础上，每个位点分别开发了 S对等位基因特异PCR [Allele-specific polymerase chain reaction(AS-PCR)又或稱扩增受阻突变体系聚合 酉每链反应（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction， ARMS-PCR)]引物。经过梯度PCR筛选，每个位点均得到一对能高效特异扩增的引物，其中分 子标记化a化12、N化alkl2和化a化22、N化alk22,能够快捷、准确鉴定化alk5基因的不同基 因型，将有利于水稻外观品质改良的分子育种。
[0006] 本发明的目的是提供一种鉴别水稻聖白基因化a化5等位基因型的分子标记，其特 征在于:所述等位基因型包括聖白基因化alk5启动子-714位点与-485位点；所述聖白基因 化a化5启动子-714位点的分子标记是由一对引物沈Q ID N0:1与由SEQ ID N0:2、3、4、5、6 及7所构成的群组中选出的一种所组成；W及所述聖白基因化alk5启动子-485位点的分子 标记是由一对引物SEQ ID N0:14与由沈Q ID N0:8、9、10、ll、12及13所构成的群组中选出 的一种所组成。
[0007] 优选的，所述聖白基因化alk5启动子-714位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO: 1与由SEQ ID N0:3、及6所构成的群组中选出的一种所组成；W及所述聖白基因化alk5 启动子-485位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO: 14与由SEQ ID N0:9及12所构成的群 组中选出的一种所组成。
[0008] 本发明另提供一种鉴别水稻聖白基因化alk5等位基因型的方法，其特征在于，所 述方法包含下列步骤:提取一水稻样品的脱氧核醋核酸(deoxyribonucleic acid,DNA); W 所述水稻样品的脱氧核醋核酸为模板，利用权利要求1所述分子标记进行聚合酶链锁反应 (polymerase chain reaction，PCR)扩增，得到一产物；W及分析聚合酶链锁反应扩增后的 产物，进行结果判定，所述结果判定为:如果分子标记由一对引物SEQ ID NO: 1与由SEQ ID N0:2、3及4所构成的群组中选出的一种所组成和分子标记由一对引物SEQ ID N0:14与由 SEQ ID N0:8、9及10所构成的群组中选出的一种所组成分别能够扩增出197bp和450bp的片 段，而分子标记由一对引物SEQ ID NO: 1与由SEQ ID N0:5、6及7所构成的群组中选出的一 种所组成和分子标记由一对引物SEQ ID NO: 14与由SEQ ID NO: 11、12及13所构成的群组中 选出的一种所组成无扩增产物，则表明所述水稻样品的目标聖白基因为高聖白纯合基因 型；如果分子标记由一对引物SEQ ID N0:1与由SEQ ID N0:2、3及4所构成的群组中选出的 一种所组成和分子标记由一对引物SEQ ID NO: 14与由SEQ ID N0:8、9及10所构成的群组中 选出的一种所组成无扩增产物，而分子标记由一对引物SEQ ID NO: 1与由SEQ ID N0:5、6及 7所构成的群组中选出的一种所组成和分子标记由一对引物SEQ ID NO: 14与由SEQ ID NO: 11、12及13所构成的群组中选出的一种所组成分别能够扩增出197bp和450bp的片段，则表 明所述水稻样品的目标聖白基因为低聖白纯合基因型;或如果分子标记由一对引物SEQ ID NO: 1与由SEQ ID N0:2、3及4所构成的群组中选出的一种所组成、分子标记由一对引物SEQ ID NO: 1与由SEQ ID N0:5、6及7所构成的群组中选出的一种所组成和分子标记由一对引物 SEQ ID NO: 14与由SEQ ID N0:8、9及10所构成的群组中选出的一种所组成、分子标记由一 对引物SEQ ID N0:14与由SEQ ID N0:ll、12及13所构成的群组中选出的一种所组成均分别 能够扩增出197bp和45化P的片段，则表明所述水稻样品包含的目标基因为高聖白杂合基因 型。
