一种羽毛降解细菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于降解羽毛的生物材料及应用领域，特别涉及一种羽毛降解细菌及其应 用。
【背景技术】
[0002] 羽毛主要成分为角蛋白（keratin)，它是一种不溶性的纤维状动物蛋白质，是外胚 层细胞的结构蛋白，大量以脊椎动物的皮肤、毛发、羽毛、羽茎、蹄、角、爪等结构蛋白存在于 自然界中。我国每年羽毛量在100万吨以上，禽类所产羽毛除了少部分作为纺织原料等外， 大部分作为废弃物直接丢弃处理。但羽毛含有许多有用成分，羽毛的粗蛋白含量约在80% 以上，含有丰富的赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、甘氨酸、胱氨酸等10多种动物 所必需的氨基酸，还含有常量元素、微量元素、维生素以及一些未知生长因子。羽毛粉中也 含有较高的能量和较多的B族维生素。因此羽毛废弃物经过适当的处理具有十分广泛的用 途。产角蛋白酶的微生物构成的生物炼制较之传统水解法具有诸如反应条件温和、产物回 收率高、环境友好、可节省能源等众多优点。不仅使固体废弃物得到有效利用，保护了人类 赖以生存的生态环境，还可将其生物降解为多肽及氨基酸等高附加值产品，更加符合循环 经济的理念和建立节约型社会的战略要求。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种羽毛降解细菌及其应用，本发明分离出一 株生产直接降解羽毛的细菌菌株，并利用该菌株发酵处理羽毛废弃物，反应条件温和，需要 成本低，对环境友好。
[0004] 本发明的一种羽毛降解细菌，其特征在于：该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为 8&(^11118 81*衍1181098-4，保藏号为061〇：吣.9844，其165冰隱序列如5￡0 10勵.1所 不〇
[0005] 本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis) 1098-4,于2014年10月27日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 9844。
[0006] 本发明在土壤中分离到一株高效降解羽毛微生物，根据BLAST聚类分析及形态学 鉴定结果，将该菌株定命名为枯草芽胞杆菌1098-4,该菌经发明人检测在合适条件下可完 全降解羽毛。
[0007] 本发明提供的枯草芽胞杆菌1098-4的特征如下：
[0008] 该菌菌落表面干躁，边缘不整齐；呈乳白色不透明；呼吸类型为好氧呼吸，在有氧 条件下生长良好，革兰氏染色呈阳性，形态观察菌体圆柱形杆状，菌体长度为1. 717ym。测 定菌株的16SrRNA部分序列，进行系统发育学分析（菌株的16SrRNA序列见表1)。
[0009] 本发明的一种羽毛降解细菌的应用，应用于降解羽毛，具体工艺为：将枯草芽孢 杆菌Bacillussubtilis1098-4接种于发酵培养基，37°C，通气量3-5L/min，搅拌速度为 120-600rpm，培养24-72小时，终止发酵，过滤或离心，得到羽毛降解液。
[0010] 所述发酵培养基为：每lOOmL培养基中含葡萄糖lg、羽毛3. 0g、NaCl0? 0294g、磷 酸氢二钠0. 4g、磷酸二氢钾0. 03g，100ml去离子水，pH7. 4-7. 8。
[0011] 培养24-72h后，测得角蛋白酶的最高酶活达30. 3U/mL。
[0012] 有益效果
[0013] 本发明分离出一株生产直接降解羽毛的细菌菌株，并利用该菌株发酵处理羽毛废 弃物，反应条件温和，需要成本低，对环境友好。
【附图说明】
[0014] 图11098-4菌株形态图；
[0015] 图21098-4菌株16SrRNA序列系统发育树。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0017] 实施例1
[0018] 新菌株枯草芽孢杆菌1098-4(Bacillussubtilis1098-4,已保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是：CGMCCNo. 9844。
[0019] 菌种来源：本菌种来源于禽类养殖场土壤中，具体分离方法如下：
[0020] (1)富集取羽毛堆积地腐土壤lg于富集培养基（牛肉膏0. 5g、蛋白胨lg、氯化钠 0. 5g，pH7. 0~7. 6)中，于28°C、120转/min恒温培养48h;再取其培养液2mL转入富集培 养基2中，28°C，120转/min进一步富集培养48h;
