稻米直链淀粉含量微控基因isa的分子标记及应用
【专利摘要】本发明公开了一种稻米直链淀粉含量微控基因ISA的分子标记ISA?m，以水稻作为物种，所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，ISA?m正向：ATAGATGCTAATGTGATGTGGC；反向：TGGTATAGGCACAACCGTAGA。该分子标记ISA?m能用于水稻稻米直链淀粉含量鉴定和/或其后代辅助选择育种。
【专利说明】
稻米直链淀粉含量微控基因 ISA的分子标巧及应用
技术领域
[0001] 本发明属于农业生物技术工程，特别设及与稻米直链淀粉含量调控基因 ISA有关 的分子标记ISA-m及其获得方法。
【背景技术】
[0002] 高产、优质一直是水稻育种长期追求的目标。经过长期的努力，尤其是杂交稻技术 的利用，我国在水稻生产上取得了举世公认的成就。但是由于过去一直把如何解决人们的 溫饱问题放在第一位，故而水稻育种工作的重点大部分集中于水稻高产新品种的培育，从 而导致优质稻米的育种严重滞后，特别是一些高产的杂交稻品质普遍偏差。
[0003] 导致稻米品质改良进展较慢的另一个主要原因是稻米品质遗传的复杂性和传统 育种手段的局限性。稻米的品质性状包括外观品质、加工品质、蒸煮品质、营养品质和食味 品质等诸多方面，而稻米蒸煮品质是评价稻米品质的最重要指标。蒸煮品质是指稻米在蒸 煮过程中所表现出来的特性，主要由直链淀粉含量(Amylose Content ,AC)、胶稠度(Gel Consistency，GC)、糊化溫度（GeIatinization Temperature ,GT)S个理化指标来评价，其 中AC是影响稻米品质最主要的理化指标。育种学家和遗传学家做了大量的工作W探寻稻米 AC的遗传学基础，然而不同实验室的结果有着较大的差别。早期的研究表明稻米AC是由一 个主效基因控制，并受到其他微效WL的调控[1，2]。随后的研究发现Waxy(Wx)对于稻米AC 的多少具有决定性的作用，可能就是控制AC的主效基因[3-5]。除在第6染体上检测到1个主 效OTL外，不同研究检测到的微效OTL数目及位置很不一致。例如，Tan等在第1、2染色体上检 测到了两个微效QTLs[6]，化等在第5染色体检测到了一个微效QTL[6] ,Aluko等在第3和8染 色体上分别检测到了微效QTLs[7]。黄祖六等研究发现除了第6染色体的Wx基因位点外，在 第3染色体也检测到一个控制稻米AC的主效QTL另外5个微效QTLs分别位于第4、4、6、9、11 染色体的不同座位上[引。其他实验室在第4、6、7染色体也检测到了控制AC的QTLs[9]。吴长 明等在第6染色体上并没有发现与AC有关的WL位点，只是在第1，7,8,9,12染色体上发现5 个OTL位点[10]。
[0004] 导致稻米品质改良进展较慢的另一个主要原因是在传统育种手段的局限性。传统 育种方法主要是对有利目标性状进行定向选择和固定，培育出优良新品种，运具有很大的 盲目性和不可预测性[11]。并且，个体选择的方法是对符合育种目标的农艺性状进行直接 选择，即选择的是个体表现型而不是基因型。由于基因间存在一因多效、多因一效、调控基 因 W及修饰基因等的作用，个体的表现型与基因型往往存在较大差异，因而通过田间表型 性状进行个体选择的准确性较差。分子标记辅助选择(Marker-assisted Select ion ,MAS) 技术给水稻育种提供了新的途径，与传统育种技术相结合可大大提高育种效率，缩短育种 周期。MAS的核屯、是把常规育种中的表型选择转化为基因型选择，它直接反映了 DNA的序列 差异，不受基因表达的影响，结果可靠性强，并且不受植物的生长发育阶段及环境条件的影 响[12]。
[0005] 上文中设及的参考文献如下：
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【发明内容】