[0009] 优选的，所述水稻样品包含南京1号、南京11号、南京14号、南京15号、南京16号、 BG90-2、圭630、苏农3037、明恢78、9311、IRBB21、广陆矮4号、粤晶丝苗、浙恢7954、乐恢188、 广恢128、IR64、矮脚南特、蜀恢527、多恢1号、绵恢725、II-32B、粤泰B、华丰B、连梗4号、武运 梗21、淮稻11号、华梗6号、盐梗11号、连梗6号、连梗7号、华瑞稻1号、连梗11号、武运梗27、淮 稻14号、洒稻785、淮懦12号、通懦3号、扬农稻1号、南梗45、宁梗5号、镇稻14号、扬育梗2号、 苏稻5号、南梗49、宁9108、扬梗805、镇稻10号、明恢63或日本晴。
[0010] 优选的，所述聚合酶链锁反应包括下列步骤:一变性反应、一热循环反应W及一延 长反应;其中热循环反应包括多个循环，各循环包括:一变性步骤、一退火步骤W及一延长 步骤;其中所述退火步骤的退火溫度介于53°C至63°C之间。
[00川更优选的，所述分子标记由一对引物SEQ ID NO: 1与由SEQ ID N0:3及6所构成的 群组中选出的一种所组成，所述退火步骤的退火溫度为58°C至60°C。
[001^ 更优选的，所述分子标记由一对引物沈Q ID NO: 14与由SEQ ID N0:9及12所构成 的群组中选出的一种所组成，所述退火步骤的退火溫度为59°c至ere。
[0013] 优选的，所述聚合酶链锁反应为扩增受阻突变体系聚合酶链反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)。
[0014] 本发明具有W下优点：
[0015] (I)本发明提供的分子标记是根据基因的功能区域差异设计的等位基因特异PCR 引物，能够准确快速的反映植株的基因型，不仅不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定，而 且在操作上准确、高效、快捷。
[0016] (2)本发明提供的方法能实现对水稻基因资源的快速鉴定，能从大量水稻资源中 准确筛选出低聖白率Cha化5基因的水稻品种，运些具有低聖白率Cha化5基因的水稻品种在 育种中可W作为优异亲本来应用于水稻稻米外观品质改良育种中。
[0017] (3)本发明提供的方法能有效用于水稻聖白率改良的辅助育种，可W有效地对分 离群体中聖白率控制基因化a化5进行不同等位基因型选择，并且能够区分杂合基因型和纯 合基因型，大大提高育种工作的预见性。
【附图说明】
[001引图IA至图IC是Chalks等位基因藉由特异PCR引物畑alkll、NChalkll、Chalkl2、 NChalkl2、Chalkl3、N化alkl3对水稻生产推广品种9311和明恢63梯度PCR的扩增结果。M: DNA分子量标准(DNA marker，购自上海闪晶分子生物科技有限公司，型号为化2000);图IA: 上排每一溫度依序为引物化alkl 1W9311和明恢63做为模板扩增结果，下排每一溫度依序 为NCha化11W9311和明恢63做为模板扩增结果；图1B:上排每一溫度依序为引物化a化12W 9311和明恢63做为模板扩增结果，下排每一溫度依序为N化alkl2W9311和明恢63做为模板 扩增结果；图1C:上排每一溫度依序为引物化alkl3W9311和明恢63做为模板扩增结果，下 排每一溫度依序为NCha化13W9311和明恢63做为模板扩增结果。
[0019] 图 2A至图 2C是Chalks等位基因特异PCR引物Chalk21、NChalk21、Chalk22、 NChalk22、Chalk23、N化alk23对9311和明恢63梯度PCR的扩增结果。M:DNA分子量标准；图 2A:上排每一溫度依序为引物化a化21W9311和明恢63做为模板扩增结果，下排每一溫度依 序为NCha化21W9311和明恢63做为模板扩增结果；图2B:上排每一溫度依序为引物化a化22 W9311和明恢63做为模板扩增结果，下排每一溫度依序为NCha化22W9311和明恢63做为模 板扩增结果；图2C:上排每一溫度依序为引物化alk23W9311和明恢63做为模板扩增结果， 下排每一溫度依序为NCha化23W9311和明恢63做为模板扩增结果。
