用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法
【专利说明】用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法
[0001] 本申请为2008年3月19日提交的，发明名称为"用于有效生产琥珀酸和苹果酸的 材料和方法"的PCT申请PCT/US2008/057439的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段 的日期为2009年9月18日，申请号为200880008975. 1。
[0002] 与相关申请交叉参考
[0003] 本申请主张2007年3月20日提交的美国临时申请系列号No. 60/895, 806的权益， 其公开内容通过整体引用作为参考，包括所有的图、表格和氨基酸或核酸序列。
[0004] 政府支持
[0005] 根据授权号USDOE-DEFG02-96ER20222 下由能源部（D印artmentofEnergy) 授权的，和授权号USDA&DOEBiomassRDIDEFG36-04G014019下由能源部与美国农业部 (UnitedStatesDepartmentofAgriculture)联合授权的政府支持，完成了本发明。政府 对本发明具有某些权利。
[0006] 发明背景
[0007] 随着石油价格的提高，从可更新的原料发酵生产琥珀酸会越来越有竞争力。琥珀 酸可作为底物用于转化成塑料、溶剂和目前由石油制成的其他化学品（Lee等，2004;Lee 等，2005;McKinlay等，2007;Wendisch等，2006;Zeikus等，1999)。许多细菌被描述为具有 生产琥珀酸作为主要发酵产物的天然能力（美国专利号No. 5, 723, 322;表1)。然而，通常 需要复杂的工艺、复杂的培养基和长久的孵育时间。
[0008] 先前已使用多种遗传手段改造大肠杆菌菌株（Escherichiacoli)用于生产琥泊 酸，并取得了不同程度的成功（表1)。在大部分研宄中，达到的滴度较低，并且需要复杂 的培养基成分例如酵母提取物或玉米浆。菌株NZN111以每摩尔被代谢的葡萄糖0.98摩 尔瑭I自酸的摩尔产率生产108mM瑭I自酸（Chatterjee等，2001 ;Millard等，1996;Stols 和Donnelly，1997)。该菌株如下改造得到：使两个基因失活（编码丙酮酸-甲酸裂解酶 的pflB和编码乳酸脱氢酶的ldhA)并过表达来自多拷贝质粒的两个大肠杆菌基因：磷酸 烯醇丙酮酸羧化酶（ppc)和苹果酸脱氢酶（mdh)。菌株HL27659k如下改造得到：突变琥 I白酸脱氢酶（sdhAB)、磷酸乙酰转移酶（pta)、乙酸激酶（ackA)、丙酮酸氧化酶（poxB)、葡 萄糖转运蛋白（ptsG)和异柠檬酸裂合酶阻抑物（iclR)。该菌株生产少于100mM的琥珀 酸并需要氧受限制的发酵条件（Cox等，2006 ;Lin等，2005a，2005b，2005c;Yun等，2005)。 使用在计算机芯片上的代谢分析设计基因敲除，从而在大肠杆菌中创建与Mannheimia succiniciproducens中的天然琥泊酸途径相似的途径（Lee等，2005和2006)。然而得到的 菌株生产非常少的琥珀酸。Andersson等，（2007)报道了仅含有天然基因的经改造的大肠 杆菌琥珀酸生产的最高水平（339mM)。
[0009] 其他研宄人员从事的是在大肠杆菌中表达异源基因的备选途径。从多拷贝质粒中 过表达Rhizobiumeteloti丙酮酸羧化酶（pyc)，从而指导碳流向琥I自酸（Gokarn等，2000 ; Vemuri等，2002a，2002b)。如下构建菌株SBS550MG:使异柠檬酸裂合酶阻抑物（iclR)、 adhE、ldhA和ackA失活，并从多拷贝质粒中过表达枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)的 citZ(朽1檬酸合酶）和R.etlipyc(Sanchez等，2005a)。使用该菌株，以1. 6的摩尔产率从 葡萄糖生产160mM琥珀酸。