[0018] 本发明要解决的技术问题是提供一种与稻米淀粉合成基因 ISA有关的分子标记及 其用途，本发明所得的分子标记ISA-m为稻米直链淀粉含量微控基因 ISA的分子标记，能用 于稻米直链淀粉含量鉴定及相应的辅助选择育种。
[0019] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种稻米直链淀粉含量微控基因 ISA的分子 标记ISA-m，W水稻作为物种，该分子标记引物选自下列引物对，其中的核巧酸序列为5/^ 3'，
[0020] I SA-m正向：ATAGATGCTAATGTGATGTGGC
[0021] 反向：TGGTATAGGCACAACCGTAGA。
[0022] 本发明还提供了上述分子标记ISA-m的开发方法，例如包括W下步骤：
[0023] 1)、W梗稻品种日本晴作为低直链淀粉含量基因供体亲本与作为高直链淀粉的特 青进行杂交、回交和自交，从而获得作为后代的稻米低直链淀粉含量的单株；
[0024] 2)、用CTAB(十六烷基S乙基漠化锭，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide) 法提取水稻亲本幼苗及后代幼苗基因组DM;
[00巧]3)、采用Indel (插入/缺失片段，insertion/deletions)分子标记方法进行稻米低 直链淀粉含量基因标记的筛选；
[0026] 4)、开发出一个Indel分子标记ISA-m。
[0027] 与稻米低直链淀粉含量有关的分子标记ISA-m，具体是用下述方法得到的：
[00%] 1)、根据基因 ISA的核巧酸序列，设计、发展Indel分子标记，用于检测低直链淀粉 含量日本晴和高直链淀粉含量特青的多态性;通过测序W进一步确定引物ISA-m区间的序 列在低直链淀粉含量的日本晴和高直链淀粉含量的特青之间的差异;通过杂交、回交和自 交结合标记辅助选择，获得特青背景的低直链淀粉含量的水稻新种质；
[0029] 2)、用CTAB法提取水稻亲本幼苗及后代幼苗基因组DNA;
[0030] 3)、采用Indel分子标记方法进行稻米低直链淀粉含量的基因标记筛选低直链淀 粉含量的水稻新种质；
[0031] 4)、鉴定出一个Indel分子标记ISA-m，经多态性检测，发现其与稻米直链淀粉含量 相关联。
[0032] 本发明还同时提供了上述分子标记ISA-m的用途，用于水稻稻米直链淀粉含量鉴 定和/或其后代辅助选择育种。
[0033] 作为本发明的分子标记ISA-m的用途的改进：当筛选日本晴和釉稻(包括特青、桂 朝2号）的后代时，选择后代中带型与日本晴带型一致的单株用于后续的育种改良。
[0034] 引物ISA-m PCR扩增所得的分子标记ISA-m在日本晴中的序列为：
[0035] ATAGATGCTAATGTGATGTGGCAGCACCGACGTCACACCTGTGACATCTGGCCATATGTCTACAGCTAATGCTGTGT TTTGTTCAATTTTTATTMAGGCAAATAAATATCTATATCTAC GGTTGTGCCT ATACCA。
[0036] 引物ISA-m PCR扩增所得的分子标记ISA-m在特青中的序列为：
[0037] ATAGATGCTAATGTGATGTGGCAGACACCTGTGACATCTGGCCATATGTCTACAGCTAATGCTGTGTTTTGTTCAAT TTTTATTAAAGGCAAATAAATATCTATATCTACGGTTGTGCCT ATACCA。
[0038] 采用Indel分子标记ISA-m进行稻米直链淀粉含量筛选的方法具体是：
[0039] (I)、Indel标记在高、低稻米直链淀粉含量品种日本晴和特青间的DNA多态性分 析：