[0020] 图3是部分梗稻和釉稻品种化alk5位点功能区的测序比对结果；上排红色框处为 化a化5基因启动子-721位点、下排红色框处为化a化5基因启动子-485位点。
[0021] 图4A至图4B是引物化a化12、肥11曰化12和化曰化22、肥11曰化22对部分釉稻材料?0?的 扩增结果。M:DNA分子量标准；图4A:上排为引物化alkl2扩增的结果、下排为N化alkl2扩增 的结果；图4B:上排为引物化alk22扩增的结果、下排为N化alk22扩增的结果；1:南京1号；2: 南京11号；3:南京14号；4:南京15号；5:南京16号;6:BG90-2;7:圭630;8:苏农3037;9:明恢 78; 10:9311; 11: IRBB21; 12:广陆矮4号；13:粤晶丝苗；14:浙恢7954; 15:乐恢 188; 16:广恢 128; 17: IR64; 18:矮脚南特；19:蜀恢527;20:多恢1 号；21:绵恢725;22: II-32B;23:粤泰B; 24:华丰B。
[0022] 图5A至图5B是引物化a化12、NCha化12和化a化22、NCha化22对部分梗稻品种PCR的 扩增结果。M:DNA分子量标准；图5A:上排为引物化alkl2扩增的结果、下排为N化alkl2扩增 的结果；图5B:上排为引物化alk22扩增的结果、下排为N化alk22扩增的结果；1:连梗4号；2: 武运梗21 ;3:淮稻11号;4:华梗6号;5:盐梗11号;6:连梗6号;7:连梗7号;8:华瑞稻1号;9:连 梗11号；10:武运梗27; 11:淮稻14号；12:洒稻785; 13:淮懦12号；14:通懦3号；15:扬农稻1 号；16:南梗45; 17:宁梗5号；18:镇稻14号；19:扬育梗2号；20:苏稻5号；21:南梗49; 22:宁 9108; 23:扬梗805; 24:镇稻 10 号。
【具体实施方式】
[0023] 为充分公开本发明一种鉴别水稻聖白基因化alk5等位基因型的分子标记及其方 法，W下结合方法验证和实施实例加 W说明。其具体实施步骤如下：
[0024] ( - )试验材料
[0025] 均为水稻生产推广品种：南京1号、南京11号、南京14号、南京15号、南京16号、 BG90-2、圭630、苏农3037、明恢78、9311、IRBB21、广陆矮4号、粤晶丝苗、浙恢7954、乐恢188、 广恢128、IR64、矮脚南特、蜀恢527、多恢1号、绵恢725、II-32B、粤泰B、华丰B、连梗4号、武运 梗21、淮稻11号、华梗6号、盐梗11号、连梗6号、连梗7号、华瑞稻1号、连梗11号、武运梗27、淮 稻14号、洒稻785、淮懦12号、通懦3号、扬农稻1号、南梗45、宁梗5号、镇稻14号、扬育梗2号、 苏稻5号、南梗49、宁9108、扬梗805、镇稻10号、明恢63和日本晴。W上材料均为公知公用材 料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。
[00%](二)鉴别水稻聖白基因化alk5等位基因型分子标记的获得 [0027] 1分子标记的开发
[002引（1)水稻聖白基因化alk5变异位点的核巧酸序列分析
[00巧]根据Li(化Uire Genetics，2014，46(4): 398-404)等的研究结果，比较低聖白率和 高聖白率等位基因序列，存在39处多态性变异，其中10处变异发生在翻译起始位点上游 1.8化的启动子上，运些变异包括替换、插入和缺失S种突变类型。5处变异发生在外显子 上，但仅在第一个和第四个外显子上发生两个氨基酸替换，内含子上有24处SNP变异。对 化alk5基因进行功能性遗传变异分析发现，在珍灿97启动子-721位点和-485位点的两个 SNPs变异导致其与种子发育相关的两个顺式调控原件（负方向）在H94启动子中发生了变 异，位于-721位点的是负责种子特异表达和ABA相应的RY/G-box(CATGCA)，位于-485位点的 是负责种子发育过程中光合产物运输和代谢的CACT-box。研究结果表明，运两个突变位点 上具有与珍灿97相同等位基因型的，化a化5的RNA表达量较高，与同一时期的珍灿97表达量 相近，任意一个位点发生突变，化曰化5的RNA表达量降低，与同一时期的朋4表达量相近，说 明运两个SNPs变异为功能性突变。
