一株具有三氮唑降解功能的申氏杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株降解三氮唑的细菌及其在废水生物处理和环境污染修复中的应用。
【背景技术】
[0002]三氮唑(主要是1，2，4_三氮唑)广泛应用于医药、农药、化工等多行业，是一种典型的难降解含氮杂环化合物。三氮唑因其杂环结构而具有较强的水溶性，很容易转移到土壤和地下水中，因而在土壤和地下水中普遍存在。由于三氮唑的生物毒性、致畸变和致癌特性，三氮唑污染对人类的健康和生态环境造成了巨大的潜在危害。因此，含三氮唑的废水如不经过处理而直接排放，会对环境造成严重污染。
[0003]目前针对三氮唑废水的处理方法主要有物理法、化学法、生物法等。其中物理手段如吸附法、萃取法等普遍存在二次污染的问题，需要辅以其他工艺，才可达到理想的去除率；化学法中高级氧化法及电化学法耗能高，成本也高，且部分中间产物的毒性更大。因此，对处理效果好、处理成本小、无二次污染的三氮唑污染废水的处理技术和工艺的探讨，具有理论和实际意义。
[0004]微生物处理法与物理、化学方法相比，具有经济、高效的优点，更重要的是可以实现污染的无害化治理。生物法无二次污染、处理量大，是目前应用最广的废水处理技术。但由于三氮唑结构稳定，可生化降解程度不高，普通的生物处理无法作用或效率低下。因此，对三氮唑降解效率高、降解效果好的微生物的驯化、筛选和应用，是解决三氮唑废水污染的有效途径。然而对于三氮唑这种杂环化合物的生物降解国内外均未见文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对目前三氮唑降解菌株的缺乏，提供一株可降解三氮唑的菌株 Shinella sp.NJUST26。
[0006]本发明的另一目的在于提供一株可高效降解三氮唑的新型菌株Shinellasp.NJUST26的选育方法。
[0007]本发明还有一个目的是提供Shinella sp.NJUST26在含三氮唑废水处理领域的应用。
[0008]实现本发明目的技术解决方案是:一株具有三氮唑降解功能的申氏杆菌，从金坛市丰登环境技术服务有限公司长期受到三氮唑污染的排污口土样中分离筛选得到三氮唑降解菌株 NJUST26，经鉴定为 Shinella sp.，命名为 Shinella sp.NJUST26，GenBank 登陆号为KP890249，菌株已于2015年3月4日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M 2015081。该菌株为国内外第一株可用于三氮唑啶废水处理的细菌。
[0009]一株可高效降解三氮唑的新型菌株Shinella sp.NJUST26的选育方法，包括以下步骤:
[0010]⑴菌株的分离
[0011]从金坛市丰登环境技术服务有限公司长期受到三氮唑污染的排污口挖取土样，接种至以三氮唑为唯一碳源和氮源的的液体无机盐培养基，摇床培养，实现三氮唑降解菌的富集培养。连续转接后，稀释涂布于以三氮唑为唯一碳源和氮源的无机盐固体培养基平板上，放入培养箱进行培养。挑取在菌落特征上有明显差异的菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化，得到单一菌株，并进行斜面保存。
[0012]⑵菌株的筛选
[0013]挑取分离所得到的单菌落，分别接种于以三氮唑为唯一碳源和氮源的无机盐液体培养基中，摇床培养。采用高效液相色谱测定培养基中三氮唑浓度变化，如果培养基中三氮唑浓度显著降低，即可判断三氮唑发生了降解。比较分离得到的单菌落的降解性能，选取降解性能最优异的菌株作后续的鉴定。
[0014]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0015]本发明所提供的Shinella sp.NJUST26，可以以三氮唑为唯一碳源、氮源进行生长。本发明直接采用以三氮唑为唯一碳源和氮源的培养基进行三氮唑降解菌的富集，并采用以三氮唑为唯一碳源、氮源的筛选培养基进行分离，确保了筛选得到的降解菌的优异降解性能。
[0016]三氮唑废水的应用研宄表明，筛选得到的Shinella sp.NJUST26，可在15d左右实现浓度约为320mg/L的三氮唑废水的处理，三氮唑的降解率达到90%以上。在三氮唑浓度为0-320mg/L的范围内，Shinella sp.NJUST26可正常生长并实现吡啶的完全降解。在pH为5.0-8.0的范围内，Shinella sp.NJUST26可实现三氮唑的完全降解。低浓度易降解碳源的加入可对三氮唑降解起促进作用。
【附图说明】
[0017]图1是本发明废水中三氮唑浓度对菌株Shinella sp.NJUST26降解三氮唑性能的影响。
[0018]图2是本发明废水pH对三氮唑降解性能的影响。
[0019]图3是本发明废水中易降解碳源的存在对三氮唑降解性能的影响。
[0020]图4为本发明菌株Shinella sp.NJUST26的16SrDNA序列表。
【具体实施方式】
[0021 ] 下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0022]实施例1:三氮唑降解菌Shinella sp.NJUST26的筛选分离及其对三氮唑的降解性能
[0023]⑴菌株的分离
[0024]从金坛市丰登环境技术服务有限公司长期受到三氮唑污染的排污口挖取土样，取1g 土样加入10mL三氮唑浓度为100mg/L的液体无机盐培养基(MSM)，装入250mL三角瓶中，30°C条件下以180转/分的转速摇床培养，3h后取出三角瓶静置，待泥水分离后取2mL上清液，转接入50mL三氮唑浓度为100mg/L的液体无机盐培养基(MSM)中，装入10mL三角瓶中，30°C条件下以180转/分的转速摇床培养，实现三氮唑降解菌的富集培养。15天后，2mL液体培养基转接入50mL新鲜培养基，并摇床培养。经过连续3次转接后，用无菌蒸馏水将液体培养基稀释14-1O8倍，涂布于三氮唑浓度为100mg/L、以三氮唑为唯一碳源和氮源的无机盐固体培养基平板上，放入30°C培养箱进行培养。一周后挑取在菌落特征上有明显差异的菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化，连续纯化三次后，得到单一菌株，并进行斜面保存。
[0025]无机盐培养基(MSM)的组成如下-Na2HPO4.12H20 (3.057g/L)，KH2PO4 (0.760g/L)，MgSO4.7H20 (0.2g/L)，CaCl2 (0.05g/L)，微量元素溶液 SL-4 (lOmL/L)。微量元素 SL-4组成:EDTA(0.5g/L)，FeSO4.7H20(0.2g/L)，微量元素 SL-6 (lOOmL/L)。微量元素 SL-6 组成:ZnS04.7H20 (0.0lg/L)，MnCl2.4H20 (0.03g/L)，H3BO4 (0.3g/L)，CoCl2.6H20 (0.2g/L)，CuCl2.2H20(0.0lg/L)，NiCl2.6H20(0.02g/L)，Na2MoO4.2H20(0.03g/L)。
[0026]⑵菌株的筛选
[0027]挑取分离所得到的单菌落，分别接种于三氮唑浓度为100mg/L、以三氮唑为唯一碳源和氮源的MSM中，摇床培养15d。用高效液相色谱法测定培养基中三氮唑浓度变化，如果培养基中三氮唑浓度显著降低，即可表明三氮唑发生了降解。在分离得到的单菌落中，命名为NJUST26的菌株降解性能最为优异，在15d的培养期内，三氮唑完全降解，因此选取该菌株作后续的鉴定。
[0028]⑶菌株的鉴定
[0029]对细菌进行形态学、生理生化测