[0010] 也研宄了用于琥珀酸生产的更复杂的工艺（表1)。许多这些工艺包括需氧生 长期，之后是厌氧生产期。厌氧期通常用二氧化碳、氢或二者提供（Andersson等，2007;Sanchez等，2005a和 2005b;Sanchez等，2006 ;美国专利号 5, 869, 301;Vemuri等，2002a和 2002b)。在使用天然琥I自酸生产者产琥I自酸厌氧螺菌（A.succiniciproducens)的近期研 宄中，组合了电渗析、C02的喷射、细胞再循环和分批补料（Meynial-Salles等，2007)。
[0011] 本发明提供了在矿物盐培养基中，在简单的、pH-受控的、分批发酵期间，以高滴度 和产率生产琥珀酸而不需要异源基因或质粒的多种形式的微生物，例如大肠杆菌菌株。在 开发期间，中间体菌株的特征是生产苹果酸作为优势产物。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明提供了适用于生产乳酸的新微生物，例如大肠杆菌。因此，本发明的材料和 方法可被用于生产适用于多种应用的琥珀酸和苹果酸。
[0014] 在某些实施方案中，大肠杆菌的衍生物（在本文中也称作大肠杆菌）可被用于构 建生产琥珀酸、苹果酸和丙氨酸的菌株。在多种实施方案中，大肠杆菌C(例如ATCC 8739) 可同大肠杆菌的任何其他菌株一样被使用，所述任何其他大肠杆菌菌株可得自多种保藏单 位或商业来源。在一些实施方案中，本发明的经改造的微生物也仅含有天然基因（即不含 有来自其他生物的遗传材料）。根据下文的描述会容易地明了本发明的其他优点。
[0015] 附图概沐
[0016] 图1A-1B.葡萄糖成为琥珀酸的发酵。图1A显示通过大肠杆菌发酵葡萄糖的标准 途径。该途径已由Unden和Kleefeld(2004)重新画出。粗体箭头表示中枢发酵途径。十字 代表为了改造KJ012在该研宄中进行的基因缺失（ldhA，adhE，ackA)。基因和酶：ldhA，乳酸 脱氢酶；pflB，丙酮酸-甲酸裂解酶；focA，甲酸转运蛋白；pta，磷酸乙酰基转移酶；ackA， 乙酸激酶；adhE，醇脱氢酶；ppc，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脱氢酶复合物；gltA， 梓檬酸合酶；mdh，苹果酸脱氢酶；fumA，fumB和fumC，延胡索酸酶异构酶；frdABCD，延胡索 酸还原酶；fdh，甲酸脱氢酶；icd，异朽1檬酸脱氢酶；acs，乙酰基~CoA合成酶；mgsA，甲基 乙二醛合酶；P〇xB，丙酮酸氧化酶；aldA，醛脱氢酶；和aldB，醛脱氢酶。图1B显示经改造的 大肠杆菌菌株中，ATP生产和生长与琥珀酸和苹果酸生产的偶合。实线箭头连接NADH池。 虚线箭头连接NAD+池。在厌氧条件下的糖酵解期间，生长与ATP的生产和NADH的氧化专 性偶合。
[0017] 图2A-2D.大肠杆菌对琥珀酸生产的可能的羧化途径。编码关键性羧化酶的基因 以粗体显示。图2A显示PEP羧化酶。磷酸烯醇丙酮酸（PEP)不生产ATP。这被认为是葡萄 糖发酵期间大肠杆菌生产琥珀酸的主要途径。
[0018] 图2B显示苹果酸酶（NADH)。在丙酮酸激酶（pykA或pykF)从ADP和PEP生产ATP 期间，能量被保存。苹果酸酶（sfcA)催化NADH-相关的还原性羧化，从而生产苹果酸。图 2C显示苹果酸酶（NADPH)。在丙酮酸激酶（pykA或pykF)从ADP和PEP生产ATP期间，能 量被保存。苹果酸酶（maeB)催化NADPH-相关的还原性羧化，从而生产苹果酸。图2D显示 PEP羧激酶（carboxykinase)。在PEP的羧化期间通过生产ATP保存能量，从而生产草酰乙 酸。
[0019] 图3A-3C.KJ012代谢演化期间产生KJ017、KJ032和KJ060的生长。将菌株KJ012 连续地转移进含5% (w/v)(图3A)和10% (w/v)(图3B)葡萄糖的NBS培养基中，分别产 生KJ017。缺失focA和pflB后，将得到的菌株（KJ032)最初在补充有乙酸的培养基中继代 培养（图3C)。乙酸水平被降低并随后在进一步传递中被消除，以生产KJ060。折线代表无 乙酸时KJ017的发酵，添加作为比较。符号：0D55(lnm处的光密度鲁。