[0030] (2)引物设计
[0031 ] 在美国全国生物技术信息中屯、（National Center for Biotechnology Inf ormation，NCBI)的GenBank中捜索高聖白率显性等位基因化a化5和低聖白率隐性等位 基因化alk5的序列，来源于珍灿97 (Zhenshan 97)的显性等位基因化alk5的登录号为 KJ363317.1，来源于H94的隐性等位基因化a化5的登录号为KJ363318.1，对序列进行比对分 析，根据两个功能突变位点W及基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计等位基因特 异PCR(ARMS-PCR)引物，为了增强引物的特异性，第721位突变位点的反向引物在3 '端分别 引入一个人为错配，第485位突变位点的正向引物在3'端分别引入一个人为错配。由于尚不 清楚哪一种碱基的错配能够在不影响扩增效率的前提下提高扩增特异性，因此每个位点分 别设计巧中碱基错配方式，正向引物与反向引物配对，每个位点共6对引物W供筛选，引物具 体序列及扩增产物大小见表1。引物由Invitrogen中国公司合成。
[0032] 表1基于显性隐性等位基因序列单碱基功能突变位点设计的ARMS-PCR标记
[0033]
[0034] 2分子标记的验证
[00巧](1)水稻植物基因组DNA提取
[0036] 水稻植株基因组DNA的提取参照十二烷基横酸钢（sodium dodecyl sulfonate, SDS)法（DellapoパaSL，etal.，PlantMolBiolRep，1983，la):19221.)。具体步骤 为:取水稻分葉期叶片I克左右，在-20°C预冷的研鉢中用液氮研磨并装入2.0毫升(mU离屯、 管；加入600微升（化）提取液{20%505，1墨尔浓度（1111〇1曰'，謹)^屬甲基氨基甲烧鹽酸 [Tris (hydroxymethyl) ami nomethane hydrochloride , Tri s-HCl ]，0 . SM 乙二胺四乙酉畫 化DTA)，5M氯化納(sodium chloride，NaCl)，65°C预热}，摇匀，65°C水浴30分钟，中间振荡3 次至4次；加入1/4体积5M乙酸钟（potassium acetate ,KAc),摇匀后置冰上30分钟；加入氯 仿-异戊醇（24:1)30化L至40化L，在摇床上充分振荡，每分钟120转(rpm)，30分钟；8, OOO^m 至10，000巧m离屯、15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清(400化左右） 至另一离屯、管；加入等体积氯仿-异戊醇（24:1)，摇床上充分振荡，8化pm至90rpm，30分钟； 8，00化pm离屯、15分钟，转移上清(400化左右)至新的离屯、管;加入2倍体积-20°C预冷的无水 乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12,0(K)巧m离屯、6分钟;弃无水乙醇，加入4°C 70%乙醇， 放置10分钟，弃上清，超净工作台上风干1小时;加入I(K)化至20化L TE,-20°C保存。（2)分子 标记的筛选和验证
[0037] W9311和明恢63的DNA为模板，利用表1设计的引物进行梯度PCR扩增筛选最佳分 子标记，扩增产物在1.5%琼脂糖电泳分析，将引物C1F、C1R1配对命名为化alkll，引物C1F、 C1R2配对命名为Chalkl2,引物C1FX1R3配对命名为Chalkl3,引物C1F、NC1R1配对命名为 NChalkll,引物C1F、NC1R2配对命名为N化alkl2,引物C1F、NC1R3配对命名为N化alkl3。此 夕h将引物C2F1、C2R配对命名为Cha化21，引物C2F2、C2R配对命名为Cha化22，引物C2F3、C2R 配对命名为畑alk23,引物NC2F1、C2R配对命名为NChalk21，引物NC2F2、C2R配对命名为 NCha化22,引物NC2F3、C2R配对命名为NCha化23。