[0040] 根据基因 ISA的核巧酸序列，设计、发展Indel分子标记ISA-m，用于检测低直链淀 粉含量的日本晴和高直链淀粉含量的特青之间的多态性。引物委托上海申能博彩公司合 成，在PTC-225PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为：20ng/ul水稻基因组DNA Iul，10 X PCR Buffer 2.Oul,25mM MgCb 2.Oul,2mM dNTP 2.Oul ,IOuM引物2.Oul,抓All Taq DNA聚合 酶0.化1，d地2〇 10.8ul，总体系20ul。反应程序:95°C变性5分钟;94°C变性1分钟，55°C退火 1分钟，72°C延伸1分钟，40个循环；72°C补齐10分钟；产物检测：在含有0.5%ug/ul EB的 4.0%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。
[0041 ] (2)、Indel标记ISA-m的序列区间在低、高稻米直链淀粉含量品种日本晴和特青间 的基因组序列差异：
[0042] 根据获得的Indel分子标记ISA-m，用于PCR扩增低直链淀粉含量品种日本晴和高 直链淀粉含量品种特青的基因组序列，PCR扩增产物委托上海英驗生物技术有限公司进行 测序分析。PCR扩增参照上述（1)进行，PCR产物的回收选用北京百泰克生物技术有限公司开 发的PCR产物回收试剂盒(离屯、柱型，目录号:DP1403)。
[0043] (3)、利用Indel标记ISA-m开展低直链淀粉含量的辅助选择育种
[0044] 低直链淀粉含量的基因供体亲本日本晴，与高直链淀粉含量的釉稻品种特青进行 杂交，通过回交、自交结合标记辅助选择，将日本晴的低直链淀粉含量基因 ISA导入到高直 链淀粉含量的特青中，选择分离群体中带型与日本晴带型一致的单株用于育种改良，获得 了若干份特青背景的带日本晴ISA基因的材料;收获运些植株上所结的种子，检测其直链淀 粉含量，发现其直链淀粉含量显著降低。
[0045] 直链淀粉含量高是稻米品质低劣的最主要因素。本发明采用分子生物学方法W低 直链淀粉含量的日本晴为材料，发展和筛选新的、而且稳定的能降低稻米直链淀粉含量的 分子标记及其方法，用于优质稻米的辅助选择育种；由于研究所用的材料能有效降低一般 稻米的直链淀粉含量，其对我国稻米品质的改善具有普遍性。
[0046] 本发明创造了稻米淀粉合成相关基因 ISA的Indel标记ISA-m。利用运种方法，不仅 克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，可W有目标地将日本晴的低直链淀粉含量基 因 ISA在实验室内选择获得并有目的地进行多个优质的聚合，从而培育出具有优质的水稻 新品种。在本发明中，当所得植株经检测出现日本晴的条带时，我们判定其属于低直链淀粉 含量的水稻；当所得植株经检测出现特青的条带时，我们判定其属于高直链淀粉含量的水 稻；当所得植株经检测同时出现特青+日本晴的条带时，我们判定其可能属于高直链淀粉含 量的水稻。
[0047] 本发明可适用大部分的釉稻（如特青、桂朝2号）和梗稻(如日本晴）之间的标记选 择。
[004引因此，本发明结果在水稻优质育种实践中具有重要意义。其优点具体归纳如下：
[0049] (1)本发明的能调控稻米直链淀粉含量的分子标记，是在通过低直链淀粉含量的 梗稻日本晴与高直链淀粉含量的釉稻特青的杂交、回交和自交中筛选获得的，能显著降低 稻米直链淀粉含量，而且稳定存在，可用于优质稻米的辅助选择育种。
[0050] (2)本发明依据的是稻米淀粉合成基因 ISA的核巧酸序列发展而获得的Indel分子 标记I SA-m，本发明的I SA-m与GBSSII -m、SSI Vb-m在不同染色体上，I SA-m与AGPS2a-m虽然均 位于第8染色体，但明显是属于不同的位置。且本发明标记所筛选的效果更佳，并极大提高 了辅助选择的效率，即，本发明的标记能使稻米低直链淀粉含量的辅助选择育种的效果更 佳。
【附图说明】
[0051] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0052] 图1是Indel标记ISA-m在低直链淀粉含量的梗稻日本晴、高直链淀粉含量的釉稻 特青、Fl的电泳谱带图；
[0053] 图2是引物ISA-m的PCR扩增产物在日本晴和特青间的序列差异；