[0021] (2)初筛取终富集液100yL涂布于磷酸消解蛋白培养基平板，筛选出生长的单菌 落；
[0022] (3)复筛将初筛得到的菌种分别点接于磷酸消解蛋白培养基平板和羽毛粉平板 培养基平板，于30°C下恒温培养48h，对照观察两平板上的菌种生长，选定有效菌株；再将 有效菌株涂布于磷酸消解蛋白培养基平板，重复几次做进一步的分离纯化，最后获得菌株 1098-4;所述有效菌株为在羽毛粉平板培养基上能与磷酸消解蛋白培养基平板生长一样良 好的菌株；菌种鉴定：（1)菌落形态观察将菌株1098-4在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线分 离，于33°C下恒温培养48h，观察菌落的形状、颜色、表面质地、菌落边缘等并记录；
[0023] (2)菌体形态观察将菌株1098-4制片，进行革兰式染色后，用带拍摄装置的光学 显微镜观察菌体的形状、大小、及其特殊构造，并拍摄菌体染色照片；
[0024] (4)分子鉴定
[0025] ①菌株DNA的提取方法
[0026]A、取lml细菌过夜培养液移至1. 5mL的Eppendorf管中，5000rpm离心10分钟，去 上清液；
[0027]B、立即加入600yL预热的提取缓冲液，混匀后，65°C温浴lh;
[0028]C、冰浴冷却（5分钟），加入600yL酚/氯仿（1:1)溶液，颠倒混匀后，静置lOmin， 然后 12000rpm离心 6min;
[0029]D、上清转移至另一个Eppendorf管中，加入等体积氯仿，静置5min，12000rpm离心 5min;E、取上清液，加入等体积异丙醇，沉淀DNA;
[0030] F、用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于500yLTE或重蒸水 中，-20 °C保存；如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA沉淀；
[0031] ②16SrRNA的基因扩增
[0032]A、PCR反应引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/AAGGAGGTGATCCAGCCGC
[0033] B、在冰上建立PCR反应体系：
【主权项】
1. 一种羽毛降解细菌，其特征在于：该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis 1098-4,保藏号为 CGMCC No. 9844,其 16S rRNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -种如权利要求1所述的羽毛降解细菌的应用，其特征在于：应用于降解羽毛，具 体工艺为：将枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis1098-4接种于发酵培养基，37°C，通气量 3-5L/min，搅拌速度为120-600rpm，培养24-72小时，终止发酵，过滤或离心，得到羽毛降解 液。
3. 根据权利要求2所述的一种羽毛降解细菌的应用，其特征在于：所述发酵培养基为： 每IOOmL培养基中含葡萄糖lg、羽毛3.0g、NaCl0.0294g、磷酸氢二钠0.4g、磷酸二氢钾 0? 03g，pH7. 4-7. 8。
4. 根据权利要求2所述的一种羽毛降解细菌的应用，其特征在于：培养24-72h后，测 得角蛋白酶的最高酶活达30. 3U/mL。
【专利摘要】本发明涉及一种羽毛降解细菌及其应用，该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis1098-4，保藏号为CGMCC No.9844，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。应用于降解羽毛。本发明的菌株作用条件温和，所产蛋白酶活性高，能够在72-96小时内完全降解羽毛，产生可溶性蛋白及多种生物所需要氨基酸。CGMCC No.984420141027
【IPC分类】C12P21-06, C12N1-20, C12R1-125
【公开号】CN104694440
【申请号】CN201510131239
【发明人】曹张军, 朱茜, 王娟, 杨雪霞, 杨光
【申请人】东华大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月24日