[0020] 图4A-4F.用于生产琥珀酸和苹果酸的菌株的代谢演化期间，发酵产物的概述。如 所示用乙酸钠补充培养物。黑色的箭头代表在文本所示发酵条件之间的转换。在KJ032的 代谢演化期间未检测到甲酸和仅检测到小量乳酸。在KJ070和KJ072的代谢演化期间未检 测到甲酸和乳酸。图4A(5%w/v葡萄糖）和图4B(10%w/v葡萄糖），KJ012到KJ017;图 4C(5%w/v葡萄糖）和图 4D(10%w/v葡萄糖），KJ032 到KJ060 ;图 4E，10%葡萄糖，KJ070 到KJ071 ;图4F，10%葡萄糖，KJ072到KJ073。所有图的符号：，琥珀酸；□，甲酸；A，乙 酸；▲，苹果酸；?，乳酸；和▼，丙酮酸。
[0021] 图5.总结大肠杆菌C的遗传改造和代谢演化中步骤的简图，所述大肠杆菌C作为 琥珀酸和苹果酸生产的生物催化剂。该过程代表了 261次连续传代，其提供了超过2000个 基于生长选择的世代。从每种方案的最终培养物中分离克隆并指定菌株名称，显示于表3 中的圆括号内。
[0022] 图6.葡萄糖的发酵和相关途径。中枢代谢指出在被改造用于生产琥珀酸的构 建体中缺失的基因。实线箭头表述中枢发酵途径。虚线箭头表示丙酮酸氧化成为乙酸 (P〇xB)的微需氧途径。点线箭头显示在需氧代谢期间正常发挥作用的途径、丙酮酸脱氢 酶（pdh)和乙醛酸支路（aceAB)。带框的十字代表用于构建KJ012和KJ017的三个初始基 因缺失（ldhA，adhE，ackA)。简单的十字标记了构建KJ017衍生物期间缺失的额外基因： KJ032(ldhA，adhE，ackA，focA，pflB)，和KJ070(ldhA，adhE，ackA，focA，pflB，mgsA)，和 KJ072 (ldhA，adhE，ackA，focA，pflB，mgsA，poxB)。基因和酶：ldhA，乳酸脱氛酶；focA，甲酸 转运蛋白；pflB，丙酮酸-甲酸裂解酶；pta，磷酸乙酰基转移酶；ackA，乙酸激酶；adhE，醇 脱氢酶；ppc，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脱氢酶复合物；gltA，柠檬酸合酶;mdh， 苹果酸脱氢酶；fumA，fumB和fumC，延胡索酸酶异构酶；frdABCD，延胡索酸还原酶；fdh，甲 酸脱氢酶；mgsA，甲基乙二醛合酶；gloAB，乙二醛酶I和II;poxB，丙酮酸氧化酶；aceA，异 朽1檬酸裂合酶；aceB，苹果酸合酶；acnAB，顺乌头酸酶；和acs，乙酰~CoA合成酶。
[0023] 图7A-7C.通过大肠杆菌C的衍生物在矿物盐培养基（10 %葡萄糖）中生产琥珀 酸和苹果酸。图7A显示AM1培养基中由KJ060生产琥珀酸。图7B显示AM1培养基中由 KJ073生产琥珀酸。图7C显示在NBS培养基中由KJ071生产苹果酸。发酵以33mgDCWr1 的水平接种。所有图的符号：〇，葡萄糖；鲁，琥珀酸；，苹果酸；A，细胞量。
[0024] 图8.pL0I4162的构建。与pEL04和pL0I4152相关联的短实线箭头表示用于DNA 扩增的引物。
[0025] 图9.KJ073中的琥珀酸生产途径。编码该研宄中涉及琥珀酸生产的主要羧化 酶一一磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因以反转形式显示。实线箭头指出期望在葡萄糖的 厌氧发酵期间有功能的反应。实线十字指出缺失的基因。带框的十字代表用于构建琥珀酸 生产初始菌株KJ017的关键缺失（ldhA，adhE，ackA)。虚线表示PoxB将丙酮酸氧化为乙酸， 这是通常仅在微需氧条件下有功能的过程。点线表示主要与需氧代谢相关的反应。基因 和酶：ldhA，乳酸脱氢酶；pflB，丙酮酸-甲酸裂解酶；focA，甲酸转运蛋白；pta，磷酸乙酰 基转移酶；ackA，乙酸激酶；ad