[0054] 图3是Indel标记ISA-m鉴定获得的9份低直链淀粉含量的日本晴和特青的后代的 电泳谱带图；
[0055] 图4是标记ISA-m辅助选育的9份材料的直链淀粉含量；
[0056] 对上述图1、图3~4中符号分别作如下说明：
[0057] 1代表:低直链淀粉含量的梗稻日本晴；
[0058] 2代表:高直链淀粉含量的釉稻特青；
[0059] 3代表：日本晴/特青的Fl植株；
[0060] 4，5，6，7，8，9，10，11，12均代表：日本晴和特青的后代，经Inde 1标记I SA-m的筛选 后获得。
【具体实施方式】
[0061 ]实施例1、用Indel标记ISA-m鉴定低直链淀粉含量的梗稻日本晴和高直链淀粉含 量的釉稻特青的多态性
[0062] 具体做法是:从中国水稻研究所种质资源库中选取水稻材料日本晴和特青，用日 本晴和特青杂交获得其Fl，利用引物ISA-m鉴定其多态性（图1)。
[0063] -、提取 DNA
[0064] 1 )、配制DNA提取缓冲液：
[00化]按顺序依次加1体积的DNA提取溶液(0.35M sorbitol;0.1M化13,9册.2;0.0051 EDTA;其余为水），1体积的核裂解液（0.2M Tris，pH7.5;0.05M EDTA;2M 化 C1;0.055M CTAB;其余为水)和0.4体积的5% (质量浓度)sarkosyI溶液（即十二酷-N-甲基甘氨酸钢的 水溶液）；最后加入亚硫酸氨钢，配制成DNA提取缓冲液;亚硫酸氨钢在DNA提取缓冲液中的 终浓度为0.02M。
[0066] 上述DNA提取溶液的制备方法为：在0.35mol的sorbitol (山梨糖醇）、0.1mol的 Tris(S径甲基氨基甲烧，P册.2)、0.OOSmol的邸TA(乙二胺四乙酸）中加水定容至1L。
[0067] 上述核裂解液的制备方法为：在0.2mo 1的Tr i S (S径甲基氨基甲烧，pH7.5)、 0.05mol的抓TA(乙二胺四乙酸）、2mol的化CK氯化钢）、0.055mol的CTAB(十六烷基S甲基 漠化锭)加水定容至1L。
[0068] 2)、对上述日本晴、特青、Fl的水稻叶片分别进行如下处理：
[0069] ①、称取0.1 g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入70化1的上述步骤1)配制的 DNA提取缓冲液，65°C水浴40分钟。再加70化I的氯仿：异戊醇（24:1的体积比），并混匀。10， 00化pm离屯、5分钟，将上清液转移到新的离屯、管中。
[0070] ②、在上述步骤①离屯、后所得的上清液中加2/3~1倍体积预冷(至4°C)的异丙醇， 轻轻混匀至DNA沉淀。13，00化pm离屯、8分钟，倒出上清液。
[0071] ③、再用70% (体积浓度)的已醇20化1洗涂上述步骤②所得的DNA沉淀物。
[0072] ④、将上述洗涂后的DNA惊干并溶于10化1 TE缓冲液或纯水中。
[0073] ⑤、紫外分光光度法检测上述步骤④所得的DNA样品的浓度，0.7%的琼脂糖凝胶 电泳检测DNA的完整性。完整合适的DNA用于PCR扩增，不完整的DNA则重新提取，直至获得完 整的DNA。
[0074] 二、PCR 扩增 [007引1)、反应体系：
[0076] 水稻基因组DNA 20ng/ul Iul ,IOXPCR Buffer 2.Oul,25mM MgCb 2.Oul,2mM dNTP 2.0ul，10uM引物各l.Oul，抓/ul Taq DNA聚合酶0.化l，d地2〇 lO.Sul，总体系20ul。
[0077] 所述引物为：ISA-m正向：ATAGATGCTAATGTGATGTGGC
[007引 反向：TGGTATAGGCACAACCGTAGA;
[0079] 2)、反应程序：
[0080] 95 °C变性5分钟;94 °C变性1分钟，55 °C退火1分钟，72 °C延伸1分钟，40个循环;72 °C 补齐10分钟。
[00川 S、电泳检测