如图1A、图IB及图IC上排所示，W9311和明 恢63为模板，引物Cha化11、Cha化12、Cha化13对9311能扩增出197碱基对(base pair,bp)的 片段而对明恢63则无扩增产物;如图lA、图IB及图IC下排所示，W9311和明恢63为模板，对 应引物N化a化11、N化a化12、N化a化13的扩增结果正好相反，对9311无扩增产物而对明恢63 能扩增出197bp的片段。同时，从图IB中可W看出第二个引物对化alkl2与NChalkl2在退火 溫度为59.7°C条件下的扩增效率及扩增特异性最好，因此选用等位基因特异PCR引物 化a化12与NChalkl2作为第一个功能突变位点（Chalks基因启动子-721位点）的筛选标记， 可用于目标基因等位基因型的快速检测。如图2A、图2B及图2C上排所示，W9311和明恢63为 模板，引物化曰化21、化a化22、化a化23对9311能扩增出450bp的片段而对明恢63则无扩增产 物；如图2A、图2B及图2C下排所示，W 9311和明恢63为模板，对应引物N化a化21、NChalk22、 NCha化23的扩增结果正好相反，对9311无扩增产物而对明恢63能扩增出450bp的片段，与预 期结果完全一致。同时，从图2B中可W看出第二个引物对化a化22与N化alk22在退火溫度为 60.9°C条件下的扩增效率及扩增特异性最好，因此选用等位基因特异PCR引物化alk22与 NCha化22作为第二个功能突变位点（化alk5基因启动子-485位点）的筛选标记，可用于目标 基因等位基因型的快速检测。
[0038] 为了进一步验证等位基因特异PCR引物化a化12、N化alkl2和化a化22、N化alk22对 不同水稻品种包含的等位基因型检测的准确性，将引物C1FX2R配对命名为化alkCX，用于 功能目标片段的测序分析，该引物能扩增出846bp的目标片段，包含了上述两个功能突变位 点。
[0039] 利用引物化a化CX对7个水稻品种9311、明恢63、日本晴、连梗4号、淮稻11号、华梗6 号和盐梗11号进行扩增，PCR产物进行测序分析。如图3所示，与对照珍灿97和朋4进行比对 分析发现，9311、日本晴、连梗4号、淮稻11号、华梗6号和盐梗11号在两个功能突变位点的等 位基因型与珍灿97-致，而明恢63在两个功能突变位点的等位基因型与朋4 一致，测序分析 结果与等位基因特异PCR检测的结果完全一致，因此，利用化alkl2、N化alkl2和化alk22、 N化alk22中的任何一对引物均可W准确的鉴定出水稻品种中包含的化alk5的不同等位基 因型（图3)。
[0040] (3)对水稻资源的化alk5基因型鉴定
[0041 ] 利用两对ARMS-PCR标记化alkl2、NChalkl2和Cha化22、N化alk22分别对24份釉稻 材料进行检测，两对标记的检测结果一致。其中，南京14号、圭630、苏农3037、明恢78、粤晶 丝苗、浙恢7954、乐恢188、广恢128、蜀恢527、多恢1号、绵恢725及华丰B共12份材料表现为 化a化5低聖白率等位基因型，其余南京1号、南京11号、南京15号、南京16号、BG90-2、9311、 IRBB21、广陆矮4号、IR64、矮脚南特、11-3?及粤泰B共12份材料表现为化a化5高聖白率等 位基因型。运些含有化alk5低聖白率等位基因水稻材料在育种中可W作为优异亲本用于水 稻稻米外观品质的改良（图4A至图4B)。
[0042] 利用两对ARMS-PCR标记化alkl2、N化alkl2和化alk22、N化alk22分别对江苏省历 年来大面积推广的24份梗稻品种进行检测，两对标记的检测结果一致。连梗4号、武运梗21、 淮稻11号、华梗6号、盐梗11号、连梗6号、连梗7号、华瑞稻1号、连梗11号、武运梗27、淮稻14 号、洒稻785、淮懦12号、通懦3号、扬农稻巧、南梗45、宁梗5号、镇稻14号、扬育梗2号、苏稻5 号、南梗49、宁9108、扬梗805及镇稻10号共24份梗稻品种均表现为化a化5高聖白率等位基 因型，说明江苏近几年大面积推广的梗稻品种中可能大部分包含的是化alk5高聖白率等位 基因，缺少包含化a化5低聖白率等位基因型的梗稻品种（图5A至图5B)。