[0082] 取扩增产物20ul，用4.0%的琼脂糖凝胶(含有0.5%ug/ul EB)电泳，紫外灯下观 察并照相记录结果。如图1所示。
[0083] 在图1中，日本晴为13化P的条带，特青为12化P的条带，"Fr为13化P+12化P的条 带。
[0084] 根据图1，我们能得出下述结论：Indel分子标记ISA-m能够检测特青和日本晴之间 的多态性，且日本晴的PCR扩增产物片段要大于特青，由此表明ISA-m能用于特青和日本晴 之间的分子检测及其后代的标记辅助选择。
[00化]实施例2、用Indel分子标记ISA-m鉴定低直链淀粉含量的梗稻日本晴和高直链淀 粉含量的釉稻特青的序列差异
[00化]具体做法是：应用Indel分子标记ISA-m对日本晴和特青的基因组DNA进行PCR扩 增，扩增产物委托上海英驗生物技术有限公司进行测序，比较其序列的差异(图2)。
[0087] -、提取 DNA
[0088] 1 )、配制DNA提取缓冲液：
[0089] 同实施例1。
[0090] 2)、对上述日本晴和特青的水稻叶片分别进行如下处理：
[0091] 同实施例1。
[0092] 3)PCR 扩增
[0093] 同实施例1。
[0094] 4)PCR产物的回收
[00M] PCR产物的回收选用北京百泰克生物技术有限公司开发的PCR产物回收试剂盒(离 屯、柱型，目录号:DP1403)，参照产品说明要求进行，回收的PCR产物委托上海英驗生物技术 有限公司进行测序。
[0096] 根据图2,我们能得出W下结论：日本晴和特青的ISA-m扩增产物存在IObp的碱基 差异(如图2中的下划线所示），运是我们能够使用Indel分子标记ISA-m检测出其多态性的 原因所在，也是我们能用于其后代标记辅助选择的遗传基础。
[0097] 实施例3、利用Indel标记ISA-m开展低直链淀粉含量的辅助选择育种
[0098] 具体做法是:低直链淀粉含量的基因供体亲本日本晴，与高直链淀粉含量的釉稻 品种特青进行杂交、回交和自交，对所得后代结合分子标记ISA-m的辅助选择，选择分离群 体中带型与日本晴带型一致的单株用于育种改良。
[0099] -、提取 DNA
[0100] 1)、配制DNA提取缓冲液：
[0101] 同实施例1。
[0102] 2)、对上述日本晴、特青、所得后代的水稻叶片分别进行如下处理：
[0103] 同实施例1。
[0104] 二、Indel 标记检测
[010 引 1)、PCR 扩增
[0106] 同实施例1。
[0107] 2)、电泳检测 [010引同实施例1。
[0109] SJndel分子标记ISA-m开展低直链淀粉含量的辅助选择育种
[0110] 低直链淀粉含量的基因供体梗稻品种日本晴与高直链淀粉含量的普通釉稻品种 特青进行杂交、回交和自交，结合分子标记ISA-m的辅助选择，选择分离群体中带型与日本 晴带型一致的单株进一步用于育种改良（图3)，淘汰带型与高直链淀粉含量特青的带型一 致和杂合带型（同时具有日本晴和特青带型）的个体，育种材料的稻米直链淀粉含量采用国 家标准(GB/T15683-2008)进行检测。分析表明，所选择的带日本晴带型的9个单株均比轮回 亲本特青明显降低（图4)。该实验结果表明= Indel标记ISA-m可W用于稻米直链淀粉含量的 辅助选择育种。
[01川备注说明：
[0112] 图3和图4中的"4~12"均为日本晴和特青依次进行杂交、回交和自交获得的，且是 选择了 "带型与日本晴带型一致"的单株。
[0113] 实验1、利用Indel标记ISA-m判别稻米直链淀粉含量
[0114] 具体做法是:将实施例3的步骤=中被淘汰的带型与高直链淀粉含量特青的带型 一致和杂合带型（同时具有日本晴和特青带型）的个体继续进行种植，通过对其后代稻米巧 粒直链淀粉含量的测定，进一步分析分子标记ISA-m辅助选择的可靠性。
[011引一、提取DNA
[0116] 1)、配审化NA提取缓冲液：
[0117] 同实施例1。
[011引 2)、对上述水稻叶片分别进行如下处理：
[0119]同实施例1。
[0120] 二、Inde I 标记检测
[0121] 1)、PCR 扩增
[0122] 同实施例1。
[0123] 2)、电泳检测
[0124] 同实施例1。
[01巧]S、Indel标记ISA-m判别稻米直链淀粉含量
[0126] 随机选择了在实施例3的步骤=中被淘汰4个带型与特青一致的单株继续种植，经 Indel分子标记ISA-m检测，其后代均表现与特青一致的带型，分别收获运些单株巧粒并测 定其直链淀粉含量。另外，随机选择其中1个杂合带型（同时具有日本晴和特青带型）的个体 用于继续种植，在其后代中随机选取12个单株，Indel分子标记ISA-m检测表明，该12个单株 中有3个单株表现特青带型，6个单株表现杂合带型，3个表现日本晴带型，符合1: 2:1的分离 关系;待植株成熟后，分别收获运些单株并测定其巧粒的直链淀粉含量。表1是运16个单株 (株系）的稻米巧粒的直链淀粉含量，4个与特青带型一致的单株均表现与特青类似的高直 链淀粉含量;而在带型杂合的12个后代单株中，有9个单株表现类似与特青的高直链淀粉含 量(其中，3个单株的带型表现特青带型，6个单株的带型表现杂合带型）；3个呈日本晴带型 的单株，其直链淀粉含量显著低于特青。该实验结果表明= Indel分子标记ISA-m可W用于判 别稻米直链淀粉含量。
[0127] 表1.稻米直链淀粉含量及其对应的基因型
[012 引
[0129] 注:括号中字母代表该单株的基因型，T为特青带型，H为杂合带型，N为日本晴带型
[0130] 对比例1、与ISA-m正、反向引物同源性高的标记I SA-m-1和I SA-m-2 (如表2，其中的 核巧酸序列为5/^3/);按照本发明的上述方法进行检测，发现运两个标记扩增效果非常不 好，没有条带出现或者非特性条带很多，不能用于判别稻米直链淀粉含量，即，不能成为稻 米直链淀粉含量微控基因分子标记。
[0131] 表2
[0132]
[0133」 对化例2、将观巧3所还的4种分于你记人0?82日-111、881￥6-111、068811-111、18人-111(本巧 明）按照实施例3所述方法进行实验，此时，低直链淀粉含量的基因供体亲本仍为日本晴，高 直链淀粉含量的釉稻品种由特青改成了桂朝2号。
[0134]表3 「rnoc I
[0136] 选择分离群体中带型与日本晴带型一致的单株，育种材料的稻米直链淀粉含量采 用国家标准(GB/T 15683-2008)进行检测。
[0137] 所选择的带日本晴带型单株中的直链淀粉含量与轮回亲本桂朝2号相比的结果如 下表4:
[013引 表4
[0139]
[0140] 本实验进行了若干次的重复，结果均基本如上表4所述。
[0141] 最后，还需要注意的是，W上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于W上实施例，还可W有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 稻米直链淀粉含量微控基因 ISA的分子标记ISA-m，以水稻作为物种，其特征是:所述 分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5' ， ISA-m正向：ATAGATGCTAATGTGATGTGGC 反向：TGGTATAGGCACAACCGTAGA。2. 如权利要求1所述的分子标记ISA-m的用途，其特征是：用于水稻稻米直链淀粉含量 鉴定和/或其后代辅助选择育种。3. 根据权利要求2所述的分子标记ISA-m的用途，其特征是：当筛选日本晴和籼稻的后 代时，选择后代中带型与日本晴带型一致的单株用于育种。4. 根据权利要求3所述的分子标记I SA-m的用途，其特征是:所述籼稻为特青、桂朝2号。
【文档编号】C12Q1/68GK105838819SQ201610389803
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】曾大力, 钱前, 李家洋, 朱丽, 代丽萍, 胡江, 张光恒, 郭龙彪, 董国军, 高振宇, 陈 光
【申请人】中国水稻研究所