【主权项】
1. 一种鉴别水稻垩白基因 Chalk5等位基因型的分子标记，其特征在于，所述等位基因 型包括垩白基因 Cha I k5启动子-714位点与-48 5位点； 所述垩白基因 Chalk5启动子-714位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO: 1与由SEQ ID从):2、3、4、5、6及7所构成的群组中选出的一种所组成；以及 所述垩白基因 Chalk5启动子-485位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO: 14与由SEQ ID NO: 8、9、10、11、12及13所构成的群组中选出的一种所组成。2. 根据权利要求1所述鉴别水稻垩白基因 Chalk5等位基因型的分子标记，其特征在于， 所述垩白基因 Chalk5启动子-714位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO: 1与由SEQ ID N0:3、及6所构成的群组中选出的一种所组成；以及 所述垩白基因 Chalk5启动子-485位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO: 14与由SEQ ID N0:9及12所构成的群组中选出的一种所组成。3. -种鉴别水稻垩白基因 Chalk5等位基因型的方法，其特征在于，所述方法包含下列 步骤： 提取一水稻样品的脱氧核醣核酸； 以所述水稻样品的脱氧核醣核酸为模板，利用权利要求1所述分子标记进行聚合酶链 锁反应扩增，得到一产物；以及 分析聚合酶链锁反应扩增后的产物，进行结果判定。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述水稻样品包含南京1号、南京11号、南 京14号、南京15号、南京16号、BG90-2、圭630、苏农3037、明恢78、9311、IRBB21、广陆矮4号、 粵晶丝苗、浙恢7954、乐恢188、广恢128、IR64、矮脚南特、蜀恢527、多恢1号、绵恢725、II-32B、粵泰B、华丰B、连粳4号、武运粳21、淮稻11号、华粳6号、盐粳11号、连粳6号、连粳7号、华 瑞稻1号、连粳11号、武运粳27、淮稻14号、泗稻785、淮糯12号、通糯3号、扬农稻1号、南粳45、 宁粳5号、镇稻14号、扬育粳2号、苏稻5号、南粳49、宁9108、扬粳805、镇稻10号、明恢63或日 本晴。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链锁反应包括下列步骤： 一变性反应； 一热循环反应，包括多个循环，各循环包括:一变性步骤、一退火步骤以及一延长步骤； 其中所述退火步骤的退火温度介于53°C至63°C之间；以及 一延长反应。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分子标记由一对引物SEQ ID NO: 1与 由SEQ ID N0:3及6所构成的群组中选出的一种所组成，所述退火步骤的退火温度为58°C至 60 cC 〇7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分子标记由一对引物SEQ ID N0:14与 由SEQ ID N0:9及12所构成的群组中选出的一种所组成，所述退火步骤的退火温度为59°C 至 61°C。8. 根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链锁反应为扩增 受阻突变体系聚合酶链反应。
【文档编号】C12N15/11GK105925689SQ201610319987
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】朱金燕, 杨杰, 王军, 李文奇, 范方军, 王芳权, 仲维功
【申请人】江苏省农业科学院